028 – Análisis de heces

Un examen de heces es una de las pruebas más baratas e informativas en gastroenterología, porque lo que sale del cuerpo sin digerir indica exactamente dónde ha fallado la digestión o la absorción. La grasa en las heces apunta a un páncreas que no está produciendo suficiente lipasa o a un revestimiento intestinal dañado; la proteína no digerida apunta en la misma dirección; y los azúcares que deberían haberse descompuesto y absorbido en el intestino delgado aparecen en las heces cuando falta una enzima como la lactasa. Ninguno de estos hallazgos requiere equipos sofisticados para su detección. Cada clase de nutriente tiene una prueba de color que se ha utilizado durante más de un siglo: la solución de Fehling produce un precipitado rojo ladrillo en presencia de un azúcar reductor, el yodo adquiere un color negro azulado con el almidón, el Sudán IV tiñe las gotitas de lípidos de rojo y el cobre en solución alcalina se vuelve violeta con los enlaces peptídicos. En este laboratorio, realizará las cuatro pruebas en dos muestras una al lado de la otra —la muestra N de una persona cuya digestión es normal y la muestra P de un paciente— y utilizará la diferencia entre las dos columnas de resultados para determinar qué clases de nutrientes el paciente no está digiriendo. Tres de las pruebas se realizan en los pocillos de una microplaca; la prueba de Fehling necesita calor, por lo que se realiza en tubos de ensayo sujetos en un baño María sobre una placa calefactora.

Objetivos Educativos

Familiarización con el entorno del laboratorio

• Identifica la placa de microvaloración, la gradilla para tubos de ensayo, los cuentagotas, la pipeta, la placa calefactora con su agitador magnético, el termómetro digital y el recipiente de recuperación, y explica la función de cada uno.
• Trabaja con dos muestras a la vez sin contaminarlas y limpia la varilla de vidrio entre cada agitación.

Manipulación de material biológico

• Trate una muestra de heces como potencialmente infecciosa: guantes en todo momento, prohibido transferir con la boca, el exceso de reactivo debe desecharse en el recipiente de recuperación en lugar del fregadero.
• Una placa de pocillos que ha contenido material biológico se desecha en lugar de lavarse y reutilizarse principalmente por razones de seguridad biológica, el riesgo de contaminación cruzada y la dificultad de garantizar una esterilización completa. Aquí se detallan las razones principales: 1. **Riesgo de contaminación cruzada:** En la investigación científica y el diagnóstico clínico, los resultados dependen de la precisión absoluta. Si un pocillo retiene incluso cantidades microscópicas de residuos biológicos (proteínas, ADN, ARN o células) de un experimento anterior, puede arruinar los resultados de futuros experimentos, provocando falsos positivos o datos no válidos. 2. **Bioseguridad y salud pública:** El material biológico puede contener agentes patógenos, virus, bacterias o sustancias tóxicas. Reutilizar el equipo aumenta el riesgo de exposición para el personal de laboratorio y el medio ambiente. 3. **Complejidad del diseño y limpieza:** Las placas de pocillos suelen estar hechas de plásticos (como poliestireno) que son económicos de fabricar a gran escala, pero difíciles de limpiar a fondo en cada rincón microscópico de sus múltiples pocillos. Los residuos pueden unirse fuertemente a la superficie del plástico. 4. **Efectividad de la esterilización:** Aunque los métodos de esterilización (como la autoclave o productos químicos) matan los microorganismos, no eliminan necesariamente las moléculas biológicas (como las endotoxinas) que aún podrían interferir con futuros ensayos biológicos. 5. **Costo-efectividad:** Es mucho más seguro, rápido y económico fabricar placas de un solo uso que validar un protocolo de limpieza y esterilización que garantice que el equipo está 100 % libre de contaminantes para su reutilización.

