028 - Analyse des selles

L'examen des selles est l'un des examens les moins coûteux et les plus instructifs en gastro-entérologie, car ce qui quitte le corps sous forme non digérée indique précisément où la digestion ou l'absorption a échoué. La présence de graisses dans les fèces indique un pancréas qui ne produit pas assez de lipase ou une muqueuse intestinale endommagée ; les protéines non digérées indiquent la même chose ; et les sucres qui auraient dû être dégradés et absorbés dans l'intestin grêle se retrouvent dans les selles lorsqu'une enzyme telle que la lactase fait défaut. Aucun de ces résultats ne nécessite d'équipement sophistiqué pour être détecté. Chaque classe de nutriments possède un test colorimétrique utilisé depuis bien plus d'un siècle : la solution de Fehling donne un précipité rouge brique en présence d'un sucre réducteur, l'iode vire au bleu-noir en présence d'amidon, le Sudan IV colore les gouttelettes lipidiques en rouge, et le cuivre en milieu alcalin vire au violet en présence de liaisons peptidiques. Dans ce laboratoire, vous réaliserez ces quatre tests sur deux échantillons côte à côte — l'échantillon N provenant d'une personne dont la digestion est normale, et l'échantillon P provenant d'un patient — et vous utiliserez la différence entre les deux séries de résultats pour déterminer quelles classes de nutriments le patient ne parvient pas à digérer. Trois des tests sont effectués dans les puits d'une microplaque ; le test de Fehling nécessite de la chaleur, il est donc réalisé dans des tubes à essai fixés dans un bain-marie sur une plaque chauffante.

Objectifs Éducatifs

Familiarisation avec l'environnement du laboratoire

• Identifiez la microplaque, le portoir à tubes à essai, les compte-gouttes, la pipette, la plaque chauffante avec son agitateur magnétique, le thermomètre numérique et le bac de récupération, et indiquez le rôle de chacun.
• Travaillez avec deux échantillons à la fois sans les contaminer mutuellement, et nettoyez la tige de verre entre chaque agitation.

Manipulation de matériel biologique

• Considérer un échantillon de selles comme potentiellement infectieux : porter des gants en tout temps, aucun transfert par la bouche, jeter l'excédent de réactif dans le bac de récupération plutôt que dans l'évier.
• Une plaque multipuits ayant contenu du matériel biologique est éliminée plutôt que lavée et réutilisée principalement pour des raisons de sécurité, de prévention de la contamination croisée et de rentabilité. 1. **Risque biologique et sécurité :** Ces plaques contiennent souvent des agents pathogènes, des virus, des bactéries ou des fluides corporels potentiellement infectieux. Les éliminer directement (généralement par autoclavage puis incinération) réduit le risque d'exposition pour le personnel de laboratoire. 2. **Contamination croisée :** Les résidus biologiques ou chimiques (comme l'ADN, les protéines ou les résidus de médicaments) peuvent adhérer aux parois en plastique. Même après un nettoyage rigoureux, des micro-résidus peuvent subsister et fausser les résultats des expériences ultérieures. 3. **Coût et matériau :** La plupart des plaques de culture sont fabriquées en polystyrène bon marché, moulé par injection. Le coût en temps, en énergie, en eau et en produits chimiques nécessaires pour les stériliser, les tester et garantir leur intégrité dépasse souvent le coût de fabrication d'une plaque neuve à usage unique.

Manipulation des échantillons et disposition d'un dosage

• Mesurez 10 mL de chaque échantillon dans son tube à essai étiqueté, et déposez des gouttes de chacun dans les trois puits qui portent son étiquette.
• Préparez une plaque de sorte que chaque puits puisse être identifié par la suite, et enregistrez la disposition avant d'ajouter le moindre réactif.

