028 – Analýza stolice

Vyšetření stolice patří k nejlevnějším a nejvýpovědnějším testům v gastroenterologii, protože to, co opouští tělo nestrávené, přesně vypovídá o tom, kde selhalo trávení nebo vstřebávání. Tuk ve stolici poukazuje na slinivku břišní, která nevydává dostatek lipázy, nebo na poškozenou střevní sliznici; nestrávené bílkoviny ukazují týmž směrem; a cukry, které měly být rozloženy a vstřebány v tenkém střevě, se ve stolici objevují v případě, že chybí enzym, jako je laktáza. K odhalení žádného z těchto nálezů není potřeba složité vybavení. Každá třída živin má barevný test, který se používá již déle než sto let: Fehlingovo činidlo vytváří v přítomnosti redukujícího cukru cihlově červenou sraženinu, jod seškrobem modročerná, Sudan IV barví kapénky lipidu červeně a měď v alkalickém roztoku se fialově zabarvuje s peptidovými vazbami. V této laboratoři provedete všechny čtyři testy na dvou vzorcích vedle sebe – vzorek N pochází od osoby s normálním trávením a vzorek P od pacienta – a na základě rozdílu mezi oběma sloupci výsledků určíte, které třídy živin pacient nedokáže strávit. Tři z testů se provádějí v jamkách mikrotitrační destičky; Fehlingův test vyžaduje teplo, a proto se provádí v zkumavkách upevněných ve vodní lázni na plotýnce.

Vzdělávací cíle

Seznámení s laboratorním prostředím

• Identifikujte mikrotitrační destičku, stojan na zkumavky, kapátka, pipetu, varnou desku s magnetickým míchadlem, digitální teploměr a sběrnou nádobu a uveďte roli každého z nich.
• Pracujte se dvěma vzorky současně bez jejich vzájemné kontaminace a skleněnou tyčinku mezi každým mícháním očistěte.

Nakládání s biologickým materiálem

• Se vzorkem stolice zacházejte jako s potenciálně infekčním: po celou dobu používejte rukavice, nepoužívejte pipetování ústy, přebytečné činidlo vlévejte do sběrné nádoby, nikoliv do výlevky.
• Vysvětlete, proč se jamková destička (well plate), která obsahovala biologický materiál, raději likviduje, než aby se umyla a znovu použila.

Manipulace se vzorky a uspořádání testu

• Odměřte 10 mL každého vzorku do označené zkumavky a kápněte kapky každého z nich do tří jamek, které nesou jeho označení.
• Připravte destičku tak, aby bylo možné každou jamku následně identifikovat, a před přidáním jakéhokoli činidla zaznamenejte její uspořádání.

Provoz ohřívané vodní lázně

• Naplňte a nastavte míchanou vodní lázeň, přiveďte ji na požadovanou teplotu a upevněte zkumavku tak, aby její obsah – nikoliv lázeň – dosáhl teploty potřebné pro reakci.
• Zkontrolujte teplotu uvnitř zkumavky pomocí digitálního teploměru namísto spoléhání se na nastavení plotýnky a vysvětlete rozdíl mezi oběma naměřenými hodnotami.

Použití čtyř kvalitativních zkoušek živin

• Uveďte, než cokoli přidáte, co jednotlivá činidla detekují a jaká barva se považuje za pozitivní výsledek.
• Přidejte biuretová činidla ve správném pořadí – nejprve hydroxid sodný, pak síran měďnatý – a vysvětlete, proč tam alkálie musí být dříve než měď.

Čtení, zaznamenávání a interpretace výsledků

• Zaznamenejte barvu všech osmi výsledků tak, jak byly pozorovány, a teprve poté rozhodněte o pozitivním nebo negativním výsledku vůči stanoveným kritériím.
• Udělejte závěr o pacientovi na základě vzorce napříč čtyřmi testy a uveďte, co tento vzorec nestanoví.

