028 – Stuhlanalyse

Eine Stuhluntersuchung gehört zu den günstigsten und aussagekräftigsten Tests in der Gastroenterologie, denn was den Körper unverdaut verlässt, gibt genaue Auskunft darüber, wo die Verdauung oder Resorption versagt hat. Fett im Stuhl weist auf eine Bauchspeicheldrüse hin, die nicht genügend Lipase liefert, oder auf eine geschädigte Darmschleimhaut; unverdautes Protein deutet in dieselbe Richtung; und Zucker, die im Dünndarm hätten aufgespalten und resorbiert werden müssen, tauchen im Stuhl auf, wenn ein Enzym wie Laktase fehlt. Keiner dieser Befunde erfordert zu seiner Erkennung hochentwickelte Geräte. Für jede Nährstoffklasse gibt es einen Farbnachweis, der seit weit über einem Jahrhundert verwendet wird: Fehlings Lösung bildet in Gegenwart eines reduzierenden Zuckers einen ziegelroten Niederschlag, Iod verfärbt sich bei Stärke blau-schwarz, Sudan IV färbt Lipidtropfen rot und Kupfer in alkalischer Lösung wird bei Peptidbindungen violett. In diesem Labor führen Sie alle vier Tests an zwei Proben nebeneinander durch – Probe N von einer Person mit normaler Verdauung und Probe P von einem Patienten – und nutzen den Unterschied zwischen den beiden Ergebnisspalten, um zu bestimmen, welche Nährstoffklassen der Patient nicht verdauen kann. Drei der Tests werden in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte durchgeführt; der Fehling-Test erfordert Hitze und wird daher in Reagenzgläsern durchgeführt, die in einem Wasserbad auf einer heißen Platte eingespannt sind.

Bildungsziele

Einarbeitung in die Laborumgebung

• Identifizieren Sie die Mikrotiterplatte, das Reagenzglasgestell, die Pipetten (Tropfpipetten), die Pipette, die Heizplatte mit ihrem Magnetrührer, das digitale Thermometer und den Sammelbehälter und geben Sie die Funktion jedes Einzelnen an.
• Arbeiten Sie mit zwei Proben gleichzeitig, ohne sie zu kontaminieren, und reinigen Sie den Glasstab nach jedem Umrühren.

Umgang mit biologischem Material

• Behandeln Sie eine Stuhlprobe als potenziell infektiös: durchgehend Handschuhe tragen, keine Aufnahme durch den Mund, überschüssiges Reagenz in den Auffangbehälter statt in das Waschbecken geben.
• Well-Platten, die biologisches Material enthalten haben, werden in der Regel entsorgt anstatt gereinigt und wiederverwendet, aus Gründen der Biosicherheit, des Risikos einer Kreuzkontamination, der Materialbeschaffenheit und der Kosteneffizienz. 1. **Biosicherheit und Kontaminationsrisiko:** Biologisches Material kann Pathogene (Viren, Bakterien), genetisches Material (DNA/RNA) oder Zellreste enthalten. Selbst nach gründlicher Reinigung können mikroskopische Rückstände verbleiben, die zukünftige Experimente verfälschen oder Labormitarbeiter und die Umwelt gefährden. 2. **Chemische Bindung:** Viele Standard-Well-Platten bestehen aus Kunststoffen (wie Polystyrol), die Proteine, Nukleinsäuren oder Testsubstanzen adsorbieren (an ihre Oberfläche binden) können. Diese Rückstände lassen sich oft durch Standard-Waschmethoden nicht vollständig entfernen. 3. **Integrität des Materials:** Die für die Reinigung notwendigen aggressiven Verfahren (wie Autoklavieren, starke Säuren oder Lösungsmittel) können den Kunststoff beschädigen, verformen oder seine optischen Eigenschaften verändern, was die Ergebnisse bei messbasierten Assays (z. B. Fluoreszenz- oder Absorptionsmessungen) beeinträchtigen würde. 4. **Wirtschaftlichkeit:** Well-Platten sind Massenprodukte, die industriell in sehr großen Stückzahlen und vergleichsweise günstig hergestellt werden. Der Arbeits-, Zeit- und Materialaufwand für eine validierte Reinigung und Sterilisation ist oft höher als die Anschaffungskosten neuer Einwegplatten.

Probenvorbereitung und Layout eines Assays

• Messen Sie von jeder Probe 10 mL in das entsprechend beschriftete Reagenzglas ab und geben Sie Tropfen jeder Probe in die drei Vertiefungen, die ihre Beschriftung tragen.
• Bereiten Sie eine Platte so vor, dass jedes Well im Nachhinein identifiziert werden kann, und dokumentieren Sie das Layout, bevor Sie Reagenzien hinzufügen.

