대변 검사는 소화기학에서 가장 저렴하면서도 유익한 검사 중 하나인데, 이는 몸 밖으로 소화되지 않은 채 배출되는 물질이 소화나 흡수가 어디에서 실패했는지를 정확히 말해주기 때문이다. 대변 속의 지방은 충분한 리파아제를 분비하지 못하는 췌장이나 손상된 장 점막을 가리키며, 소화되지 않은 단백질도 마찬가지 방향을 가리킨다. 그리고 소소관에서 분해되어 흡수되었어야 할 당류는 락타아제 같은 효소가 부족할 때 대변에서 나타난다. 이러한 발견들 중 어느 것도 감지하는 데 정교한 장비가 필요하지 않다. 각 영양소 계열에는 한 세기가 훨씬 넘도록 사용되어 온 색상 반응 검사가 있다. 펠링 용액은 환원당이 존재할 때 벽돌색 침전물로 변하고, 요오드는 녹말과 만나면 청흑색으로 변하며, 수단 IV는 지질 방울을 붉은색으로 염색하고, 알칼리성 용액 속의 구리는 펩타이드 결합과 만나면 보라색으로 변한다. 이 실험실에서 여러분은 소화가 정상인 사람의 시료 N과 환자의 시료 P라는 두 개의 시료를 나란히 놓고 네 가지 검사 모두를 수행할 것이며, 두 결과 열 사이의 차이를 이용하여 환자가 소화하지 못하는 영양소 계열이 무엇인지 밝혀낼 것이다. 세 가지 검사는 마이크로플레이트의 웰에서 이루어지며, 펠링 검사는 열이 필요하므로 핫플레이트 위의 수조에 고정된 시험관에서 수행된다.
교육 목표
실험실 환경 익숙해지기
- 마이크로플레이트, 시험관 랙, 스포이트, 피펫, 마그네틱 스티어러가 포함된 핫플레이트, 디지털 온도계, 회수통을 식별하고 각각의 역할을 명시합니다.
- 두 개의 시료를 교차 오염 없이 동시에 다루고, 젓는 과정마다 유리 막대를 닦으십시오.
생물학적 물질 취급
- 대변 검체는 잠재적 감염원으로 취급하십시오: 전 과정에서 장갑 착용, 입으로 옮기지 말 것, 과잉 시약은 싱크대 대신 회수 통에 버릴 것.
- 생물학적 물질이 담겼던 웰 플레이트를 세척하여 재사용하지 않고 폐기하는 이유는 오염 위험, 구조적 복잡성, 그리고 안전성 때문입니다. 첫째, 교차 오염의 위험이 큽니다. 미세한 유기물, 단백질, DNA, 세포 또는 미생물이 웰의 미세한 틈이나 표면에 남아있을 경우 다음 실험 결과를 완전히 망치거나 왜곡할 수 있습니다. 둘째, 웰 플레이트는 플라스틱(주로 폴리스티렌)으로 만들어진 저렴한 소모품인 경우가 많습니다. 플라스틱은 세척 과정에서 사용되는 강한 세제나 고온(오토클레이브)에 의해 미세하게 변형되거나 표면 특성이 바뀔 수 있으며, 이는 향후 실험의 재현성에 악영향을 미칩니다. 셋째, 감염성 물질이나 유해 화학물질을 다루는 실험실에서는 세척 과정 자체가 연구원들에게 불필요한 생물학적, 화학적 위험을 노출시키기 때문에 안전을 위해 일회용으로 사용하고 곧바로 폐기하는 것이 표준 원칙입니다.
시료 취급 및 분석법 배치
- 각 시료 10 mL를 라벨이 붙은 시험관에 각각 측정하여 넣고, 각 시료의 라벨이 있는 세 개의 홈에 각각 몇 방울씩 떨어뜨립니다.
- 나중에 모든 웰을 식별할 수 있도록 플레이트를 준비하고, 시약을 넣기 전에 레이아웃을 기록하십시오.
