028 – Analisi delle feci

Un esame delle feci è uno degli esami più economici e informativi in gastroenterologia, poiché ciò che lascia il corpo non digerito dice esattamente dove la digestione o l'assorbimento sono falliti. I grassi nelle feci indicano un pancreas che non produce abbastanza lipasi o una mucosa intestinale danneggiata; le proteine non digerite indicano la stessa cosa; e gli zuccheri che avrebbero dovuto essere scissi e assorbiti nell'intestino tenue compaiono nelle feci quando manca un enzima come la lattasi. Nessuno di questi risultati richiede apparecchiature sofisticate per essere rilevato. Ciascuna classe di nutrienti ha un test colorimetrico in uso da ben oltre un secolo: la soluzione di Fehling produce un precipitato rosso mattone in presenza di uno zucchero riducente, lo iodio diventa blu-nero con l'amido, il Sudan IV colora di rosso le goccioline lipidiche e il rame in soluzione alcalina diventa viola con i legami peptidici. In questo laboratorio eseguirete tutti e quattro i test su due campioni affiancati — il campione N proveniente da una persona la cui digestione è normale e il campione P proveniente da un paziente — e userete la differenza tra le due colonne di risultati per stabilire quali classi di nutrienti il paziente non riesce a digerire. Tre dei test vengono eseguiti nei pozzetti di una micropiastra; il test di Fehling richiede calore, quindi viene eseguito in provette fissate in un bagno maria su una piastra riscaldante.

Obiettivi Educativi

Familiarizzazione con l'ambiente di laboratorio

• Identifica la piastra per microtitolazione, la testiera per provette, i contagocce, la pipetta, la piastra riscaldante con il suo agitatore magnetico, il termometro digitale e il contenitore di recupero, e indica il ruolo di ciascuno.
• Lavora con due campioni alla volta senza contaminarli reciprocamente e pulisci la bacchetta di vetro tra un'agitazione e l'altra.

Trattamento di materiale biologico

• Trattare un campione di feci come potenzialmente infettivo: guanti per tutta la durata, nessun trapianto per bocca, il reagente in eccesso nel contenitore di recupero anziché nel lavandino.
• Le piastre multipozzetto utilizzate per materiale biologico vengono smaltite anziché lavate e riutilizzate principalmente per motivi di sicurezza, prevenzione della contaminazione e praticità: 1. **Rischio di contaminazione crociata:** I campioni biologici (come cellule, batteri, virus o DNA) possono aderire tenacemente alle pareti dei pozzetti. Anche dopo un lavaggio accurato, potrebbero rimanere residui microscopici che comprometterebbero i risultati degli esperimenti successivi, falsificando i dati. 2. **Rischio biologico e sicurezza:** Molti materiali biologici possono essere patogeni o pericolosi per la salute umana e l'ambiente. Il processo di lavaggio richiederebbe la manipolazione di rifiuti potenzialmente infetti, aumentando il rischio di esposizione per gli operatori di laboratorio. 3. **Integrità del materiale:** Le piastre sono solitamente realizzate in plastica monouso (come il polistirene). I solventi aggressivi o i trattamenti termici necessari per sterilizzare e rimuovere completamente i residui biologici potrebbero danneggiare la plastica, alterandone le proprietà chimiche o ottiche (fondamentali per le analisi strumentali, ad esempio quelle spettrofotometriche). 4. **Rapporto costo-efficacia:** Le piastre da laboratorio sono prodotte in serie a costi molto bassi. Il tempo, l'energia, i reagenti e la manodopera necessari per validare un processo di pulizia e sterilizzazione sicuro supererebbero di gran lunga il costo d'acquisto di una nuova piastra.

Gestione dei campioni e disposizione di un test

• Misurare 10 mL di ciascun campione nella provetta etichettata corrispondente e metterne alcune gocce nei tre pozzetti che recano la stessa etichetta.
• Preparare una piastra in modo che ogni pozzetto possa essere identificato successivamente e registrare la disposizione prima di aggiungere qualsiasi reagente.

