028 – Analiza scaunelor

Un examen al materiilor fecale este unul dintre cele mai ieftine și mai informative teste din gastroenterologie, deoarece ceea ce părăsește organismul nedigerat spune exact unde digestia sau absorbția a eșuat. Grăsimile din materii fecale indică un pancreas care nu furnizează suficientă lipază sau o mucoasă intestinală deteriorată; proteinele nedigerate indică același lucru; iar zaharurile care ar fi trebuit să fie descompuse și absorbite în intestinul subțire apar în scaun atunci când lipsește o enzimă precum lactaza. Niciuna dintre aceste constatări nu necesită echipamente sofisticate pentru a fi detectată. Fiecare clasă de nutrienți are un test colorimetric care este utilizat de bine de un secol: soluția Fehling devine un precipitat roșu-cărămidă în prezența unui zahăr reducător, iodul devine albastru-negru în prezența amidonului, Sudan IV colorează picăturile de lipide în roșu, iar cuprul în soluție alcalină devine violet în prezența legăturilor peptidice. În acest laborator veți efectua toate cele patru teste pe două probe în paralel – proba N de la o persoană a cărei digestie este normală și proba P de la un pacient – și veți folosi diferența dintre cele două coloane de rezultate pentru a spune ce clase de nutrienți pacientul nu reușește să le digere. Trei dintre teste sunt efectuate în godeurile unei microplăci; testul Fehling necesită căldură, așa că se face în eprubete fixate într-o baie de apă pe o plită electrică.

Obiective educaționale

Familiarizarea cu mediul de laborator

• Identificați microplaca, stativul pentru eprubete, pipetele picurătoare, pipeta, plita electrică cu agitator magnetic, termometrul digital și recipientul de recuperare și precizați rolul fiecăruia.
• Lucrați cu două probe simultan, fără a le contamina încrucișat, și curățați bagheta de sticlă între fiecare agitare.

Manipularea materialului biologic

• Tratați o probă de scaun ca fiind potențial infecțioasă: purtați mănuși pe tot parcursul procedurii, nu o transferați cu gura, iar excesul de reactiv se aruncă în recipientul de recuperare, nu în chiuvetă.
• Plăcile godeuri care au conținut material biologic sunt eliminate, mai degrabă decât spălate și reutilizate, din mai motive esențiale: 1. **Risc de contaminare încrucișată:** Materialul biologic rezidual (ADN, ARN, proteine, celule sau agenți patogeni) poate rămâne pe placă chiar și după spălare. Acest lucru ar putea compromite rezultatele experimentelor viitoare, ducând la fals-pozitive sau date eronate. 2. **Siguranță biologică (Biosecuritate):** Multe plăci sunt folosite pentru a cultiva bacterii, viruși sau alte microorganisme potențial periculoase. Reutilizarea lor ar putea expune personalul de laborator și mediul înconjurător la agenți infecțioși. 3. **Integritatea materialului:** Solvenții chimici puternici sau autoclavarea (sterilizarea la temperaturi ridicate) necesare pentru a curăța complet o placă pot deteriora plasticul (de exemplu, polistirenul), modificându-i proprietățile optice sau chimice, ceea ce ar afecta măsurătorile ulterioare (cum ar fi cele spectrometrice). 4. **Eficiența costurilor și a timpului:** Plăcile cu godeuri sunt fabricate în masă și sunt relativ ieftine. Costul timpului de muncă, al reactivilor de curățare și al sterilizării necesare pentru a le recicla în siguranță depășește de obicei costul achiziționării unor plăci noi, sterile de unică folosință.

Manipularea probelor și dispunerea unui test

• Măsurați 10 mL din fiecare probă în eprubeta etichetată corespunzător și plasați picături din fiecare în cele trei godeuri care poartă eticheta sa.
• Pregătiți o placă astfel încât fiecare godeu să poată fi identificat ulterior și înregistrați dispunerea înainte de a adăuga orice reactiv.

Operarea unei băi de apă încălzite

• Umpleți și configurați o baie de apă cu agitare, aduceți-o la temperatura dorită și fixați o eprubetă cu o clemă, astfel încât conținutul acesteia – nu baia – să ajungă la temperatura de care are nevoie reacția.
• Verificați temperatura din interiorul tubului cu termometrul digital, în loc să vă bazați pe setarea plitei electrice, și explicați diferența dintre cele două citiri.

Utilizarea celor patru teste calitative pentru determinarea nutrienților

• Precizați, înainte de a adăuga orice, ce detectează fiecare reactiv și ce culoare indică un rezultat pozitiv.
• Adăugați reactivii Biuret în ordinea corectă — mai întâi hidroxidul de sodiu, apoi sulfatul de cupru — și explicați de ce substanța alcalină trebuie să fie prezentă înaintea cuprului.

