Análisis de heces

Un examen coprológico es una de las pruebas más económicas e informativas en gastroenterología, debido a que lo que sale del cuerpo sin digerir indica con exactitud dónde ha fallado la digestión o la absorción. La grasa en las heces señala a un páncreas que no está liberando suficiente lipasa o a un revestimiento intestinal dañado; la proteína sin digerir apunta en la misma dirección; y los azúcares que deberían haberse descompuesto y absorbido en el intestino delgado aparecen en las heces cuando falta una enzima como la lactasa. Ninguno de estos hallazgos requiere equipos sofisticados para su detección. Cada clase de nutriente tiene una prueba de color que se ha utilizado durante más de un siglo: la solución de Fehling produce un precipitado rojo ladrillo en presencia de un azúcar reductor, el yodo se vuelve azul negruzco con el almidón, el Sudán IV tiñe las gotitas de lípidos de rojo y el cobre en solución alcalina adquiere un tono violeta con los enlaces peptídicos. En este laboratorio, usted realizará las cuatro pruebas en dos muestras lado a lado —la muestra N de una persona cuya digestión es normal y la muestra P de un paciente— y utilizará la diferencia entre las dos columnas de resultados para determinar qué clases de nutrientes el paciente no está logrando digerir. Tres de las pruebas se realizan en los pocillos de una microplaca; la prueba de Fehling requiere calor, por lo que se lleva a cabo en tubos de ensayo sujetos en un baño María sobre una placa de calentamiento.

Metas educativas

Familiarización con el entorno de laboratorio

• Identifica la microplaca, la gradilla, los goteros, la pipeta, la placa calefactores con su agitador magnético, el termómetro digital y el recipiente de recuperación, e indica la función de cada uno.
• Trabaje con dos muestras a la vez sin contaminarlas y limpie la varilla de vidrio entre cada agitación.

Manejo de material biológico

• Trate una muestra de heces como potencialmente infecciosa: use guantes en todo momento, no realice transferencias con la boca, y deseche el exceso de reactivo en el recipiente de recuperación en lugar del lavabo.
• Una placa de pocillos que ha contenido material biológico se desecha en lugar de lavarse y reutilizarse principalmente por razones de bioseguridad, prevención de la contaminación cruzada y dificultad de esterilización. Los residuos biológicos pueden adherirse firmemente al plástico, y la contaminación residual podría invalidar experimentos futuros. Además, el riesgo de exposición a patógenos para el personal de laboratorio hace que los plásticos de un solo uso sean la opción más segura y rentable en comparación con los protocolos de limpieza y validación complejos.

Manejo de muestras y diseño de un ensayo

• Mida 10 mL de cada muestra en su tubo de ensayo etiquetado y coloque gotas de cada una en los tres pocillos que llevan su etiqueta.
• Prepare una placa de modo que cada pozo pueda identificarse posteriormente y registre la disposición antes de agregar cualquier reactivo.

Funcionamiento de un baño de agua caliente

• Llene y configure un baño de agua con agitación, llévelo a su punto de ajuste y sujete un tubo de ensayo de modo que su contenido —no el baño— alcance la temperatura que la reacción necesita.
• Verifique la temperatura dentro del tubo con el termómetro digital en lugar de confiar en la configuración de la placa calefactora, y explique la diferencia entre las dos lecturas.

Uso de las cuatro pruebas cualitativas de nutrientes

• Indique, antes de agregar cualquier cosa, qué detecta cada reactivo y qué color cuenta como resultado positivo.
• Agregue los reactivos de Biuret en el orden correcto —primero el hidróxido de sodio y luego el sulfato de cobre— y explique por qué el álcali debe estar allí antes que el cobre.

Lectura, registro e interpretación de resultados

• Registre el color de los ocho resultados tal como se observen, y solo entonces decida si es positivo o negativo según los criterios establecidos.
• Extraiga una conclusión sobre el paciente a partir del patrón en las cuatro pruebas, y diga qué es lo que el patrón no establece.