Funzionamento di un bagno d'acqua riscaldato

• Riempire e preparare un bagno d'acqua agitato, portarlo alla temperatura impostata e fissare con un morsetto una provetta in modo che il suo contenuto — e non il bagno — raggiunga la temperatura necessaria alla reazione.
• Verificare la temperatura all'interno del tubo con il termometro digitale anziché affidarsi all'impostazione della piastra riscaldante e spiegare la differenza tra le due letture.

Utilizzo dei quattro test qualitativi sui nutrienti

• Indica, prima di aggiungere qualsiasi altra cosa, cosa rileva ciascun reagente e quale colore costituisce un risultato positivo.
• Aggiungere i reagenti di Biuret nell'ordine corretto — prima l'idrossido di sodio, poi il solfato di rame — e spiegare perché l'alcali deve essere presente prima del rame.

Lettura, registrazione e interpretazione dei risultati

• Registrare il colore di tutti gli otto risultati come osservato, e solo allora decidere se positivo o negativo rispetto ai criteri indicati.
• Trarre una conclusione sul paziente dal modello dei quattro test e dire cosa tale modello non stabilisce.

Protocollo

Preparazione dei campioni di feci

1. Con la pipetta, misurare 10 mL del campione di feci normale.
2. Versare il campione da 10 mL nella provetta N.
3. Usando un contagocce, mettere da 5 a 10 gocce del campione di feci normale in ciascuno dei 3 pozzetti identificati come segue:

• Pozzetto N (Lugol)
• Pozzetto N (Sudan IV)
• Pozzetto N (Biuret)

4. Ripetere i passaggi da 1 a 3 per il campione di feci del paziente (P) riempiendo la provetta e i 3 pozzetti corrispondenti.

Identificazione dei carboidrati semplici

1. Riempire un becher da 500 mL con 400 mL di acqua di rubinetto.
2. Inserisci l'agitatore magnetico nel becher.
3. Posizionare il becher sulla piastra riscaldante e impostarla a 75°C. Attendere che la temperatura venga raggiunta.
4. Attivare l'agitatore magnetico (pulsante a sinistra).
5. Utilizzando la pipetta, aggiungere 10 mL di Fehling A nel provetta N.
6. Usando il contagocce, aggiungere 10 ml di Fehling B nella provetta N.
7. Mescolare il contenuto della provetta N con un movimento circolare.
8. Posizionare un morsetto universale sul supporto sinistro, sopra il becher da 500 mL preparato nel passaggio 1.
9. Fissare la provetta N al morsetto universale sopra il centro del becher.
10. Utilizzando il termometro digitale, verificare che nel provettino venga raggiunta una temperatura superiore a 70°C.
11. Prendere la provetta N e rimetterla al suo posto originale sul portaprovette.
12. Mescola il contenuto della provetta agitando per alcuni secondi con la bacchetta di vetro.
13. Usando la pipetta, aggiungere 10 mL di Fehling A nella provetta P.
14. Usando la pipetta, aggiungere 10 mL di Fehling B nella provetta P.
15. Mescola il contenuto della provetta P con un movimento circolare.
16. Fissare la provetta P al morsetto universale sopra il centro del becher.
17. Utilizzando il termometro digitale, verificare che nel provettino venga raggiunta una temperatura superiore a 70°C.
18. Prendere la provetta P e rimetterla al suo posto originale sul portaprovette.
19. Mescola il contenuto della provetta agitando per alcuni secondi con la bacchetta di vetro.
20. Abbassare la temperatura della piastra riscaldante a 15°C.
21. Spegni l'agitatore magnetico.

Le osservazioni della reazione di controllo si trovano nella tabella dei risultati.