Betrieb eines beheizten Wasserbades

• Füllen und temperieren Sie ein gerührtes Wasserbad, bringen Sie es auf den Sollwert und klemmen Sie ein Reagenzglas so ein, dass dessen Inhalt – nicht das Bad – die für die Reaktion erforderliche Temperatur erreicht.
• Überprüfen Sie die Temperatur im Inneren des Rohrs mit dem digitalen Thermometer, anstatt sich auf die Einstellung der Heizplatte zu verlassen, und erklären Sie den Unterschied zwischen den beiden Messwerten.

Verwendung der vier qualitativen Nährstoffnachweise

• Geben Sie vor jeder Zugabe an, was die einzelnen Reagenzien nachweisen und welche Farbe als positives Ergebnis gilt.
• Geben Sie die Biuret-Reagenzien in der richtigen Reihenfolge hinzu – zuerst Natronlauge, dann Kupfersulfat – und erklären Sie, warum die Lauge vor dem Kupfer vorhanden sein muss.

Lesen, Aufzeichnen und Interpretieren von Ergebnissen

• Erfassen Sie die Farbe aller acht Ergebnisse wie beobachtet und entscheiden Sie erst danach anhand der angegebenen Kriterien über positiv oder negativ.
• Ziehen Sie aus dem Muster der vier Tests eine Schlussfolgerung über den Patienten und geben Sie an, was das Muster nicht belegt.

Protokoll

Vorbereitung von Stuhlproben

1. Messen Sie mit der Pipette 10 mL der normalen Stuhlprobe ab.
2. Gießen Sie die 10-ml-Probe in Reagenzglas N.
3. Geben Sie mit einer Tropfpipette 5 bis 10 Tropfen der normalen Stuhlprobe in jede der 3 wie folgt gekennzeichneten Vertiefungen:

• Vertiefung N (Lugol)
• Vertiefung N (Sudan IV)
• Vertiefung N (Biuret)

4. Wiederholen Sie die Schritte 1 bis 3 für die Patientenstuhlprobe (P), indem Sie das Teströhrchen und die 3 dazugehörigen Vertiefungen füllen.

Identifizierung von einfachen Kohlenhydraten

1. Füllen Sie 400 ml Leitungswasser in einen 500-ml-Becher.
2. Führen Sie den Magnetrührstab in den Becher ein.
3. Stellen Sie den Becher auf die Heizplatte und stellen Sie ihn auf 75°C ein. Warten Sie, bis die Temperatur erreicht ist.
4. Schalten Sie den Magnetrührer ein (linke Taste).
5. Füllen Sie mit der Pipette 10 ml Fehling A in das Reagenzglas N.
6. Füllen Sie mit der Pipette 10 ml von Fehling B in das Reagenzglas N.
7. Die Inhalte des Reagenzglases N mit kreisender Bewegung mischen.
8. Bringen Sie eine Universalklemme am linken Stativ, oberhalb des in Schritt 1 vorbereiteten 500-ml-Becherglases, an.
9. Befestigen Sie das Reagenzglas N an der Universalklemme über der Mitte des Becherglases.
10. Überprüfen Sie mit dem digitalen Thermometer, ob im Reagenzglas eine Temperatur von über 70 °C erreicht wird.
11. Nehmen Sie das Reagenzglas N und stellen Sie es zurück an seinen ursprünglichen Platz im Reagenzglasständer.
12. Mischen Sie den Inhalt des Reagenzglases, indem Sie es einige Sekunden lang mit dem Glasstab schütteln.
13. Mit der Pipette 10 ml Fehling A in das Reagenzglas P pipettieren.
14. Mit der Pipette 10 ml Fehling B in das Reagenzglas P geben.
15. Mischen Sie den Inhalt des Reagenzglases P mit kreisenden Bewegungen.
16. Befestigen Sie das Reagenzglas P an der Universalklemme über der Mitte des Becherglases.
17. Überprüfen Sie mit dem digitalen Thermometer, ob im Reagenzglas eine Temperatur von über 70 °C erreicht wird.
18. Nehmen Sie das Reagenzglas P und stellen Sie es zurück an seinen ursprünglichen Platz im Reagenzglasständer.
19. Mischen Sie den Inhalt des Reagenzglases, indem Sie es einige Sekunden lang mit dem Glasstab schütteln.
20. Senken Sie die Temperatur der Heizplatte auf 15°C.
21. Schalten Sie den Magnetrührer aus.