Protocolo

Preparación de muestras de heces

1. Con la pipeta, mida 10 mL de muestra de heces normales.
2. Vierta la muestra de 10 mL en el tubo de ensayo N.
3. Usando un gotero, coloque de 5 a 10 gotas de la muestra de heces normales en cada uno de los 3 pozos identificados de la siguiente manera:

• Lugol Bien N
• Sudán IV
• Pozo N (Biuret)

4. Repita los pasos del 1 al 3 para la muestra de heces del paciente (P) llenando el tubo de ensayo y los 3 pocillos correspondientes.

Identificación de carbohidratos simples

1. Vierta 400 mL de agua de la llave en un vaso de precipitados de 500 mL.
2. Introduzca la barra de agitación magnética en el vaso de precipitados.
3. Coloque el vaso de precipitados en la placa calefactora y ajústela a 75 °C. Espere hasta que se alcance la temperatura.
4. Enciende el agitador magnético (botón izquierdo).
5. Use la pipeta para agregar 10 mL de Fehling A al tubo de ensayo N.
6. Usando la pipeta, agregue 10 mL de Fehling B al tubo de ensayo N.
7. Mezcle el contenido del tubo de ensayo N con un movimiento circular.
8. Coloque una pinza universal en el soporte izquierdo, por encima del vaso de precipitados de 500 mL preparado en el paso 1.
9. Fije el tubo de ensayo N a la pinza universal por encima del centro del vaso de precipitados.
10. Usando el termómetro digital, verifique que se alcance una temperatura superior a 70 °C en el tubo de ensayo.
11. Tome el tubo de ensayo N y vuelva a colocarlo en su lugar original en la gradilla para tubos de ensayo.
12. Mezcle el contenido del tubo de ensayo agitándolo durante unos segundos con la varilla de vidrio.
13. Usando la pipeta, agregue 10 mL de Fehling A al tubo de ensayo P.
14. Usando la pipeta, agregue 10 mL de Fehling B al tubo de ensayo P.
15. Mezcle el contenido del tubo de ensayo P con un movimiento circular.
16. Asegure el tubo de ensayo P a la pinza universal por encima del centro del vaso de precipitados.
17. Usando el termómetro digital, verifique que se alcance una temperatura superior a 70 °C en el tubo de ensayo.
18. Tome el tubo de ensayo P y vuelva a colocarlo en su lugar original en la gradilla para tubos de ensayo.
19. Mezcle el contenido del tubo de ensayo agitándolo durante unos segundos con la varilla de vidrio.
20. Baje la temperatura de la placa calefactora a 15 °C.
21. Apague el agitador magnético.

Las observaciones de la reacción de control se encuentran en la tabla de resultados.

Identificación de carbohidratos complejos

1. Usando el gotero, agregue de 5 a 10 gotas de Lugol en cada uno de los 2 pozos identificados de la siguiente manera:

• Lugol Bien N
• Puesto P (Lugol)

2. Vacíe el exceso del cuentagotas en el recipiente de recuperación.
3. Mezcle el contenido usando la varilla de vidrio. Advertencia: ¡asegúrese de limpiar bien la varilla de vidrio después de cada mezcla para evitar mezclar las sustancias!

Identificación de lípidos

1. Con el gotero, agregue de 5 a 10 gotas de Sudán IV en cada uno de los 2 pozos identificados de la siguiente manera:

• Sudán IV
• Pozo P (Sudán IV)

2. Vacíe el exceso del cuentagotas en el recipiente de recuperación.
3. Mezcle el contenido usando la varilla de vidrio.

Identificación de proteínas

1. Usando el gotero, coloque 1 gota de hidróxido de sodio (NaOH) en cada uno de los 2 pozos identificados de la siguiente manera:

• Pozo N (Biuret)
• Pozo P (Biuret)

2. Vacíe el exceso del cuentagotas en el recipiente de recuperación.
3. Use la pipeta para extraer 1 pipeta llena (10 mL) de sulfato de cobre (CuSO4).
4. Con la pipeta, dispense 1 mL de sulfato de cobre (CuSO4) en los pozos N y P (Biuret).
5. Vacíe el exceso de la pipeta en el recipiente de recuperación.
6. Mezcle el contenido usando la varilla de vidrio.