Identificazione dei carboidrati complessi

1. Usando il contagocce, aggiungere da 5 a 10 gocce di Lugol in ciascuno dei 2 pozzetti identificati come segue:

• Pozzetto N (Lugol)
• Pozzetto P (Lugol)

2. Svuotare l'eccesso dal contagocce nel contenitore di recupero.
3. Mescolare il contenuto con la bacchetta di vetro. Attenzione: assicurarsi di pulire bene la bacchetta di vetro dopo ogni miscelazione per evitare di mescolare le sostanze!

Identificazione dei lipidi

1. Usando il contagocce, aggiungere da 5 a 10 gocce di Sudan IV in ciascuno dei 2 pozzetti identificati come segue:

• Pozzetto N (Sudan IV)
• Pozzetto P (Sudan IV)

2. Svuotare l'eccesso dal contagocce nel contenitore di recupero.
3. Mescolare i contenuti con la bacchetta di vetro.

Identificazione delle proteine

1. Usando il contagocce, mettere 1 goccia di idrossido di sodio (NaOH) in ciascuno dei 2 pozzetti identificati come segue:

• Pozzetto N (Biuret)
• Pozzetto P (Biuret)

2. Svuotare l'eccesso dal contagocce nel contenitore di recupero.
3. Usare la pipetta per prelevare 1 pipetta piena (10 mL) di solfato di rame (CuSO4).
4. Usando la pipetta, erogare 1 mL di solfato di rame (CuSO4) nei pozzetti N e P (Biuret).
5. Svuotare l'eccesso dalla pipetta nel contenitore di recupero.
6. Mescolare i contenuti con la bacchetta di vetro.

Le osservazioni si trovano nella tabella dei risultati.

• Un risultato positivo per la presenza di carboidrati semplici produrrà un precipitato rosso mattone (Cu2O) nella provetta (reazione di Fehling).
• Un risultato positivo per la presenza di carboidrati complessi comporterà una colorazione viola (complesso iodio-amido) nel pozzetto (test di Lugol).
• Un risultato positivo per la presenza di lipidi produrrà una colorazione rossa (complesso Sudan IV – lipidi) nel pozzetto (test Sudan IV).
• Un risultato positivo per la presenza di proteine si tradurrà in una colorazione viola (complesso del biureto) nel pozzetto (test del biureto).

Risultati Previsti

Ognuno dei quattro test risponde a una domanda e ciascuno ha un colore positivo che deve essere noto prima che il reagente venga inserito. La prima tabella stabilisce cosa si sta cercando e cosa costituisce un risultato.

La seconda tabella fornisce gli otto risultati con la chiamata che ciascuno supporta.

La conclusione supportata dai risultati. Il campione N dà quattro negativi: nulla di rilevabile è sfuggito alla digestione, che è il risultato atteso per un intestino sano. Il campione P dà due positivi evidenti, zuccheri riducenti e proteine, sugli stessi test che sono risultati negativi per N e con gli stessi reagenti provenienti dalle stesse bottiglie, quindi la differenza è una proprietà del campione e non del metodo. Proteine non digerite e zuccheri non assorbiti che arrivano insieme nelle feci indicano un fallimento generale della digestione nell'intestino tenue piuttosto che l'assenza di un singolo enzima specifico – un'insufficienza pancreatica, in cui mancano contemporaneamente diversi enzimi digestivi, o un danno al rivestimento intestinale che riduce il tempo e la superficie disponibili per l'assorbimento. Ciò che il risultato non fa è dare un nome alla malattia; indica quali processi sono falliti, e un clinico lo farebbe seguire da test che misurano anziché rilevare.