Citirea, înregistrarea și interpretarea rezultatelor

• Notați culoarea tuturor celor opt rezultate așa cum au fost observate și abia apoi decideți dacă sunt pozitive sau negative în funcție de criteriile menționate.
• Trageți o concluzie cu privire la pacient pe baza tendinței observate în cele patru teste și precizați ce nu se poate deduce din această tendință.

Protocol

Pregătirea probelor de scaun

1. Cu ajutorul pipetei, măsurați 10 mL din proba de scaun normală.
2. Toarnă proba de 10 mL în eprubeta N.
3. Folosind un picurător, puneți 5 până la 10 picături din proba de scaun normală în fiecare dintre cele 3 godeuri identificate după cum urmează:

• Godeu N (Lugol)
• Godeu N (Sudan IV)
• Godeu N (Biuret)

4. Repetați pașii de la 1 la 3 pentru proba de scaun a pacientului (P), umplând eprubeta și cele 3 godeuri corespunzătoare.

Identificarea carbohidraților simpli

1. Umpleți un pahar Berzelius de 500 mL cu 400 mL de apă de la robinet.
2. Introduceți bara de agitare magnetică în pahar.
3. Puneți paharul pe plita electrică și setați la 75°C. Așteptați până la atingerea temperaturii.
4. Porniți agitatorul magnetic (butonul din stânga).
5. Folosind pipeta, adăugați 10 mL de Fehling A în eprubeta N.
6. Folosind pipeta, adaugă 10 ml de Fehling B în eprubeta N.
7. Amestecați conținutul eprubetei N cu o mișcare circulară.
8. Pune o clemă universală pe stativul din stânga, deasupra paharului Berzelius de 500 mL pregătit la pasul 1.
9. Fixați eprubeta N în clema universală deasupra centrului paharului Berzelius.
10. Folosind termometrul digital, verificați că se atinge o temperatură mai mare de 70°C în eprubetă.
11. Luați eprubeta N și puneți-o înapoi la locul ei original în stativul pentru eprubete.
12. Amestecați conținutul eprubetei agitând-o câteva secunde cu bagheta de sticlă.
13. Folosind pipeta, adăugați 10 mL de Fehling A în eprubeta P.
14. Folosind pipeta, adaugă 10 mL de Fehling B în eprubeta P.
15. Amestecați conținutul eprubetei P cu o mișcare circulară.
16. Fixați eprubeta P în clema universală deasupra centrului paharului Berzelius.
17. Folosind termometrul digital, verificați că se atinge o temperatură mai mare de 70°C în eprubetă.
18. Luați eprubeta P și puneți-o înapoi la locul ei original în stativul pentru eprubete.
19. Amestecați conținutul eprubetei agitând-o câteva secunde cu bagheta de sticlă.
20. Reduceți temperatura plăcii de încălzire la 15 °C.
21. Oprește agitatorul magnetic.

Observațiile reacției de control se găsesc în tabelul cu rezultate.

Identificarea carbohidraților complecși

1. Folosind picurătorul, adăugați 5 până la 10 picături de Lugol în fiecare dintre cele 2 godeuri identificate după cum urmează:

• Godeu N (Lugol)
• Godeu P (Lugol)

2. Goliți excesul din picurător în recipientul de recuperare.
3. Amestecați conținutul cu bagheta de sticlă. Atenție: asigurați-vă că bagheta de sticlă este bine curățată după fiecare amestecare pentru a evita amestecarea substanțelor!

Identificarea lipidelor

1. Folosind picurătorul, adăugați 5 până la 10 picături de Sudan IV în fiecare dintre cele 2 godeuri identificate după cum urmează:

• Godeu N (Sudan IV)
• Godeu P (Sudan IV)

2. Goliți excesul din picurător în recipientul de recuperare.
3. Amestecați conținutul folosind bagheta de sticlă.

Identificarea proteinelor

1. Folosind picurătorul, puneți 1 picătură de hidroxid de sodiu (NaOH) în fiecare dintre cele 2 godeuri identificate după cum urmează:

• Godeu N (Biuret)
• Godeu P (Biuret)

2. Goliți excesul din picurător în recipientul de recuperare.
3. Folosiți pipeta pentru a extrage 1 pipetă plină (10 mL) de sulfat de cupru (CuSO4).
4. Folosind pipeta, distribuiți 1 mL de sulfat de cupru (CuSO4) în godeurile N și P (Biuret).
5. Goliți excesul din pipetă în recipientul de recuperare.
6. Amestecați conținutul folosind bagheta de sticlă.

Observațiile se găsesc în tabelul de rezultate.

• Un rezultat pozitiv pentru prezența carbohidraților simpli va produce un precipitat roșu-cărămiziu (Cu2O) în eprubetă (reacția Fehling).
• Un rezultat pozitiv pentru prezența carbohidraților complecși va rezulta într-o colorație violetă (complex iod-amidon) în godeu (test Lugol).
• Un rezultat pozitiv pentru prezența lipidelor va produce o colorație roșie (complex Sudan IV – lipide) în godeu (testul Sudan IV).
• Un rezultat pozitiv pentru prezența proteinelor va rezulta într-o colorație violet (complex biuret) în godeu (testul biuret).