Die Beobachtungen der Kontrollreaktion sind in der Ergebnistabelle zu finden.

Nachweis von komplexen Kohlenhydraten

1. Geben Sie mit der Tropfpipette 5 bis 10 Tropfen Lugol in jede der 2 wie folgt gekennzeichneten Vertiefungen:

• Vertiefung N (Lugol)
• Vertiefung P (Lugol)

2. Das überschüssige Material aus der Pipette in den Auffangbehälter leeren.
3. Mischen Sie den Inhalt mit dem Glasstab. Achtung: Reinigen Sie den Glasstab nach jedem Mischen gründlich, um ein Vermischen der Substanzen zu vermeiden!

Identifizierung von Lipiden

1. Geben Sie mit der Tropfpipette 5 bis 10 Tropfen Sudan IV in jede der 2 wie folgt gekennzeichneten Vertiefungen:

• Vertiefung N (Sudan IV)
• Vertiefung P (Sudan IV)

2. Das überschüssige Material aus der Pipette in den Auffangbehälter leeren.
3. Die Inhalte mit dem Glasstab vermischen.

Identifizierung von Proteinen

1. Geben Sie mit der Tropfpipette 1 Tropfen Natriumhydroxid (NaOH) in jede der 2 wie folgt gekennzeichneten Vertiefungen:

• Vertiefung N (Biuret)
• Vertiefung P (Biuret)

2. Das überschüssige Material aus der Pipette in den Auffangbehälter leeren.
3. Ziehen Sie mit der Pipette 1 volle Pipette (10 mL) Kupfersulfat (CuSO4) auf.
4. Geben Sie mit der Pipette 1 mL Kupfersulfat (CuSO4) in die Vertiefungen N und P (Biuret).
5. Leeren Sie die überschüssige Flüssigkeit von der Pipette in den Auffangbehälter.
6. Die Inhalte mit dem Glasstab vermischen.

Die Beobachtungen finden sich in der Ergebnistabelle.

• Ein positives Ergebnis für das Vorhandensein einfacher Kohlenhydrate zeigt sich als ziegelroter Niederschlag (Cu2O) im Reagenzglas (Fehling-Reaktion).
• Ein positives Ergebnis für die Anwesenheit von komplexen Kohlenhydraten führt zu einer violetten Färbung (Iod-Stärke-Komplex) in der Vertiefung (Lugol-Test).
• Ein positives Ergebnis für das Vorhandensein von Lipiden zeigt sich als rote Färbung (Sudan-IV-Lipid-Komplex) in der Vertiefung (Sudan-IV-Test).
• Ein positives Ergebnis für die Anwesenheit von Proteinen führt zu einer lilafarbenen Färbung (Biuret-Komplex) in der Vertiefung (Biuret-Test).

Erwartete Ergebnisse

Jeder der vier Tests beantwortet eine Frage und hat jeweils eine positive Farbe, die bekannt sein muss, bevor das Reagenz hineingegeben wird. Die erste Tabelle legt dar, wonach gesucht wird und was als Ergebnis zählt.

Die zweite Tabelle zeigt die acht Ergebnisse mit dem jeweiligen Aufruf, den sie unterstützen.

Die Schlussfolgerung, die die Ergebnisse stützen. Probe N liefert vier negative Ergebnisse: Es ist nichts Nachweisbares der Verdauung entgangen, was der erwartete Befund für einen gesunden Darm ist. Probe P liefert zwei klare positive Ergebnisse, reduzierende Zucker und Protein, bei denselben Tests, die für N negativ waren, und mit denselben Reagenzien aus denselben Flaschen, sodass der Unterschied eine Eigenschaft der Probe und nicht der Methode ist. Unverdaute Proteine und nicht resorbierter Zucker, die zusammen im Stuhl ankommen, deuten eher auf ein generelles Versagen der Verdauung im Dünndarm hin als auf das Fehlen eines spezifischen Enzyms – auf eine Pankreasinsuffizienz, bei der mehrere Verdauungsenzyme gleichzeitig fehlen, oder auf eine Schädigung der Darmschleimhaut, die die für die Resorption verfügbare Zeit und Oberfläche verkürzt. Was das Ergebnis nicht tut, ist die Krankheit zu benennen; es sagt aus, welche Prozesse versagt haben, und ein Kliniker würde darauf Tests folgen lassen, die messen statt nur nachzuweisen.