가열 수조의 작동
- 교반 수조를 채우고 설치한 후 설정 온도에 도달하게 하고, 수조가 아닌 시험관의 내용물이 반응에 필요한 온도에 도달하도록 시험관을 고정하십시오.
- 핫플레이트의 설정값에 의존하지 말고 디지털 온도계로 튜브 내부의 온도를 확인하고, 두 측정값의 차이를 설명하세요.
4가지 정성적 영양소 테스트의 사용
- 아무것도 추가하기 전에, 각 시약이 무엇을 검출하는지, 그리고 어떤 색상이 양성 반응을 의미하는지 밝히세요.
- 뷰렛 시약을 올바른 순서대로, 즉 수산화나트륨을 먼저 넣고 그 다음에 황산구리를 넣으세요. 그리고 왜 구리보다 알칼리가 먼저 있어야 하는지 설명하세요.
결과 읽기, 기록 및 해석
- 관찰된 여덟 가지 결과 모두의 색상을 기록하고, 그런 다음 명시된 기준에 따라 양성인지 음성인지 판정하십시오.
- 네 가지 검사 결과의 패턴을 바탕으로 환자에 대한 결론을 도출하고, 해당 패턴이 규명하지 못하는 점을 서술하시오.
프로토콜
대변 샘플 준비
- 피펫으로 정상 대변 시료 10 mL를 측정하십시오.
- 10mL 샘플을 시험관 N에 따르십시오.
- 스포이트를 사용하여 정상 대변 시료 5~10방울을 다음과 같이 표시된 3개의 웰 각각에 넣으십시오:
- 웰 N (Lugol)
- 웰 N (Sudan IV)
- 웰 N (Biuret)
- 환자 대변 시료(P)에 대해서도 시험관과 해당되는 3개의 웰을 채워 1단계부터 3단계까지 반복하십시오.
단순 탄수화물 식별
- 500mL 비커에 수돗물 400mL를 채우세요.
- 비커에 교반 자석을 넣으세요.
- 비커를 핫플레이트 위에 올려 75°C로 설정하십시오. 온도가 도달할 때까지 기다립니다.
- 자석 교반기 (왼쪽 버튼)를 켜세요.
- 피펫을 사용하여 시험관 N에 펠링 A 용액 10mL를 첨가하십시오.
- 피펫을 사용하여 시험관 N에 펠링 B 용액 10mL를 넣으십시오.
- 시험관 N의 내용물을 원형으로 섞으십시오.
- 1단계에서 준비된 500mL 비커 위쪽, 왼쪽 스탠드에 유니버설 클램프를 설치하십시오.
- 시험관 N을(를) 비커 중앙 위의 유니버설 클램프에 고정하십시오.
- 디지털 온도계를 사용하여 시험관에서 70°C 이상의 온도가 도달했는지 확인하십시오.
- 시험관 N을(를) 꺼내 시험관 랙의 원래 자리에 다시 놓으십시오.
- 유리 막대로 시험관을 몇 초간 흔들어 내용물을 섞으세요.
- 피펫을 사용하여 시험관 P에 펠링 A 용액 10mL을 넣으시오.
- 피펫을 사용하여 시험관 P에 펠링 B 용액 10mL를 넣으십시오.
- 시험관 P의 내용물을 원을 그리며 섞으시오.
- 시험관 P을(를) 비커 중앙 위의 유니버설 클램프에 고정하십시오.
- 디지털 온도계를 사용하여 시험관에서 70°C 이상의 온도가 도달했는지 확인하십시오.
- 시험관 P을(를) 꺼내 시험관 랙의 원래 자리에 다시 놓으십시오.
- 유리 막대로 시험관을 몇 초간 흔들어 내용물을 섞으세요.
- 핫플레이트 온도를 15°C로 낮추십시오.
- 자석 교반기 전원을 끄세요.
대조 반응의 관찰 결과는 결과 표에 나와 있습니다.