Manejo de muestras y diseño de un ensayo

• Mida 10 mL de cada muestra en su tubo de ensayo etiquetado y coloque gotas de cada una en los tres pocillos que llevan su etiqueta.
• Prepara una placa de manera que cada pocillo pueda ser identificado posteriormente, y registra la disposición antes de añadir cualquier reactivo.

Funcionamiento de un baño de agua caliente

• Llene y prepare un baño de maría con agitación, llévelo a su punto de ajuste y sujete un tubo de ensayo de modo que su contenido —no el baño— alcance la temperatura que la reacción necesita.
• Verifica la temperatura dentro del tubo con el termómetro digital en lugar de confiar en la configuración de la placa calefactora, y explica la diferencia entre ambas lecturas.

Uso de las cuatro pruebas cualitativas de nutrientes

• Indica, antes de añadir nada, qué detecta cada reactivo y qué color cuenta como resultado positivo.
• Añade los reactivos de Biuret en el orden correcto —primero el hidróxido de sodio y luego el sulfato de cobre— y explica por qué el álcali debe estar presente antes que el cobre.

Lectura, registro e interpretación de resultados

• Registre el color de los ocho resultados tal como se observan, y solo entonces decida si es positivo o negativo según los criterios establecidos.
• Saca una conclusión sobre el paciente a partir del patrón de las cuatro pruebas y di qué es lo que el patrón no establece.

Protocolo

Preparación de muestras de heces

1. Con la pipeta, mida 10 mL de la muestra de heces normal.
2. Vierte la muestra de 10 mL en el tubo de ensayo N.
3. Con un gotero, coloque de 5 a 10 gotas de la muestra de heces normal en cada uno de los 3 pocillos identificados de la siguiente manera:

• Pocillo N (Lugol)
• Pocillo N (Sudan IV)
• Pocillo N (Biuret)

4. Repita los pasos del 1 al 3 para la muestra de heces del paciente (P) llenando el tubo de ensayo y los 3 pocillos correspondientes.

Identificación de carbohidratos simples

1. Llene 400 mL de agua del grifo en un vaso de precipitados de 500 mL.
2. Inserte la barra de agitación magnética en el vaso de precipitados.
3. Coloque el vaso de precipitados en la placa calefactora y ajuste a 75 °C. Espere hasta que se alcance la temperatura.
4. Enciende la placa de agitación magnética (botón izquierdo).
5. Usando la pipeta, añade 10 mL de Fehling A al tubo de ensayo N.
6. Usando la pipeta, añada 10 mL de Fehling B al tubo de ensayo N.
7. Mezcle el contenido del tubo de ensayo N con un movimiento circular.
8. Coloca una pinza universal en el soporte izquierdo, por encima del vaso de precipitados de 500 mL preparado en el paso 1.
9. Fije el tubo de ensayo N a la pinza universal por encima del centro del vaso de precipitados.
10. Utilice el termómetro digital para verificar que se alcance una temperatura superior a 70 °C en el tubo de ensayo.
11. Tome el tubo de ensayo N y vuelva a colocarlo en su lugar original en la gradilla para tubos de ensayo.
12. Mezcle el contenido del tubo de ensayo agitándolo durante unos segundos con la varilla de vidrio.
13. Con la pipeta, añada 10 mL de Fehling A al tubo de ensayo P.
14. Usando la pipeta, agregue 10 mL de Fehling B al tubo de ensayo P.
15. Mezcla el contenido del tubo de ensayo P con un movimiento circular.
16. Fije el tubo de ensayo P a la pinza universal por encima del centro del vaso de precipitados.
17. Utilice el termómetro digital para verificar que se alcance una temperatura superior a 70 °C en el tubo de ensayo.
18. Tome el tubo de ensayo P y vuelva a colocarlo en su lugar original en la gradilla para tubos de ensayo.
19. Mezcle el contenido del tubo de ensayo agitándolo durante unos segundos con la varilla de vidrio.
20. Baje la temperatura de la placa calefactora a 15°C.
21. Apaga el agitador magnético.