Warum die positive Vertiefung sowohl eine Farbe als auch einen Niederschlag zeigt. Die beiden Signale in Vertiefung P sind zwei verschiedene Verbindungen desselben Kupfers. Der malvenfarbene Ton der Flüssigkeit ist der Biuret-Komplex selbst: In der durch das Natriumhydroxid erzeugten alkalischen Lösung wird Cu²⁺ von den Stickstoffatomen benachbarter Peptidbindungen chelatisiert, und dieser Kupfer-Peptid-Komplex ist löslich, sodass er die ganze Vertiefung gleichmäßig färbt, anstatt sich abzusetzen. Der Niederschlag ist Kupfer(II)-hydroxid, das überall dort entsteht, wo ein Cu²⁺ Ion auf Hydroxid-Ionen trifft, bevor es auf eine Peptidbindung trifft: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), ein blassblauer Feststoff. Kupfer(II)-hydroxid gehört zu den am wenigsten löslichen gängigen Hydroxiden, sodass, sobald die vorhandenen Peptidbindungen ihren Anteil an Kupfer aufgenommen haben, der Überschuss die Lösung als dieser Feststoff verlässt. Die beiden Beobachtungen sind daher dieselbe Geschichte, zweimal erzählt: Das Protein beansprucht einen Teil des Kupfers als löslichen malvenfarbenen Komplex, und das Hydroxid beansprucht den Rest als Feststoff.

Warum Fehlings Lösung Hitze benötigt und was der rote Niederschlag ist. Fehlings Reagenz ist Kupfer(II), das durch Tartrat in starker Lauge in Lösung gehalten wird, weshalb es in zwei Flaschen geliefert und erst unmittelbar vor Gebrauch gemischt wird. Ein reduzierender Zucker trägt eine freie Aldehydgruppe, und in heißer alkalischer Lösung wird diese Gruppe zu einem Carboxylat oxidiert, während das Kupfer(II) zu Kupfer(I) reduziert wird, das unlöslich ist und als ziegelrotes Kupfer(I)-oxid ausfällt: RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O. Die Reaktion verläuft bei Raumtemperatur viel zu langsam, was der eigentliche Grund für das Wasserbad ist: Die Heizplatte ist auf 75 °C eingestellt und das Protokoll verlangt mehr als 70 °C im Rohr, da dort die Reaktion stattfindet. Beachten Sie, was der Test abdeckt und was nicht. Glucose, Fructose, Maltose und Lactose reduzieren alle das Reagenz; Saccharose tut dies nicht, da beide anomeren Kohlenstoffatome in der glykosidischen Bindung eingeschlossen sind, sodass ein mit Saccharose angereicherter Stuhl ein negatives Ergebnis liefern würde. Der Test besagt, dass ein reduzierender Zucker vorhanden ist, aber niemals welcher.

Warum sich Iod mit Stärke blau-schwarz färbt. Lugolsche Lösung enthält Jod, gelöst in Kaliumjodid als Trijodid-Ion, I₃⁻. Amylose, der unverzweigte Anteil der Stärke, windet sich zu einer Helix, deren Inneres gerade breit genug ist, um eine Kette von Trijodidionen aufzunehmen, und der resultierende Ladungstransferkomplex absorbiert über das sichtbare Spektrum hinweg, was das vertraute Blauschwarz ergibt. Die Farbe ist daher ein Bericht über die Form des Polysaccharids, nicht bloß auf dessen Anwesenheit ab: Amylopektin und Glykogen, die stark verzweigt sind und keine langen Helices bilden können, ergeben stattdessen Rotbraun, und Dextrine – teilweise abgebauter Stärke – ergeben etwas dazwischen. Aus diesem Grund muss ein rotbraunes Vertiefung sorgfältig interpretiert werden. So sieht das Reagenz von Natur aus aus, weshalb es als negativ bewertet wird, aber ein Studierender sollte wissen, dass teilweise verdaute Stärke ebenfalls rotbraun anzeigen kann und der Test genau dort an Empfindlichkeit verliert, wo die Biologie interessant wird.

Warum Sudan IV und Biuret überhaupt funktionieren. Sudan IV ist ein Lysochrom: ein Farbstoff, der keinerlei chemische Reaktion eingeht, sich jedoch in Fett um ein Vielfaches besser als in Wasser löst, sodass er sich in jedem vorhandenen Lipidtropfen anreichert und diesen rot-orange färbt, während das umgebende Wasser nahezu farblos bleibt. Ein positives Ergebnis ist daher diskrete rote Tropfen, keine einheitliche Farbänderung, und das Ablesen besteht darin, nach Struktur statt nach Farbton zu suchen. Die Biuret-Reaktion ist die entgegengesetzte Art von Test: Sie ist eine echte Koordinationsreaktion, bei der Cu²⁺ wird in stark alkalischer Lösung von den Stickstoffatomen von mindestens zwei benachbarten Peptidbindungen chelatisiert, um einen violetten Komplex mit einem Absorptionsmaximum bei etwa 540 nm zu bilden. Daraus ergeben sich zwei Konsequenzen. Freie Aminosäuren und Dipeptide reagieren nicht, sodass der Test eher Peptidbindungen als Stickstoff anzeigt; und da die Intensität der violetten Färbung proportional zur Konzentration der Peptidbindungen ist, ist dies der einzige der vier Tests, der sich mit einem Spektralphotometer und einer Standardkurve direkt in einen quantitativen Assay umwandeln lässt. Die Reihenfolge der Zugabe ist wichtig: Das Alkali muss vor dem Kupfer vorhanden sein, da das Kupfer sonst als Hydroxid ausfällt, anstatt den Komplex zu bilden.