Fonctionnement d'un bain-marie chauffant

• Remplir et préparer un bain-marie agité, l'amener à sa température de consigne, et y fixer un tube à essai de manière à ce que son contenu — et non le bain — atteigne la température requise par la réaction.
• Vérifiez la température à l'intérieur du tube avec le thermomètre numérique plutôt que de vous fier au réglage de la plaque chauffante, et expliquez la différence entre les deux mesures.

Utilisation des quatre tests nutritionnels qualitatifs

• Précisez, avant d'ajouter quoi que ce soit, ce que chaque réactif détecte et quelle couleur constitue un résultat positif.
• Ajoutez les réactifs de Biuret dans le bon ordre — d'abord l'hydroxyde de sodium, puis le sulfate de cuivre — et expliquez pourquoi l'alcali doit être présent avant le cuivre.

Lecture, enregistrement et interprétation des résultats

• Notez la couleur des huit résultats tels qu'observés, et décidez seulement ensuite s'ils sont positifs ou négatifs par rapport aux critères énoncés.
• Tirez une conclusion sur le patient à partir du profil des quatre tests et indiquez ce que ce profil n'établit pas.

Protocole

Préparation d'échantillons de selles

1. À l'aide de la pipette, mesurez 10 mL de l'échantillon de selles normal.
2. Versez l'échantillon de 10 mL dans le tube à essai N.
3. À l'aide d'un compte-gouttes, déposez 5 à 10 gouttes de l'échantillon de selles normal dans chacun des 3 puits identifiés comme suit :

• Puits N (Lugol)
• Puits N (Sudan IV)
• Puits N (Biuret)

4. Répétez les étapes 1 à 3 pour l'échantillon de selles du patient (P) en remplissant le tube à essai et les 3 puits correspondants.

Identification des glucides simples

1. Remplir un bécher de 500 mL avec 400 mL d'eau du robinet.
2. Insérer l'agitateur magnétique dans le bécher.
3. Placez le bécher sur la plaque chauffante et réglez à 75°C. Attendez que la température soit atteinte.
4. Allumer l'agitateur magnétique (bouton de gauche).
5. À l'aide de la pipette, ajoutez 10 mL de Fehling A dans le tube à essai N.
6. À l'aide de la pipette, ajoutez 10 mL de Fehling B dans le tube à essai N.
7. Mélangez le contenu du tube à essai N par un mouvement circulaire.
8. Placez une pince universelle sur le montant gauche, au-dessus du bécher de 500 mL préparé à l'étape 1.
9. Fixez le tube à essai N à la pince universelle au-dessus du centre du bécher.
10. À l'aide du thermomètre numérique, vérifiez qu'une température supérieure à 70°C est atteinte dans le tube à essai.
11. Prenez le tube à essai N et remettez-le à sa place d'origine sur le support à tubes à essai.
12. Mélangez le contenu du tube à essai en l'agitant pendant quelques secondes avec la tige de verre.
13. À l'aide de la pipette, ajouter 10 mL de Fehling A dans le tube à essai P.
14. À l'aide de la pipette, ajouter 10 mL de Fehling B dans le tube à essai P.
15. Mélangez le contenu du tube à essai P en effectuant un mouvement circulaire.
16. Fixez le tube à essai P à la pince universelle au-dessus du centre du bécher.
17. À l'aide du thermomètre numérique, vérifiez qu'une température supérieure à 70°C est atteinte dans le tube à essai.
18. Prenez le tube à essai P et remettez-le à sa place d'origine sur le support à tubes à essai.
19. Mélangez le contenu du tube à essai en l'agitant pendant quelques secondes avec la tige de verre.
20. Abaissez la température de la plaque chauffante à 15°C.
21. Éteindre l'agitateur magnétique.

Les observations de la réaction témoin se trouvent dans le tableau des résultats.

Identification des glucides complexes

1. À l'aide du compte-gouttes, ajoutez 5 à 10 gouttes de Lugol dans chacun des 2 puits identifiés comme suit :

• Puits N (Lugol)
• Puits P (Lugol)

2. Videz l'excès du compte-gouttes dans le bac de récupération.
3. Mélangez le contenu à l'aide de la tige de verre. Attention : assurez-vous de bien nettoyer la tige de verre après chaque mélange pour éviter de mélanger les substances !