Las observaciones de la reacción de control se encuentran en la tabla de resultados.

Identificación de carbohidratos complejos

1. Con el gotero, añada de 5 a 10 gotas de Lugol en cada uno de los 2 pocillos identificados de la siguiente manera:

• Pocillo N (Lugol)
• Pocillo P (Lugol)

2. Vacía el exceso del gotero en el contenedor de recuperación.
3. Mezcle el contenido con la varilla de vidrio. Advertencia: ¡asegúrese de limpiar bien la varilla de vidrio después de cada mezcla para evitar mezclar las sustancias!

Identificación de lípidos

1. Con el gotero, añada de 5 a 10 gotas de Sudan IV en cada uno de los 2 pocillos identificados de la siguiente manera:

• Pocillo N (Sudan IV)
• Pocillo P (Sudan IV)

2. Vacía el exceso del gotero en el contenedor de recuperación.
3. Mezcle los contenidos con la varilla de vidrio.

Identificación de proteínas

1. Con el gotero, coloque 1 gota de hidróxido de sodio (NaOH) en cada uno de los 2 pocillos identificados de la siguiente manera:

• Pocillo N (Biuret)
• Pocillo P (Biuret)

2. Vacía el exceso del gotero en el contenedor de recuperación.
3. Utilice la pipeta para extraer 1 pipeta completa (10 mL) de sulfato de cobre (CuSO4).
4. Con la pipeta, dispense 1 mL de sulfato de cobre (CuSO4) en los pocillos N y P (Biuret).
5. Vacíe el exceso de la pipeta en el contenedor de recuperación.
6. Mezcle los contenidos con la varilla de vidrio.

Las observaciones se encuentran en la tabla de resultados.

• Un resultado positivo para la presencia de carbohidratos simples dará lugar a un precipitado rojo ladrillo (Cu2O) en el tubo de ensayo (reacción de Fehling).
• Un resultado positivo para la presencia de carbohidratos complejos dará como resultado una coloración púrpura (complejo yodo-almidón) en el pocillo (prueba de Lugol).
• Un resultado positivo para la presencia de lípidos dará lugar a una coloración roja (complejo Sudan IV – lípidos) en el pocillo (prueba de Sudan IV).
• Un resultado positivo para la presencia de proteínas dará como resultado una coloración púrpura (complejo de Biuret) en el pocillo (prueba de Biuret).

Resultados esperados

Cada una de las cuatro pruebas responde a una pregunta y cada una tiene un color positivo que debe conocerse antes de que se añada el reactivo. La primera tabla establece qué se está buscando y qué cuenta como resultado.

La segunda tabla muestra los ocho resultados con la llamada que cada uno respalda.

La conclusión que apoyan los resultados. La muestra N da cuatro negativos: no se ha escapado nada detectable de la digestión, que es el resultado esperado para un intestino sano. La muestra P da dos positivos claros, azúcares reductores y proteínas, en las mismas pruebas que dieron negativo para N y con los mismos reactivos de los mismos frascos, por lo que la diferencia es una propiedad de la muestra y no del método. La proteína no digerida y el azúcar no absorbido que llegan juntos a las heces apuntan a un fallo general de la digestión en el intestino delgado en lugar de a la ausencia de una enzima específica —una insuficiencia pancreática, en la que faltan varias enzimas digestivas a la vez, o un daño en el revestimiento intestinal que acorta el tiempo y la superficie disponibles para la absorción—. Lo que el resultado no hace es nombrar la enfermedad; indica qué procesos han fallado, y un clínico lo seguiría con pruebas que miden en lugar de detectar.