Perché il pozzetto positivo mostra sia un colore che un precipitato. I due segnali nel pozzetto P sono due composti diversi dello stesso rame. La tinta malva del liquido è il complesso del biureto stesso: nella soluzione alcalina creata dall'idrossido di sodio, il Cu²⁺ è chelato dagli atomi di azoto dei legami peptidici adiacenti, e questo complesso rame-peptide è solubile, quindi colora l'intero pozzetto in modo uniforme anziché depositarsi. Il precipitato è idrossido di rame(II), formato ovunque uno ione Cu²⁺ incontra gli ioni idrossido prima di incontrare un legame peptidico: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un solido azzurro pallido. L'idrossido di rame(II) è tra i più insolubili dei comuni idrossidi, quindi una volta che i legami peptidici presenti hanno preso la loro parte di rame, l'eccesso lascia la soluzione come questo solido. Le due osservazioni sono quindi un'unica storia raccontata due volte: la proteina rivendica una parte del rame come complesso solubile color malva, e l'idrossido rivendica la parte restante come solido.

Perché la soluzione di Fehling richiede calore e cos'è il precipitato rosso. Il reattivo di Fehling è costituito da rame(II) tenuto in soluzione da tartrato in forte ambiente alcali, motivo per cui viene fornito in due flaconi e miscelato solo al momento dell'uso. Uno zucchero riducente possiede un gruppo aldeidico libero e, in soluzione alcalina calda, tale gruppo viene ossidato a carbossilato mentre il rame(II) viene ridotto a rame(I), che è insolubile e precipita come ossido di rame(I) di colore rosso mattone: RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂La reazione è decisamente troppo lenta per poter essere osservata a temperatura ambiente, ed è questo il motivo principale del bagno maria: la piastra riscaldante è impostata a 75 °C e il protocollo richiede più di 70 °C dentro il tubo, perché è lì che avviene la reazione. Si noti cosa il test copre e cosa non copre. Glucosio, fruttosio, maltosio e lattosio riducono tutti il reagente; il saccarosio no, perché entrambi i suoi carboni anomerici sono bloccati nel legame glicosidico, quindi un campione di feci ricco di saccarosio darebbe un risultato negativo. Il test indica che è presente uno zucchero riducente, ma mai quale.

Perché lo iodio diventa blu-nero con l'amido. La soluzione di Lugol contiene iodio sciolto in ioduro di potassio come ione triioduro, I₃⁻. L'amilocca, la frazione non ramificata dell'amido, si avvolge in un'elica il cui interno è appena abbastanza largo da contenere una catena di ioni triioduro, e il complesso di trasferimento di carica risultante assorbe attraverso lo spettro visibile per dare il familiare blu-nero. Il colore è quindi una testimonianza del forma del polisaccaride, e non semplicemente sulla sua presenza: l'amilopectina e il glicogeno, che sono fortemente ramificati e non possono formare lunghe eliche, danno invece un colore rosso-marrone, e le destrine — amido parzialmente scisso — danno una tonalità intermedia. Per questo motivo un pozzetto rosso-marrone deve essere letto con attenzione. È l'aspetto che il reagente assume da solo, quindi viene valutato come negativo, ma uno studente dovrebbe sapere che l'amido parzialmente digerito può anch'esso risultare rosso-marrone e che il test perde sensibilità proprio dove la biologia si fa interessante.

Perché il Sudan IV e il Biureto funzionano. Il Sudan IV è un lipercromo: un colorante che non subisce alcuna reazione chimica, ma è molte volte più solubile nei grassi che nell'acqua, perciò si ripartisce in qualsiasi gocciolina lipidica presente e la colora di rosso-arancio mentre l'acqua circostante rimane quasi incolore. Un risultato positivo è quindi goccioline rosse discrete, non un cambiamento di colore uniforme, e leggerlo è una questione di ricerca della struttura piuttosto che della tonalità. La reazione del biureto è il test del tipo opposto: è una vera reazione di coordinazione, in cui il Cu²⁺ in soluzione fortemente alcalina viene chelato dagli atomi di azoto di almeno due legami peptidici adiacenti per dare un complesso viola con un massimo di assorbanza vicino a 540 nm. Ne conseguono due conseguenze. Gli amminoacidi liberi e i dipeptidi non reagiscono, quindi il test rileva i legami peptidici anziché l'azoto; e poiché l'intensità del viola è proporzionale alla concentrazione dei legami peptidici, questo è l'unico dei quattro test che si trasforma direttamente in un dosaggio quantitativo con uno spettrofotometro e una curva di calibrazione. L'ordine di aggiunta è importante: l'alcali deve essere presente prima del rame, altrimenti il rame precipita come idrossido invece di formare il complesso.