Identification des lipides

1. À l'aide du compte-gouttes, ajoutez 5 à 10 gouttes de Sudan IV dans chacun des 2 puits identifiés comme suit :

• Puits N (Sudan IV)
• Puits P (Sudan IV)

2. Videz l'excès du compte-gouttes dans le bac de récupération.
3. Mélanger le contenu à l'aide de la tige de verre.

Identification de protéines

1. À l'aide du compte-gouttes, déposez 1 goutte d'hydroxyde de sodium (NaOH) dans chacun des 2 puits identifiés comme suit :

• Puits N (Biuret)
• Puits P (Biuret)

2. Videz l'excès du compte-gouttes dans le bac de récupération.
3. Utilisez la pipette pour prélever 1 pipette complète (10 mL) de sulfate de cuivre (CuSO4).
4. À l'aide de la pipette, versez 1 mL de sulfate de cuivre (CuSO4) dans les puits N et P (Biuret).
5. Vider l'excès de la pipette dans le bac de récupération.
6. Mélanger le contenu à l'aide de la tige de verre.

Les observations se trouvent dans le tableau des résultats.

• Un résultat positif pour la présence de glucides simples entraînera un précipité rouge brique (Cu2O) dans le tube à essai (réaction de Fehling).
• Un résultat positif pour la présence de glucides complexes entraînera une coloration violette (complexe iode-amidon) dans le puits (test de Lugol).
• Un résultat positif pour la présence de lipides entraînera une coloration rouge (complexe Sudan IV – lipides) dans le puits (test de Sudan IV).
• Un résultat positif pour la présence de protéines se traduira par une coloration violette (complexe du biuret) dans le puits (test du biuret).

Résultats attendus

Chacun des quatre tests répond à une question, et chacun possède une couleur positive qui doit être connue avant que le réactif ne soit ajouté. Le premier tableau indique ce qui est recherché et ce qui constitue un résultat.

Le deuxième tableau donne les huit résultats avec l'appel que chacun prend en charge.

La conclusion que les résultats soutiennent. L'échantillon N donne quatre résultats négatifs : rien de détectable n'a échappé à la digestion, ce qui est le résultat attendu pour un intestin sain. L'échantillon P donne deux résultats positifs clairs, les sucres réducteurs et les protéines, lors des mêmes tests qui étaient négatifs pour N et avec les mêmes réactifs provenant des mêmes flacons ; la différence est donc une propriété de l'échantillon et non de la méthode. La présence simultanée de protéines non digérées et de sucres non absorbés dans les selles indique une défaillance générale de la digestion dans l'intestin grêle plutôt que l'absence d'une enzyme spécifique — une insuffisance pancréatique, dans laquelle plusieurs enzymes digestives font défaut en même temps, ou une lésion de la muqueuse intestinale qui réduit le temps et la surface disponibles pour l'absorption. Ce que le résultat ne fait pas, c'est nommer la maladie ; il indique quels processus ont échoué, et un clinicien le fera suivre de tests qui mesurent plutôt qu'ils ne détectent.

Pourquoi le puits positif présente à la fois une couleur et un précipité. Les deux signaux dans le puits P sont deux composés différents du même cuivre. La teinte mauve du liquide est le complexe du biuret lui-même : dans la solution alcaline créée par l'hydroxyde de sodium, le Cu²⁺ est chélaté par les atomes d'azote des liaisons peptidiques adjacentes, et ce complexe cuivre-peptide est soluble, de sorte qu'il colore l'ensemble du puits de manière homogène plutôt que de se déposer. Le précipité est l'hydroxyde de cuivre(II), formé partout où un ion Cu²⁺ rencontre des ions hydroxyde avant de rencontrer une liaison peptidique : Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un solide bleu pâle. L'hydroxyde de cuivre(II) figure parmi les hydroxydes courants les moins solubles, de sorte qu'une fois que les liaisons peptidiques présentes ont pris leur part de cuivre, l'excès quitte la solution sous forme de ce solide. Les deux observations ne font donc qu'une seule et même histoire racontée deux fois : la protéine s'approprie une partie du cuivre sous forme de complexe mauve soluble, et l'hydroxyde s'approprie le reste sous forme de solide.