Las observaciones se encuentran en la tabla de resultados.

• Un resultado positivo para la presencia de carbohidratos simples dará lugar a un precipitado rojo ladrillo (Cu2O) en el tubo de ensayo (reacción de Fehling).
• Un resultado positivo para la presencia de carbohidratos complejos dará como resultado una coloración púrpura (complejo yodo-almidón) en el pocillo (prueba de Lugol).
• Un resultado positivo para la presencia de lípidos resultará en una coloración roja (complejo Sudán IV – lípido) en el pocillo (prueba de Sudán IV).
• Un resultado positivo para la presencia de proteínas dará lugar a una coloración púrpura (complejo de Biuret) en el pocillo (prueba de Biuret).

Resultados esperados

Cada una de las cuatro pruebas responde a una pregunta y cada una tiene un color positivo que debe conocerse antes de que se agregue el reactivo. La primera tabla establece qué se está buscando y qué cuenta como resultado.

La segunda tabla muestra los ocho resultados con la llamada que cada uno respalda.

La conclusión que respaldan los resultados. La muestra N da cuatro negativos: no se ha escapado nada detectable de la digestión, que es el resultado esperado para un intestino sano. La muestra P da dos positivos claros, azúcares reductores y proteína, en las mismas pruebas que dieron negativas para N y con los mismos reactivos de los mismos frascos, por lo que la diferencia es una propiedad de la muestra y no del método. La proteína sin digerir y el azúcar no absorbido que llegan juntos a las heces apuntan a una falla general de la digestión en el intestino delgado en lugar de la ausencia de una enzima específica —una insuficiencia pancreática, en la cual faltan varias enzimas digestivas a la vez, o un daño en el revestimiento intestinal que acorta el tiempo y la superficie disponibles para la absorción—. Lo que el resultado no hace es nombrar la enfermedad; indica qué procesos han fallado, y un médico lo seguiría con pruebas que miden en lugar de detectar.

Por qué el pozo positivo muestra tanto un color como un precipitado. Las dos señales en el pozo P son dos compuestos diferentes del mismo cobre. El tinte malva del líquido es el complejo de biuret mismo: en la solución alcalina creada por el hidróxido de sodio, Cu²⁺ es quelado por los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos adyacentes, y este complejo de cobre y péptido es soluble, por lo que tiñe todo el pocillo de manera uniforme en lugar de sedimentarse. El precipitado es hidróxido de cobre(II), formado dondequiera que un Cu²⁺ ion se encuentra con los iones hidróxido antes de encontrarse con un enlace peptídico: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un sólido azul pálido. El hidróxido de cobre(II) es uno de los hidróxidos comunes menos solubles, por lo que una vez que los enlaces peptídicos presentes han tomado su parte del cobre, el exceso sale de la solución en forma de este sólido. Las dos observaciones son, por tanto, una misma historia contada dos veces: la proteína reclama parte del cobre como un complejo malva soluble, y el hidróxido reclama el resto como un sólido.

Por qué la solución de Fehling necesita calor y qué es el precipitado rojo. El reactivo de Fehling es cobre(II) retenido en solución mediante tartrato en un medio fuertemente alcalino, razón por la cual se suministra en dos frascos y se mezcla únicamente en el momento de su uso. Un azúcar reductor porta un grupo aldehído libre, y en solución alcalina caliente dicho grupo se oxida a un carboxilato, mientras que el cobre(II) se reduce a cobre(I), el cual es insoluble y precipita en forma de óxido de cobre(I) de color rojo ladrillo: RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂La reacción es demasiado lenta para verla a temperatura ambiente, lo cual es la razón de ser del baño de maría: la placa calefactora se fija a 75 °C y el protocolo pide más de 70 °C dentro del tubo, ya que es ahí donde ocurre la reacción. Observe lo que la prueba abarca y lo que no. La glucosa, la fructosa, la maltosa y la lactosa reducen el reactivo; la sacarosa no, debido a que ambos carbonos anoméricos están bloqueados en el enlace glicosídico, por lo que unas heces cargadas de sacarosa darían un resultado negativo. La prueba indica que hay un azúcar reductor presente, pero nunca cuál.