복합 탄수화물 식별
- 스포이트를 사용하여 루골 용액 5~10방울을 다음과 같이 표시된 2개의 웰 각각에 넣으십시오:
- 웰 N (Lugol)
- 웰 P (Lugol)
- 드롭퍼의 과잉 액체를 회수 용기에 비우세요.
- 유리 막대로 내용물을 섞으십시오. 경고: 물질이 섞이지 않도록 매번 섞은 후 유리 막대를 깨끗이 닦으십시오!
지질 식별
- 스포이트를 사용하여 Sudan IV 5~10방울을 다음과 같이 표시된 2개의 웰 각각에 넣으십시오:
- 웰 N (Sudan IV)
- 웰 P (Sudan IV)
- 드롭퍼의 과잉 액체를 회수 용기에 비우세요.
- 유리 막대를 사용하여 내용물을 섞으세요.
단백질 식별
- 스포이트를 사용하여 수산화 나트륨(NaOH) 1방울을 다음과 같이 표시된 2개의 웰 각각에 넣으십시오:
- 웰 N (Biuret)
- 웰 P (Biuret)
- 드롭퍼의 과잉 액체를 회수 용기에 비우세요.
- 피펫을 사용하여 황산구리(CuSO4)를 피펫 가득(10 mL) 채우십시오.
- 피펫을 사용하여 황산구리(CuSO4) 1 mL를 웰 N과 P(Biuret)에 넣으십시오.
- 피펫의 남은 액체를 회수 용기에 비우세요.
- 유리 막대를 사용하여 내용물을 섞으세요.
결과 표에서 관찰 결과를 찾을 수 있습니다.
- 단순 탄수화물 존재에 대한 양성 결과는 시험관에 벽돌색 침전물(Cu2O)로 나타납니다(펠링 반응).
- 복합 탄수화물 존재에 대한 양성 결과는 웰에서 보라색(요오드-녹말 복합체)으로 나타납니다(루골 검사).
- 지질 존재에 대한 양성 결과는 웰에 붉은색(Sudan IV–지질 복합체)으로 나타납니다(Sudan IV 검사).
- 단백질 존재 양성 결과는 웰(뷰렛 반응)에서 보라색(뷰렛 복합체)으로 나타납니다.
예상 결과
4개의 테스트 각각은 하나의 질문에 답하며, 각각은 시약이 들어가기 전에 알려져야 하는 양성 색상을 가지고 있습니다. 첫 번째 표에는 무엇을 찾고 있는지와 무엇이 결과로 인정되는지가 명시되어 있습니다.
| 테스트 | 시약 | 탐지하는 것 | 양성 결과 | 음성 결과 |
|---|---|---|---|---|
| 단순 탄수화물 | 펠링 A + B, 70 °C 이상으로 가열 | 환원당: 포도당, 과당, 맥아당, 유당 | Cu의 벽돌색 침전물2튜브 안의 O | 구리 시약의 진한 푸른색은 변하지 않고 침전물도 생기지 않는다 |
| 복합 탄수화물 | 루골 요오드 2 % | 전분, 그리고 그보다 적은 정도로 글리코겐과 덱스트린 | 우물 속의 청흑색 내지 진보라색 착색 | 시약 자체의 황갈색 내지 적갈색만 |
| 지질 | 수단 IV | 지방적(droplet) 형태로 존재하는 중성 지방과 지방산 | 선명한 적색~적황색 염색 방울들 | 얼룩진 물방울 없이 은은하고 고르게 퍼진 핑크색 |
| 단백질 | 뷰렛: NaOH 다음 CuSO4 | 펩타이드 결합, 따라서 세 개 이상의 잔기로 이루어진 단백질과 펩타이드 | 웰(well) 내부의 보라색에서 연보라색으로의 착색 | 구리 용액의 옅은 푸른색, 또는 전혀 변화 없음 |
두 번째 표는 각 결과가 지원하는 호출과 함께 여덟 가지 결과를 제공합니다.