Pourquoi la solution de Fehling a besoin de chaleur et quel est le précipité rouge. Le réactif de Fehling est du cuivre(II) maintenu en solution par du tartrate en milieu fortement alcalin, raison pour laquelle il est fourni en deux flacons et mélangé uniquement au moment de l'utilisation. Un sucre réducteur possède un groupe aldéhyde libre, et en solution alcaline chaude, ce groupe est oxydé en carboxylate tandis que le cuivre(II) est réduit en cuivre(I), qui est insoluble et précipite sous forme d'oxyde de cuivre(I) rouge brique : RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O. La réaction est beaucoup trop lente pour être observée à température ambiante, ce qui est toute la raison du bain-marie : la plaque chauffante est réglée à 75 °C et le protocole demande plus de 70 °C à l'intérieur du tube, car c'est là que se produit la réaction. Notez ce que le test couvre et ne couvre pas. Le glucose, le fructose, le maltose et le lactose réduisent tous le réactif ; le sucrore ne le fait pas, car ses deux carbones anomériques sont bloqués dans la liaison glycosidique, de sorte qu'aux selles chargées de sucrose donneraient un résultat négatif. Le test indique qu'un sucre réducteur est présent, mais jamais lequel.

Pourquoi l'iode devient bleu-noir avec l'amidon. La solution de Lugol contient de l'iode dissous dans de l'iodure de potassium sous forme d'ion triiodure, I₃⁻. L'amylose, la fraction non ramifiée de l'amidon, s'enroule en une hélice dont l'intérieur est juste assez large pour contenir une chaîne d'ions triiodure, et le complexe de transfert de charge résultant absorbe sur tout le spectre visible pour donner le bleu-noir familier. La couleur est donc un rapport sur la forme du polysaccharide, et non pas simplement sur sa présence : l'amylopectine et le glycogène, qui sont fortement ramifiés et ne peuvent pas former de longues hélice, donnent plutôt du rouge-brun, et les dextrines — de l'amidon partiellement dégradé — donnent un résultat intermédiaire. C'est pourquoi un puits rouge-brun doit être interprété avec précaution. C'est l'aspect du réactif tel quel, il est donc noté comme négatif, mais un étudiant doit savoir que l'amidon partiellement digéré peut également donner une coloration rouge-brun et que le test perd en sensibilité précisément là où la biologie devient intéressante.

Pourquoi le Soudan IV et le biuret fonctionnent tout court. Le Soudan IV est un lysochrome : un colorant qui ne subit aucune réaction chimique, mais qui est beaucoup plus soluble dans les graisses que dans l'eau, de sorte qu'il se répartit dans toutes les gouttelettes lipidiques présentes et les colore en rouge-orangé tandis que l'eau environnante reste presque incolore. Un résultat positif est donc gouttes rouges distinctes, et non un changement de couleur uniforme, et sa lecture consiste à rechercher une structure plutôt qu'une teinte. La réaction du biuret est le test inverse : c'est une véritable réaction de coordination, dans laquelle le Cu²⁺ en solution fortement alcaline, il est chélaté par les atomes d'azote d'au moins deux liaisons peptidiques adjacentes pour donner un complexe violet présentant un maximum d'absorbance proche de 540 nm. Deux conséquences en découlent. Les acides aminés libres et les dipeptides ne réagissent pas, de sorte que le test met en évidence les liaisons peptidiques plutôt que l'azote ; et comme l'intensité de la couleur violette est proportionnelle à la concentration en liaisons peptidiques, c'est le seul des quatre tests qui se transforme directement en dosage quantitatif à l'aide d'un spectrophotomètre et d'une courbe étalon. L'ordre d'addition a son importance : l'alcali doit être présent avant le cuivre, sinon le cuivre précipite sous forme d'hydroxyde au lieu de former le complexe.