Por qué el pozo positivo muestra tanto un color como un precipitado. Las dos señales en el pozo P son dos compuestos diferentes del mismo cobre. El tinte malva del líquido es el complejo de biureto en sí: en la solución alcalina creada por el hidróxido de sodio, el Cu²⁺ es quelado por los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos adyacentes, y este complejo de cobre y péptido es soluble, por lo que colorea todo el pozo de manera uniforme en lugar de sedimentar. El precipitado es hidróxido de cobre(II), formado dondequiera que un ion Cu²⁺ encuentra iones hidróxido antes de encontrar un enlace peptídico: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un sólido azul pálido. El hidróxido de cobre(II) se encuentra entre los hidróxidos comunes menos solubles, por lo que una vez que los enlaces peptídicos presentes han tomado su parte del cobre, el exceso abandona la solución en forma de este sólido. Las dos observaciones son, por tanto, una misma historia contada dos veces: la proteína reclama parte del cobre como un complejo malva soluble, y el hidróxido reclama el resto como un sólido.

Por qué la solución de Fehling necesita calor y qué es el precipitado rojo. El reactivo de Fehling es cobre(II) mantenido en solución por tartrato en álcali fuerte, razón por la cual se suministra en dos frascos y se mezcla únicamente en el momento de su uso. Un azúcar reductor porta un grupo aldehído libre, y en solución alcalina caliente ese grupo se oxida a un carboxilato mientras que el cobre(II) se reduce a cobre(I), el cual es insoluble y precipita como óxido de cobre(I) de color rojo ladrillo: RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O. La reacción es demasiado lenta para poder observarla a temperatura ambiente, y esa es precisamente la razón por la que se utiliza el baño maría: la placa calefactora está ajustada a 75 °C y el protocolo indica que la temperatura debe ser superior a 70 °C. dentro del tubo, porque ahí es donde ocurre la reacción. Observe lo que la prueba cubre y lo que no. La glucosa, la fructosa, la maltosa y la lactosa reducen el reactivo; la sacarosa no, porque ambos carbonos anoméricos están bloqueados en el enlace glucosídico, por lo que una heces cargadas de sacarosa daría un resultado negativo. La prueba indica que hay un azúcar reductor presente, pero nunca cuál.

Por qué el yodo adquiere un color azul negruzco al entrar en contacto con el almidón. La solución de Lugol contiene yodo disuelto en yoduro de potasio como ion triyoduro, I₃⁻. La amilosa, la fracción no ramificada del almidón, se enrolla en una hélice cuyo interior es justo lo suficientemente ancho como para albergar una cadena de iones triyoduro, y el complejo de transferencia de carga resultante absorbe en todo el espectro visible para dar el familiar azul negruzco. Por lo tanto, el color es un informe sobre la forma del polisacárido, no meramente de su presencia: la amilopectina y el glucógeno, que están muy ramificados y no pueden formar hélices largas, dan en su lugar un tono rojo-marrón, y las dextrinas —almidón parcialmente descompuesto— dan algo intermedio. Es por esto que un pocillo de color rojo-marrón debe interpretarse con cuidado. Es el aspecto que tiene el reactivo por sí solo, por lo que se califica como negativo, pero un estudiante debe saber que el almidón parcialmente digerido también puede dar un tono rojo-marrón y que la prueba pierde sensibilidad justo donde la biología se vuelve interesante.

Por qué Sudan IV y Biuret funcionan en absoluto. El Sudán IV es un lisocromo: un colorante que no sufre reacción química alguna, pero que es muchas veces más soluble en grasa que en agua, por lo que se distribuye en cualquier gotita lipídica presente y la tiñe de un color rojo anaranjado, mientras que el agua circundante permanece casi incolora. Por lo tanto, un resultado positivo es gotitas rojas aisladas, no un cambio de color uniforme, y leerla es más bien buscar una estructura en lugar de un tono. La reacción de Biuret es el tipo de prueba opuesto: es una auténtica reacción de coordinación, en la que el Cu²⁺ En una solución fuertemente alcalina, se quelata con los átomos de nitrógeno de al menos dos enlaces peptídicos adyacentes, dando lugar a un complejo de color violeta con un máximo de absorbancia cercano a los 540 nm. De ello se derivan dos consecuencias. Los aminoácidos libres y los dipéptidos no reaccionan, por lo que la prueba detecta los enlaces peptídicos en lugar del nitrógeno; y, dado que la intensidad del color violeta es proporcional a la concentración de enlaces peptídicos, esta es la única de las cuatro pruebas que se convierte directamente en un ensayo cuantitativo con un espectrofotómetro y una curva de calibración. El orden de adición es importante: el álcali debe estar presente antes que el cobre; de lo contrario, el cobre precipita en forma de hidróxido en lugar de formar el complejo.