| 테스트 | 표본 N(정상) — 관찰됨 | 전화 | 샘플 P(환자) — 관찰됨 | 전화 |
|---|---|---|---|---|
| 펠링 용액, 단순 탄수화물 | 가열 후에도 침전이 생기지 않으며, 결과 표에는 펠링 반응이 검출되었다는 것만 기록되어 있습니다. | 부정적 | 가열 후 튜브에서 침전물이 관찰됩니다. | 긍정적 |
| 루골, 복합 탄수화물 | 진한 아이오딘 용액의 색인 짙은 적갈색 | 음성 — 청흑색 아님 | 호박색에서 중간 갈색, 우물 N보다 밝음 | 음성 — 청흑색 아님 |
| 수단 IV, 지질 | 우물 전체에 걸쳐 옅고 얼룩덜룩한 분홍색을 띠며, 개별적인 착색 물방울은 없음 | 부정적 | 연한 얼룩덜룩한 분홍색이며, N 우물과 매우 가깝고 별도의 착색된 액체 방울은 없음 | 부정적 |
| 뷰렛, 단백질 | 거의 무색에 가까운, 아주 연한 오프화이트 핑크 | 부정적 | 연한 푸른색 침전물이 뚜렷한 연보라색 웰, N과는 명백히 다름 | 긍정적 |
결과가 지지하는 결론. 샘플 N은 검출 가능한 것이 소화를 통과해 빠져나가지 않았음을 보여주는 네 가지 음성 반응을 나타내는데, 이는 건강한 장에서 예상되는 결과이다. 샘플 P는 샘플 N에서는 음성이었고 동일한 병의 동일한 시약을 사용한 동일한 검사에서 환원당과 단백질이라는 두 가지 명확한 양성 반응을 나타내므로, 그 차이는 검사법이 아니라 샘플의 특성에서 비롯된 것이다. 소화되지 않은 단백질과 흡수되지 않은 당이 대변으로 함께 도달하는 것은 특정 효소 하나가 결핍된 것이 아니라 소장의 일반적인 소화 기능 부전을 가리키며, 이는 여러 소화 효소가 한꺼번에 결핍되는 췌장 기능 부전이나 흡수에 이용되는 시간과 표면적을 단축시키는 장 점막의 손상을 의미한다. 이 결과가 말해 주지 않는 것은 질병의 명칭이며, 이는 어떤 과정들에 문제가 생겼는지를 말해 주는 것으로 임상의는 이를 바탕으로 검출하기보다는 측정하는 검사들을 이어 나갈 것이다.
양성 웰에서 색과 침전물이 모두 나타나는 이유. 웰 P의 두 신호는 같은 구리의 서로 다른 두 화합물이다. 액체의 연보라색은 뷰렛 착물 자체이다. 수산화 나트륨이 만든 알칼리성 용액에서 Cu2+ 이온은 인접한 펩타이드 결합의 질소 원자들에 의해 킬레이트화되며, 이 구리-펩타이드 착물은 용해성이므로 가라앉지 않고 웰 전체를 고르게 물들인다. 침전물은 수산화 구리(II)로, Cu2+ 이온이 펩타이드 결합보다 수산화 이온을 먼저 만나는 곳마다 생성된다: Cu2+ + 2 OH− → Cu(OH)2(s), 연한 푸른색 고체. 수산화 구리(II)는 일반적인 수산화물 중에서 용해도가 가장 낮은 편에 속하므로, 존재하는 펩타이드 결합들이 각자 몫의 구리를 차지하고 나면, 남은 과량의 구리는 이 고체 형태로 용액에서 빠져나간다. 따라서 두 가지 관찰 결과는 동일한 현상을 두 번 이야기하는 셈이다. 즉, 단백질은 구리의 일부를 차지하여 수용성의 연보라색 착물을 형성하고, 수산화물은 나머지를 차지하여 고체로 만드는 것이다.