Résumé du devoir par tranche d'âge

Classe de 3e à la 2de

• Focalisation les quatre classes de nutriments, le réactif qui révèle chacune d'elles, et la discipline de noter une couleur avant de l'interpréter.
• Activités : Disposez et étiquetez la plaque ; effectuez les quatre tests sur les deux échantillons ; notez la couleur observée des huit résultats dans un tableau semblable au Tableau 2 avant de prendre toute décision ; attribuez à chaque résultat un score positif ou négatif par rapport aux critères du protocole ; indiquez en une seule phrase ce que l'échantillon P ne parvient pas à digérer, et nommez les précautions de sécurité qui s'appliquent à la manipulation d'un échantillon de selles.

11e année

• Focalisation la chimie derrière chaque couleur, et les conditions que chaque réaction exige.
• Activités : écrire l'équation de Fehling et identifier ce qui est oxydé et ce qui est réduit ; expliquer pourquoi le tube doit dépasser 70 °C et pourquoi la lecture à l'intérieur du tube diffère de la consigne de la plaque chauffante ; expliquer pourquoi le saccharose donne un résultat de Fehling négatif alors que le lactose donne un positif ; rendre compte de la couleur bleu-noir à l'aide de l'hélice d'amylose et du triiodure ; expliquer pourquoi le Sudan IV n'a besoin d'aucune réaction pour fonctionner ; et justifier l'ordre dans lequel les deux réactifs du Biuret sont ajoutés.

12e année / Niveau universitaire

• Focalisation le passage d'un dépistage qualitatif à une mesure diagnostique, et l'interprétation d'un ensemble de résultats.
• Activités : décrire comment la réaction du Biuret est transformée en dosage quantitatif des protéines, y compris la courbe d'étalonnage, la longueur d'onde utilisée et la raison pour laquelle l'absorbance est proportionnelle à la concentration en liaisons peptidiques ; proposer les témoins positifs et négatifs qui manquent à ce protocole et préciser ce que chacun permettrait d'écarter ; expliquer pourquoi des résultats positifs simultanés aux tests de Fehling et du Biuret indiquent une défaillance digestive générale plutôt que l'absence d'une seule enzyme, et énumérer les examens complémentaires qui distingueraient une insuffisance pancréatique d'une atteinte de la muqueuse ; évaluer la sensibilité et la spécificité de chacun des quatre tests en tant que dépistage ; et expliquer pourquoi un résultat négatif ne peut pas exclure une maladie.

Essentiels de laboratoire

Instruments

• Tubes à essai, 50 mL (2, étiquetés N et P)
• Porte-tubes à essai
• Compotes, 1 mL (8)
• Pipette
• Bécher (500 mL, rempli de 400 mL d'eau du robinet)
• Plaque multipuits (plaque à 6 puits utilisée)
• Plaque chauffante, réglée à 75 °C
• Agitateur magnétique et barreau aimanté
• Thermomètre numérique
• Baguettes en verre
• Support et pince universelle
• Essuie-tout
• Corbeille

Produits

• Échantillon de selles normal (N)
• Échantillon de selles du patient (P)
• Réactif de Fehling, solutions A et B (10 mL de chaque par tube)
• Solution d'iode de Lugol 2 %
• Solution de Sudan IV
• Réactif de Biuret — hydroxyde de sodium, NaOH 2,5 M
• Réactif de Biuret — sulfate de cuivre, CuSO₄ 0,0094 M
• Eau du robinet (400 mL pour le bain)