Resumen de la asignación por rango de calificación

Grados 9–10

• Enfoque: las cuatro clases de nutrientes, el reactivo que permite detectarlas y la importancia de anotar el color antes de interpretarlo.
• Actividades Prepara y etiqueta la placa; realiza las cuatro pruebas en ambas muestras; anota el color observado en los ocho resultados en una tabla como la Tabla 2 antes de sacar ninguna conclusión; califica cada resultado como positivo o negativo según los criterios del protocolo; indica en una sola frase qué muestra no logra digerir P y enumera las medidas de seguridad que se deben aplicar al manipular una muestra de heces.

Undécimo grado

• Enfoque: la química detrás de cada color y las condiciones que requiere cada reacción.
• Actividades escribir la ecuación de Fehling e identificar qué se oxida y qué se reduce; explicar por qué el tubo debe superar los 70 °C y por qué la lectura dentro del tubo difiere de la consigna de la placa calefactora; explicar por qué la sacarosa da un resultado de Fehling negativo mientras que la lactosa da uno positivo; explicar el color azul-negro en términos de la hélice de amilosa y el triyoduro; explicar por qué el Sudan IV no necesita ninguna reacción para funcionar; y justificar el orden en que se añaden los dos reactivos de Biuret.

12.º curso / Nivel universitario

• Enfoque: el paso de una prueba de cribado cualitativo a una medición diagnóstica, y la interpretación de un patrón de resultados.
• Actividades describir cómo la reacción de Biuret se convierte en un ensayo cuantitativo de proteínas, incluyendo la curva de calibración, la longitud de onda utilizada y la razón por la que la absorbancia es proporcional a la concentración de enlaces peptídicos; proponer los controles positivos y negativos que le faltan a este protocolo e indicar qué descartaría cada uno; explicar por qué la aparición conjunta de positivos en Fehling y Biuret apunta a un fallo digestivo general y no a la falta de una sola enzima, y enumerar las pruebas adicionales que distinguirían una insuficiencia pancreática de un daño en la mucosa; evaluar la sensibilidad y la especificidad de cada una de las cuatro pruebas como cribado; y explicar por qué un resultado negativo no puede excluir una enfermedad.

Esenciales de laboratorio

Instrumentos

• Tubos de ensayo, 50 mL (2, etiquetados N y P)
• Gradilla para tubos de ensayo
• Goteros, 1 mL (8)
• Pipeta
• Vaso de precipitados (500 mL, lleno con 400 mL de agua de grifo)
• Microplaca (placa de pocillos, se han utilizado 6 pocillos)
• Placa calefactora, ajustada a 75 °C
• Agitador magnético y barra de agitación magnética
• Termómetro digital
• Varillas de vidrio
• Soporte y pinza universal
• Toalla de papel
• Papelera de reciclaje

Productos

• Muestra de heces normal (N)
• Muestra de heces del paciente (P)
• Reactivo de Fehling, soluciones A y B (10 mL de cada una por tubo)
• Solución de yodo de Lugol 2 %
• Solución de Sudán IV
• Reactivo de Biuret: hidróxido de sodio, NaOH 2,5 M
• Reactivo de Biuret — sulfato de cobre, CuSO₄ 0,0094 M
• Agua del grifo (400 ml para el baño)