펠링 반응액에 열이 필요한 이유와, 붉은색 침전물이 무엇인지. 펠링 시약은 강알칼리 용액 속에서 타르타르산염에 의해 용액 상태로 유지되는 구리(II)이므로, 두 개의 병으로 공급되며 사용 직전에만 혼합됩니다. 환원당은 유리 알데하이드기를 가지고 있으며, 뜨거운 알칼리성 용액에서 이 기는 카르복실산염으로 산화되는 동시에 구리(II)는 불용성이며 벽돌 붉은색의 산화 구리(I)로 가라앉는 구리(I)로 환원됩니다: RCHO + 2 Cu2+ + 5 OH− → RCOO− + Cu2O(s) + 3 H2O. 실온에서 관찰하기에는 반응이 너무 느려서 중탕을 하는 주된 이유가 됩니다. 핫플레이트는 75 °C로 설정되어 있고 프로토콜에서는 70 °C 이상을 요구합니다. 튜브 안쪽 자국, 반응이 일어나는 곳이기 때문입니다. 검사가 무엇을 다루고 무엇을 다루지 않는지 주목하세요. 글루코스, 프락토스, 말토스, 락토스는 모두 시약을 환원시키지만, 수크로스는 환원시키지 않는데, 이는 수크로스의 두 아노머 탄소 모두가 글리코사이드 결합에 묶여 있기 때문입니다. 따라서 수크로스가 가득 찬 대변은 음성 반응을 보일 것입니다. 이 검사는 환원 당이 존재한다는 것만 알려줄 뿐, 어떤 당인지는 결코 알려주지 않습니다.
아이오딘이 녹말과 만나 청흑색으로 변하는 이유. 루골 용액은 아이오딘화 칼륨에 녹아 삼아이오딘화 이온(I) 형태로 존재하는 아이오딘을 함유하고 있습니다.3−. 아밀로스는 전분의 가지가 없는 부분으로, 내부가 삼요오드화물 이온 사슬을 수용할 수 있을 만큼만 넓은 나선 형태로 감기며, 그 결과 생성된 전하 이동 착물은 가시광선 영역 전반에 걸쳐 빛을 흡수하여 친숙한 청흑색을 나타낸다. 따라서 이 색상은 다음을 나타내는 보고이다 모양 다당류의 존재 여부뿐만 아니라 그 구조에도 의존합니다. 고도로 가지를 치고 있어 긴 나선 구조를 형성할 수 없는 아밀로펙틴과 글리코겐은 대신 적갈색을 띠며, 전분이 부분적으로 분해된 덱스트린은 그 중간 정도의 색을 냅니다. 이것이 적갈색 반응 웰을 주의 깊게 판독해야 하는 이유입니다. 이는 시약 자체의 색상이기 때문에 음성으로 채점되지만, 학생들은 부분적으로 소화된 전분도 적갈색을 나타낼 수 있으며, 생물학적으로 흥미로워지는 바로 그 지점에서 이 검사의 민감도가 떨어진다는 점을 알아야 합니다.
수단 IV와 뷰렛 반응이 작동하는 이유. 수단 IV는 라이소크롬으로, 화학적 반응을 전혀 일으키지 않지만 물보다 지방에 몇 배 더 잘 용해되기 때문에 존재하는 모든 지질 방울 속으로 분배되어 그것을 적오렌지색으로 염색하는 반면 주변의 물은 거의 무색인 상태로 유지되는 염료이다. 따라서 양성 결과는 분리된 붉은 물방울들, 균일한 색상 변화가 아니라, 그것을 읽는 것은 색조보다는 구조를 찾는 문제입니다. 뷰렛 반응은 그 반대 종류의 테스트입니다. 그것은 진정한 배위 반응이며, 그 반응에서 Cu2+ 강알칼리성 용액에서 적어도 두 개의 인접한 펩티드 결합의 질소 원자에 의해 킬레이트화되어 약 540 nm 부근에서 흡광도 최댓값을 갖는 보라색 착물을 형성합니다. 이에 따라 두 가지 결과가 따릅니다. 유리 아미노산과 디펩티드는 반응하지 않으므로, 이 시험은 질소보다는 펩티드 결합을 나타냅니다. 또한 보라색의 강도가 펩티드 결합의 농도에 비례하기 때문에, 이는 네 가지 시험 중 분광광도계와 표준 곡선을 사용하여 직접 정량 분석으로 이어지는 유일한 시험입니다. 시약을 넣는 순서가 중요합니다. 구리가 들어가기 전에 알칼리가 먼저 존재해야 하며, 그렇지 않으면 착물을 형성하는 대신 구리가 수산화물로 침전됩니다.