Por qué el yodo se vuelve azul negruzco con el almidón. La solución de Lugol contiene yodo disuelto en yoduro de potasio como ion triyoduro, I₃⁻. La amilosa, la fracción no ramificada del almidón, se enrolla en una hélice cuyo interior es justo lo suficientemente ancho como para albergar una cadena de iones triyoduro, y el complejo de transferencia de carga resultante absorbe en todo el espectro visible para dar el familiar color azul negruzco. Por lo tanto, el color es un informe sobre la forma del polisacárido, no meramente de su presencia: la amilopectina y el glucógeno, que están muy ramificados y no pueden formar hélice largas, dan en su lugar un color rojo parduzco, y las dextrinas —almidón parcialmente descompuesto— dan un tono intermedio. Es por esto que un pocillo de color rojo parduzco debe interpretarse con cuidado. Es el aspecto que tiene el reactivo por sí solo, por lo que se califica como negativo, pero un estudiante debe saber que el almidón parcialmente digerido también puede dar rojo parduzco y que la prueba pierde sensibilidad justo donde la biología se vuelve interesante.

Por qué el Sudán IV y el Biuret funcionan en absoluto. Sudan IV es un lisocromo: un tinte que no sufre ninguna reacción química, sino que es muchas veces más soluble en grasa que en agua, por lo que se distribuye en cualquier gota de lípido presente y la tiñe de rojo anaranjado mientras que el agua circundante permanece casi incolora. Por lo tanto, un resultado positivo es gotas rojas discretas, no un cambio de color uniforme, y leerla es cuestión de buscar estructura en lugar de tonalidad. La reacción de Biuret es el tipo de prueba opuesto: es una auténtica reacción de coordinación, en la que el Cu²⁺ en solución fuertemente alcalina es quelado por los átomos de nitrógeno de al menos dos enlaces peptídicos adyacentes para dar un complejo violeta con un máximo de absorbancia cerca de 540 nm. De ello se desprenden dos consecuencias. Los aminoácidos libres y los dipéptidos no reaccionan, por lo que la prueba detecta enlaces peptídicos en lugar de nitrógeno; y debido a que la intensidad del violeta es proporcional a la concentración de enlaces peptídicos, esta es la única prueba de las cuatro que se convierte directamente en un ensayo cuantitativo con un espectrofotómetro y una curva estándar. El orden de adición importa: el álcali debe estar presente antes que el cobre, o el cobre precipita como hidróxido en lugar de formar el complejo.

Resumen de tareas por rango de calificaciones

Grado 9-10

• Enfoque las cuatro clases de nutrientes, el reactivo que revela a cada una y la disciplina de registrar un color antes de interpretarlo.
• Actividades: disponga y etiquete la placa; realice las cuatro pruebas en ambas muestras; anote el color observado de los ocho resultados en una tabla similar a la Tabla 2 antes de decidir cualquier cosa; califique cada resultado como positivo o negativo según los criterios del protocolo; indique en una oración qué es lo que la muestra P no logra digerir, y mencione las precauciones de seguridad que se aplican al manipular una muestra de heces.