Zusammenfassung der Aufgaben nach Klassenstufen

9. bis 10. Klasse

• Fokus die vier Nährstoffklassen, das Reagenz, das jede einzelne nachweist, und die Disziplin, eine Farbe zu protokollieren, bevor man sie interpretiert.
• Aktivitäten: Bereiten Sie die Platte vor und beschriften Sie sie; führen Sie die vier Tests an beiden Proben durch; notieren Sie die beobachtete Farbe aller acht Ergebnisse in einer Tabelle wie Tabelle 2, bevor Sie etwas entscheiden; bewerten Sie jedes Ergebnis anhand der Kriterien im Protokoll als positiv oder negativ; geben Sie in einem Satz an, was Probe P nicht verdauen kann, und nennen Sie die Sicherheitsvorkehrungen, die beim Umgang mit einer Stuhlprobe gelten.

11. Klasse

• Fokus die Chemie hinter jeder Farbe und die Bedingungen, die die jeweilige Reaktion erfordert.
• Aktivitäten: die Fehling-Gleichung aufstellen und angeben, was oxidiert und was reduziert wird; erklären, warum das Röhrchen 70 °C überschreiten muss und warum der Messwert im Röhrchen vom Sollwert der Heizplatte abweicht; erklären, warum Saccharose ein negatives Fehling-Ergebnis liefert, Lactose dagegen ein positives; die blauschwarze Farbe mit der Amylose-Helix und dem Triiodid erklären; erklären, warum Sudan IV keine Reaktion benötigt, um zu funktionieren; und die Reihenfolge begründen, in der die beiden Biuret-Reagenzien zugegeben werden.

12. Klasse / College-Niveau

• Fokus der Schritt von einem qualitativen Screening zu einer diagnostischen Messung und die Interpretation eines Ergebnismusters.
• Aktivitäten: beschreiben, wie die Biuret-Reaktion in einen quantitativen Proteinnachweis überführt wird, einschließlich der Kalibrierkurve, der verwendeten Wellenlänge und des Grundes, warum die Absorbanz proportional zur Konzentration der Peptidbindungen ist; die Positiv- und Negativkontrollen vorschlagen, die diesem Protokoll fehlen, und angeben, was jede ausschließen würde; erklären, warum gleichzeitig positive Fehling- und Biuret-Ergebnisse auf ein allgemeines Verdauungsversagen statt auf das Fehlen eines einzelnen Enzyms hindeuten, und die weiteren Untersuchungen nennen, die eine Pankreasinsuffizienz von einer Schleimhautschädigung unterscheiden würden; die Sensitivität und Spezifität jedes der vier Tests als Screening bewerten; und erklären, warum ein negatives Ergebnis eine Erkrankung nicht ausschließen kann.

Labor-Grundausstattung

Instrumente

• Reagenzgläser, 50 ml (2, beschriftet mit N und P)
• Reagenzglashalter
• Tropfer, 1 ml (8)
• Pipette
• Becherglas (500 ml, gefüllt mit 400 ml Leitungswasser)
• Mikrotiterplatte (Well-Platte, 6 Wells verwendet)
• Heizplatte, eingestellt auf 75 °C
• Magnetrührer und Magnetrührstab
• Digitalthermometer
• Glasstäbe
• Stativ und Universalklemme
• Küchenrolle
• Papierkorb

Produkte

• Normaler Stuhl (N)
• Stuhlprobe des Patienten (P)
• Fehlings Reagenz, Lösungen A und B (je 10 ml pro Reagenzglas)
• Lugols Jodlösung 2 %
• Sudan IV-Lösung
• Biuret-Reagenz — Natriumhydroxid, NaOH 2,5 M
• Biuretreagenz — Kupfersulfat, CuSO₄ 0,0094 M
• Leitungswasser (400 ml für das Bad)