Riepilogo del compito per intervallo di voti

Classe 9-10

• Concentrazione: le quattro classi di nutrienti, il reagente che rivela ciascuna di esse e la disciplina di registrare un colore prima di interpretarlo.
• Attività: disponi ed etichetta la piastra; esegui i quattro test su entrambi i campioni; annota il colore osservato di tutti e otto i risultati in una tabella simile alla Tabella 2 prima di prendere qualsiasi decisione; assegna a ciascun risultato un punteggio positivo o negativo in base ai criteri del protocollo; indica in una sola frase cosa il campione P non riesce a digerire e nomina le precauzioni di sicurezza applicabili alla manipolazione di un campione di feci.

Undicesimo anno

• Concentrazione: la chimica dietro ogni colore e le condizioni richieste da ciascuna reazione.
• Attività: scrivere l'equazione di Fehling e identificare che cosa si ossida e che cosa si riduce; spiegare perché la provetta deve superare i 70 °C e perché la lettura all'interno della provetta differisce dal valore impostato sulla piastra riscaldante; spiegare perché il saccarosio dà un risultato di Fehling negativo mentre il lattosio ne dà uno positivo; spiegare il colore blu-nero in termini di elica dell'amilosio e triioduro; spiegare perché il Sudan IV non ha bisogno di alcuna reazione per funzionare; e giustificare l'ordine in cui vengono aggiunti i due reattivi del biureto.

12ª classe / Livello universitario

• Concentrazione: il passaggio da uno screening qualitativo a una misurazione diagnostica e l'interpretazione di un insieme di risultati.
• Attività: descrivere come la reazione del biureto viene trasformata in un dosaggio quantitativo delle proteine, includendo la curva di taratura, la lunghezza d'onda utilizzata e il motivo per cui l'assorbanza è proporzionale alla concentrazione di legami peptidici; proporre i controlli positivi e negativi che mancano a questo protocollo e indicare che cosa ciascuno permetterebbe di escludere; spiegare perché la comparsa simultanea di positivi al Fehling e al biureto indica un'insufficienza digestiva generale piuttosto che la mancanza di un singolo enzima, ed elencare gli esami ulteriori che distinguerebbero un'insufficienza pancreatica da un danno della mucosa; valutare la sensibilità e la specificità di ciascuno dei quattro test come screening; e spiegare perché un risultato negativo non può escludere una patologia.

Materiale essenziale di laboratorio

Strumenti

• Provette, 50 mL (2, etichettate N e P)
• Portaprovette
• Contagocce, 1 mL (8)
• Pipetta
• Becher (500 mL, riempito con 400 mL di acqua di rubinetto)
• Micropiastra (piastra a pozzetti, 6 pozzetti utilizzati)
• Piastra riscaldante, impostata a 75 °C
• Agitatore magnetico e ancoretta magnetica
• Termometro digitale
• Bacchette di vetro
• Supporto e morsetto universale
• Carta da cucina
• Cestino

Prodotti

• Campione di feci normale (N)
• Campione di feci del paziente
• Reagente di Fehling, soluzioni A e B (10 mL di ciascuna per provetta)
• Soluzione di iodio di Lugol 2 %
• Soluzione di Sudan IV
• Reattivo di Biureto — idrossido di sodio, NaOH 2,5 M
• Reagente di Biureto — solfato di rame, CuSO₄ 0,0094 M
• Acqua di rubinetto (400 mL per il bagno)