Protokol

Příprava vzorků stolice

1. Pipetou odměřte 10 mL normálního vzorku stolice.
2. Nalijte 10ml vzorku do zkumavky N.
3. Pomocí kapátka naneste 5 až 10 kapek normálního vzorku stolice do každé ze 3 jamek označených takto:

• Jamka N (Lugol)
• Jamka N (Sudan IV)
• Jamka N (Biuret)

4. Zopakujte kroky 1 až 3 pro vzorek stolice pacienta (P) naplněním zkumavky a 3 odpovídajících jamek.

Identifikace jednoduchých sacharidů

1. Nalijte 400 ml kohoutkové vody do 500 ml kádinky.
2. Vložte magnetickou míchací tyčinku do kádinky.
3. Položte kádinku na plotýnku a nastavte na 75 °C. Počkejte, až se teploty dosáhne.
4. Zapněte magnetické míchadlo (levé tlačítko).
5. Pomocí pipety přidejte do zkumavky N 10 ml Fehlingova roztoku A.
6. Pomocí pipety přidejte 10 ml Fehlingovy zkoušky B do zkumavky N.
7. Zamíchejte obsah zkumavky N kruhovým pohybem.
8. Umístěte univerzální svorku na levý stojan, nad 500 ml kádinku připravenou v kroku 1.
9. Upevněte zkumavku N do univerzální svorky nad středem kádinky.
10. Pomocí digitálního teploměru ověřte, zda je ve zkumavce dosaženo teploty vyšší než 70 °C.
11. Vezměte zkumavku N a vraťte ji na její původní místo ve stojanu na zkumavky.
12. Smíchejte obsah zkumavky protřepáním skleněné tyčinky po dobu několika sekund.
13. Pomocí pipety přidejte 10 ml Fehlingovy zkoušky A do zkumavky P.
14. Pomocí pipety přidejte 10 ml Fehlingova roztoku B do zkumavky P.
15. Smíchejte obsah zkumavky P krouživým pohybem.
16. Upevněte zkumavku P do univerzální svorky nad středem kádinky.
17. Pomocí digitálního teploměru ověřte, zda je ve zkumavce dosaženo teploty vyšší než 70 °C.
18. Vezměte zkumavku P a vraťte ji na její původní místo ve stojanu na zkumavky.
19. Smíchejte obsah zkumavky protřepáním skleněné tyčinky po dobu několika sekund.
20. Snižte teplotu plotýnky na 15 °C.
21. Vypni magnetické míchadlo.

Pozorování kontrolní reakce jsou uvedena v tabulce výsledků.

Identifikace komplexních sacharidů

1. Pomocí kapátka přidejte 5 až 10 kapek Lugolova roztoku do každé ze 2 jamek označených takto:

• Jamka N (Lugol)
• Jamka P (Lugol)

2. Vylijte přebytek z kapátka do sběrné nádoby.
3. Promíchejte obsah skleněnou tyčinkou. Upozornění: po každém míchání skleněnou tyčinku dobře očistěte, aby nedošlo ke smíchání látek!

Identifikace lipidů

1. Pomocí kapátka přidejte 5 až 10 kapek Sudanu IV do každé ze 2 jamek označených takto:

• Jamka N (Sudan IV)
• Jamka P (Sudan IV)

2. Vylijte přebytek z kapátka do sběrné nádoby.
3. Obsah promíchejte skleněnou tyčinkou.

Identifikace proteinů

1. Pomocí kapátka naneste 1 kapku hydroxidu sodného (NaOH) do každé ze 2 jamek označených takto:

• Jamka N (Biuret)
• Jamka P (Biuret)

2. Vylijte přebytek z kapátka do sběrné nádoby.
3. Pomocí pipety nasajte 1 plnou pipetu (10 mL) síranu měďnatého (CuSO4).
4. Pomocí pipety naneste 1 mL síranu měďnatého (CuSO4) do jamek N a P (Biuret).
5. Vylijte přebytečnou tekutinu z pipety do sběrné nádoby.
6. Obsah promíchejte skleněnou tyčinkou.

Pozorování jsou uvedena v tabulce výsledků.

• Pozitivní výsledek na přítomnost jednoduchých sacharidů se projeví cihlově červenou sraženinou (Cu2O) ve zkumavce (Fehlingova reakce).
• Pozitivní výsledek pro přítomnost komplexních sacharidů se projeví fialovým zbarvením (jód-škrobový komplex) ve jamce (Lugolův test).
• Pozitivní výsledek na přítomnost lipidů se projeví červeným zbarvením (komplex Sudan IV – lipidy) v jamce (test Sudan IV).
• Pozitivní výsledek pro přítomnost bílkovin se projeví zbarvením do fialova (biuretový komplex) ve jamce (biuretový test).

Předvídané výsledky

Každý ze čtyř testů odpovídá na jednu otázku a každý má pozitivní barvu, kterou je třeba znát předtím, než se činidlo přidá. První tabulka uvádí, co se sleduje a co se považuje za výsledek.

Druhá tabulka uvádí osm výsledků s voláním, které každý z nich podporuje.