학년별 과제 요약
9~10학년
- 집중 네 가지 영양소 군, 각각을 확인하는 시약, 그리고 해석하기 전에 색상을 기록하는 원칙.
- 활동 플레이트를 준비하고 라벨을 붙이십시오; 두 샘플 모두에 대해 네 가지 테스트를 실행하십시오; 결정을 내리기 전에 표 2와 같은 표에 여덟 가지 결과의 관찰된 색상을 모두 적으십시오; 프로토콜의 기준에 따라 각 결과를 양성 또는 음성으로 채점하십시오; 샘플 P가 소화하지 못하는 것을 한 문장으로 진술하고, 대변 샘플 취급에 적용되는 안전 예방 조치의 이름을 대십시오.
11학년
- 집중 각 색상의 이면에 숨겨진 화학 작용과 각 반응에 필요한 조건들.
- 활동 펠링 반응식을 작성하고, 어떤 물질이 산화되고 어떤 물질이 환원되는지 밝혀라; 시험관 내 온도가 70 °C를 초과해야 하는 이유와, 시험관 내 온도 측정값이 핫플레이트의 설정 온도와 다른 이유를 설명하라; 자당(sucrose)은 펠링 반응에서 음성 반응을 보이는 반면 유당(lactose)은 양성 반응을 보이는 이유를 설명하고, 아밀로스 나선 구조와 삼요오드화물을 바탕으로 청흑색이 나타나는 원리를 설명하며, 수단 IV(Sudan IV)가 반응을 일으키지 않아도 효과가 있는 이유를 설명하고, 두 가지 뷰렛 시약을 첨가하는 순서의 타당성을 설명하라.
12학년 / 대학교 수준
- 집중 정성적 스크리닝에서 진단적 측정으로의 도약, 그리고 결과 패턴의 해석.
- 활동 뷰렛 반응을 표준 곡선, 사용하는 파장, 흡광도가 펩타이드 결합 농도에 비례하는 이유를 포함하여 정량적 단백질 분석으로 전환하는 방법 설명하기; 이 실험 절차에 없는 양성 대조군과 음성 대조군을 제안하고 각각이 무엇을 배제할 수 있는지 말하기; 펠링과 뷰렛이 동시에 양성이면 단일 효소의 결핍이 아니라 전반적인 소화 기능 부전을 가리키는 이유를 설명하고, 췌장 기능 부전과 점막 손상을 구별할 추가 검사들을 나열하기; 네 가지 검사 각각의 민감도와 특이도를 선별 검사로서 평가하기; 그리고 음성 결과가 질환을 배제할 수 없는 이유 설명하기.
실험실 필수품
악기
- 시험관, 50 mL (2개, N 및 P로 표시)
- 시험관대
- 스포이트, 1 mL (8개)
- 피펫
- 비커 (500 mL, 수돗물 400 mL 채워짐)
- 마이크로플레이트 (웰 플레이트, 6웰 사용)
- 핫플레이트, 75 °C로 설정
- 마그네틱 교반기와 마그네틱 교반 자석
- 디지털 온도계
- 유리 막대
- 스탠드 및 만능 클램프
- 키친타월
- 휴지통
제품
- 정상 대변 검체 (N)
- 환자 대변 검체 (P)
- 펠링 시약, A액과 B액 (시험관당 각각 10 mL)
- 루골 요오드 용액 2 %
- 수단 IV 용액
- 뷰렛 시약 — 수산화 나트륨, NaOH 2.5 M
- 뷰렛 시약 — 황산 구리, CuSO4 0.0094 M
- 수돗물 (목욕용 400 mL)