Undécimo grado

• Enfoque la química detrás de cada color y las condiciones que cada reacción requiere.
• Actividades: Ecuación de Fehling: RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O (precipitado rojo ladrillo) + 3 H₂O Lo que se oxida es el grupo aldehído (del azúcar reductor) que se convierte en un ácido carboxílico (RCOO⁻). Lo que se reduce son los iones cúpricos (Cu²⁺, de color azul) que pasan a iones cuprosos en forma de óxido de cobre (I) (Cu₂O, de color rojo). El tubo debe superar los 70 °C porque esta temperatura es necesaria para proporcionar la energía de activación suficiente para que la reacción de oxidación-reducción del azúcar reductor con el cobre proceda a una velocidad observable. La lectura dentro del tubo difiere de la temperatura programada en la placa calefactora porque existe un gradiente térmico entre la superficie caliente de la placa, el vidrio del recipiente, el medio de calentamiento (si se usa baño María) y el líquido dentro del tubo, lo que causa pérdidas de calor y un retraso térmico en alcanzar el equilibrio. La sacarosa da un resultado negativo con Fehling porque es un disacárido no reductor; sus dos carbonos anoméricos están unidos entre sí en un enlace glucosídico (entre glucosa y fructosa), por lo que no tiene grupos aldehído o cetona libres para abrirse y actuar como agentes reductores. En cambio, la lactosa da un resultado positivo porque es un disacárido reductor que conserva un carbono anomérico libre capaz de mutar a su forma abierta y oxidarse. El color azul oscuro o negro en la prueba de yodo se explica porque las moléculas de yodo (en forma de aniones triiodide, I₃⁻) se alojan dentro de la estructura helicoidal de la amilosa (un componente del almidón), formando un complejo de inclusión por transferencia de carga que altera las propiedades de absorción de la luz. El colorante Sudan IV no necesita ninguna reacción química para funcionar porque es un tinte hidrófobo y lipofílico que se disuelve físicamente y se acumula en las grasas y lípidos debido a afinidades de polaridad (lo semejante disuelve a lo semejante). Los dos reactivos de Biuret deben añadirse en un orden específico (primero el hidróxido de sodio o potasio para alcalinizar el medio y proporcionar un pH básico, y luego el sulfato de cobre diluido) porque los iones de cobre solo pueden formar el complejo de coordinación violeta con los enlaces peptídicos de las proteínas en un entorno fuertemente alcalino.

12.º grado / Nivel universitario

• Enfoque el paso de un examen cualitativo a una medición diagnóstica, y la interpretación de un patrón de resultados.
• Actividades: describir cómo la reacción de Biuret se convierte en un ensayo cuantitativo de proteínas, incluyendo la curva estándar, la longitud de onda utilizada y la razón por la que la absorbancia es proporcional a la concentración del enlace peptídico; proponer los controles positivos y negativos que faltan en este protocolo e indicar qué descartaría cada uno; explicar por qué los resultados positivos simultáneos de Fehling y Biuret apuntan a una insuficiencia digestiva general en lugar de a la falta de una sola enzima, y enumerar las pruebas adicionales que permitirían distinguir la insuficiencia pancreática del daño a la mucosa; evaluar la sensibilidad y la especificidad de cada una de las cuatro pruebas como método de detección; y explicar por qué un resultado negativo no puede descartar una afección.

Elementos esenciales para el laboratorio

Instrumentos

• Tubos de ensayo de 50 mL (2, etiquetados N y P)
• Gradilla para tubos de ensayo
• Goteros, 1 mL (8)
• Pipeta
• Vaso de precipitados (500 mL, lleno con 400 mL de agua de la llave)
• Placa de microtitulación (placa de pozos, 6 pozos utilizados)
• Placa calefactora, configurada a 75 °C
• Agitador magnético y barra magnética de agitación
• Termómetro digital
• Varillas de vidrio
• Soporte y pinza universal
• Toalla de papel
• Papelera de reciclaje

Productos

• Muestra de heces normal (N)
• Muestra de heces del paciente (P)
• Reactivo de Fehling, soluciones A y B (10 mL de cada una por tubo)
• Solución de yodo de Lugol 2 %
• Solución de Sudán IV
• Reactivo de Biuret: hidróxido de sodio, NaOH 2,5 M
• Reactivo de Biuret: sulfato de cobre, CuSO₄ 0.0094 M
• Agua de la llave (400 mL para el baño)