Závěr, který výsledky podporují. Vzorek N vykazuje čtyři negativní výsledky: úniku trávení uniklo nic detekovatelného, což je očekávaný nález pro zdravé střevo. Vzorek P vykazuje dva jasně pozitivní výsledky, redukující cukry a bílkoviny, při stejných testech, které vyšly pro N negativní, a se stejnými činidly ze stejných lahviček, takže rozdíl je vlastností vzorku, nikoli metody. Nestrávená bílkovina a nevstřebaný cukr, které se dostávají do stolice společně, poukazují na celkové selhání trávení v tenkém střevě, spíše než na absenci jednoho specifického enzymu – na pankreatickou insuficienci, při níž chybí několik trávicích enzymů najednou, nebo na poškození střevní sliznice, které zkracuje dobu a povrch dostupný pro vstřebávání. Výsledek však neříká jméno onemocnění; říká, které procesy selhaly, a klinický lékař by na něj navázal testy, které měří, místo aby pouze detekovaly.

Proč pozitivní jamka ukazuje jak barvu, tak sraženinu. Oba signály v jamce P jsou dvě různé sloučeniny téže mědi. Fialový nádech kapaliny je samotný biuretový komplex: v alkalickém roztoku vytvořeném hydroxidem sodným je Cu²⁺ chelátován atomy dusíku sousedních peptidových vazeb a tento měďnato-peptidový komplex je rozpustný, takže zbarvuje celou jamku rovnoměrně, místo aby se usazoval. Sraženina je hydroxid měďnatý, tvořící se všude tam, kde iont Cu²⁺ se setká s hydroxidovými ionty dříve, než se setká s peptidovou vazbou: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), bledě modrá pevná látka. Hydroxid měďnatý patří mezi nejméně rozpustné z běžných hydroxidů, takže jakmile přítomné peptidové vazby spotřebují svůj podíl mědi, přebytek opouští roztok v podobě této pevné látky. Obě pozorování jsou tedy jedním příběhem vyprávěným dvakrát: protein si nárokuje část mědi jako rozpustný fialový komplex a hydroxid si nárokuje zbytek jako pevnou látku.

Proč Fehlingovo činidlo potřebuje teplo a co je tou červenou sraženinou. Fehlingovo činidlo je měďnatý kationt v roztoku udržovaný vinanem v silném alkáliu, proto se dodává ve dvou lahvičkách a míchá se až v okamžiku použití. Redukující cukr nese volnou aldehydovou skupinu a v horkém alkalickém roztoku se tato skupina oxiduje na karboxylát, zatímco měďnaté ionty se redukují na měďné, které jsou nerozpustné a vylučují se jako cihlově červený oxid měďný: RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O. Reakce je za laboratorní teploty příliš pomalá na to, aby byla vidět, což je hlavní důvod pro použití vodní lázně: plotýnka je nastavená na 75 °C a protokol vyžaduje více než 70 °C uvnitř trubice, protože tam probíhá reakce. Všimněte si, co test pokrývá a co ne. Glukóza, fruktóza, maltóza a laktóza činidlo redukují; sacharóza nikoliv, protože oba její anomerní uhlíky jsou vázány v glykosidické vazbě, takže stolice obsahující sacharóza by dala negativní výsledek. Test říká, že je přítomen redukující cukr, ale nikdy ne, který to je.

Proč jód zmodralo-černá se škrobem. Lugolův roztok obsahuje jód rozpuštěný v jodidu draselném ve formě trijodidového iontu, I₃⁻. Amyloza, nevětvená frakce škrobu, se stáčí do šroubovice, jejíž vnitřek je tak akorát široký, aby udržel řetězec jodidových iontů, a vzniklý komplex s přenosem náboje absorbuje v celém viditelném spektru, což dává známou modro-černou barvu. Barva je tedy zprávou o tvar polysacharidu, nikoli pouze na jeho přítomnosti: amylopektin a glykogen, které jsou silně větvené a nemohou tvořit dlouhé šroubovice, dávají místo toho červenohnědou barvu, a dextriny – částečně rozložený škrob – dávají něco mezi tím. To je důvod, proč je třeba červenohnědou jamku vyhodnotit pečlivě. Je to to, jak činidlo vypadá samo o sobě, takže se hodnotí jako negativní, ale student by měl vědět, že částečně trávený škrob může také vykazovat červenohnědou barvu a že test ztrácí citlivost právě tam, kde se biologie stává zajímavou.

Proč Sudan IV a Biuret vůbec fungují. Sudan IV je lysochrom: barvivo, které nepodléhá žádné chemické reakci, ale je mnohonásobně rozpustnější v tuku než ve vodě, takže se rozděluje do přítomných lipidových kapének a barví je červenooranžově, zatímco okolní voda zůstává téměř bezbarvá. Pozitivní výsledek je proto diskrétní červené kapky, nejedná se o jednotnou změnu barvy a jeho čtení je záležitostí hledání struktury spíše než odstínu. Biuretová reakce je opačným typem testu: je to skutečná koordinační reakce, při které Cu²⁺ ve silně alkalickém roztoku je chelatován atomy dusíku nejméně dvou sousedních peptidových vazeb za vzniku fialového komplexu s absorpčním maximem kolem 540 nm. Z toho plynou dva důsledky. Volné aminokyseliny a dipeptidy nereagují, takže test vypovídá o peptidových vazbách spíše než o dusíku; a protože intenzita fialového zbarvení je úměrná koncentraci peptidových vazeb, je to jediný ze čtyř testů, který se přímo mění v kvantitativní stanovení pomocí spektrofotometru a kalibrační křivky. Na pořadí přidávání závisí: alkálie musí být přítomna dříve než měď, jinak se měď místo vytvoření komplexu srazí ve formě hydroxidu.

Shrnutí úkolů podle věkové kategorie

9. až 10. ročník

• Zaměření čtyři třídy živin, činidlo, které odhaluje každou z nich, a zásada zaznamenání barvy před její interpretací.
• Aktivity: Rozložte a popište misku; proveďte všechny čtyři testy na obou vzorcích; zapište pozorovanou barvu všech osmi výsledků do tabulky, jako je tabulka 2, dříve než cokoliv rozhodnete; ohodnoťte každý výsledek jako pozitivní nebo negativní podle kritérií v protokolu; jednou větou uveďte, co vzorek P nedokáže strávit, a vyjmenujte bezpečnostní opatření, která platí pro manipulaci se vzorkem stolice.

11. ročník

• Zaměření chemie každé barvy a podmínky, které každá reakce vyžaduje.
• Aktivity: napsat Fehlingovu rovnici a určit, co se oxiduje a co redukuje; vysvětlit, proč musí zkumavka přesáhnout 70 °C a proč se údaj uvnitř zkumavky liší od nastavené teploty plotýnky; vysvětlit, proč sacharóza dává negativní Fehlingův výsledek, zatímco laktóza pozitivní; objasnit modročernou barvu pomocí šroubovice amylózy a trijodidu; vysvětlit, proč Sudan IV nepotřebuje k fungování žádnou reakci; a zdůvodnit pořadí, v němž se přidávají dvě biuretová činidla.

12. ročník / Úroveň college

• Zaměření krok od kvalitativního screeningu k diagnostickému měření a interpretace vzorce výsledků.
• Aktivity: popsat, jak se biuretová reakce mění v kvantitativní stanovení bílkovin, včetně kalibrační křivky, použité vlnové délky a důvodu, proč je absorbance úměrná koncentraci peptidových vazeb; navrhnout pozitivní a negativní kontroly, které tomuto protokolu chybí, a uvést, co by každá z nich vyloučila; vysvětlit, proč současně pozitivní Fehlingova i biuretová zkouška ukazují na celkové selhání trávení spíše než na chybění jediného enzymu, a vyjmenovat další vyšetření, která by odlišila pankreatickou nedostatečnost od poškození sliznice; zhodnotit citlivost a specificitu každého ze čtyř testů jako screeningu; a vysvětlit, proč negativní výsledek nemůže onemocnění vyloučit.

Laboratorní potřeby

Nástroje

• Zkumavky, 50 ml (2 ks, označené N a P)
• Stojan na zkumavky
• Kapátka, 1 ml (8)
• Pipeta
• Kádinka (500 ml, naplněná 400 ml vody z vodovodu)
• Mikrodestička (jamková destička, použito 6 jamek)
• Plotýnka, nastaveno na 75 °C
• Magnetická míchačka a magnetické míchadlo
• Digitální teploměr
• Skleněné tyče
• Stojan a univerzální svorka
• Papírová utěrka
• Koš

Produkty

• Normální vzorek stolice (N)
• Vzorek stolice pacienta (P)
• Fehlingovo činidlo, roztoky A a B (po 10 ml od každého na zkumavku)
• Lugolův jodový roztok 2 %
• Roztok Sudanu IV
• Biuretovo činidlo — hydroxid sodný, NaOH 2,5 M
• Biuretovo činidlo — síran měďnatý, CuSO₄ 0,0094 M
• Vodovodní voda (400 ml do kouppele)