Rezultate anticipate

Fiecare dintre cele patru teste răspunde la o întrebare și fiecare are o culoare pozitivă care trebuie cunoscută înainte ca reactivul să fie introdus. Primul tabel stabilește ce se urmărește și ce contează ca rezultat.

Al doilea tabel prezintă cele opt rezultate, împreună cu opțiunea pe care fiecare dintre ele o susține.

Concluzia pe care o susțin rezultatele. Proba N dă patru rezultate negative: nimic detectabil nu a scăpat digestiei, ceea ce reprezintă rezultatul așteptat pentru un intestin sănătos. Proba P dă două rezultate pozitive clare, zaharuri reducătoare și proteine, la aceleași teste care au fost negative pentru N și cu aceiași reactivi din aceleași sticle, astfel încât diferența este o proprietate a probei și nu a metodei. Proteinele nedigerate și zahărul neabsorbit care ajung împreună în scaun indică o eșuare generală a digestiei în intestinul subțire, mai degrabă decât absența unei anumite enzime – o insuficiență pancreatică, în care lipsesc mai multe enzime digestive deodată, sau deteriorarea mucoasei intestinale care scurtează timpul și suprafața disponibile pentru absorbție. Ceea ce nu face rezultatul este să numească boala; el spune ce procese au eșuat, iar un clinician ar continua cu teste care măsoară, mai degrabă decât să detecteze.

De ce godeul pozitiv prezintă atât o culoare, cât și un precipitat. Cele două semnale din godeul P sunt doi compuși diferiți ai aceluiași cupru. Nuanța mov a lichidului este complexul biuretic în sine: în soluția alcalină creată de hidroxidul de sodiu, Cu²⁺ este chelat de atomii de azot ai legăturilor peptidice adiacente, iar acest complex cupru-peptidă este solubil, astfel încât colorează uniform întregul godeu în loc să se depună. Precipitatul este hidroxid de cupru(II), format oriunde un ion Cu²⁺ întâlnește ioni de hidroxid înainte de a întâlni o legătură peptidică: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un solid de culoare albastru-pal. Hidroxidul de cupru(II) se numără printre cei mai puțin solubili hidroxizi comuni, astfel încât, odată ce legăturile peptidice prezente și-au luat partea lor de cupru, excesul părăsește soluția sub formă de acest solid. Cele două observații reprezintă, prin urmare, o singură poveste spusă de două ori: proteina revendică o parte din cupru sub formă de complex mov solubil, iar hidroxidul revendică restul sub formă de solid.

De ce are nevoie soluția Fehling de căldură și ce reprezintă precipitatul roșu. Reactivul Fehling este cupru(II) menținut în soluție de tartrat într-un mediu puternic alcalin, motiv pentru care este livrat în două sticle și se amestecă doar în momentul utilizării. Un zahar reducător conține o grupare aldehidă liberă, iar într-o soluție alcalină fierbinte acea grupare este oxidată la un carboxilat, în timp ce cuprul(II) este redus la cupru(I), care este insolubil și se separă sub formă de oxid de cupru(I) de culoare roșu-cărămiziu: RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂Reacția este mult prea lentă pentru a fi observată la temperatura camerei, acesta fiind motivul principal pentru baia de apă: plita electrică este setată la 75 °C, iar protocolul cere o temperatură de peste 70 °C în interiorul tubului, deoarece acolo are loc reacția. Rețineți ce acoperă și ce nu acoperă testul. Glucoza, fructoza, maltoza și lactoza reduc toate reactivul; zaharoza nu o face, deoarece ambii săi atomi de carbon anomerici sunt blocați în legătura glicozidică, astfel încât un scaun încărcat cu zahroză va da un rezultat negativ. Testul indică faptul că este prezent un zucăr reducător, dar niciodată care anume.

De ce iodul devine albastru-închis în contact cu amidonul. Soluția Lugol conține iod dizolvat în iodură de potasiu sub formă de ion triiodură, I₃⁻. Amiloza, fracțiunea neramificată a amidonului, se înfășoară într-o elice al cărei interior este suficient de larg pentru a susține un lanț de ioni triiodură, iar complexul de transfer de sarcină rezultat absoarbe în tot spectrul vizibil pentru a da culoarea albastru-negru cunoscută. Culoarea este, prin urmare, un raport privind formă al polizaharidului, nu doar pe prezența sa: amilopectina și glicogenul, care sunt puternic ramificate și nu pot forma helici lungi, dau în schimb o culoare roșu-maronie, iar dextrinele — amidon parțial descompus — dau ceva intermediar. Acesta este motivul pentru care o godeu roșu-maroniu trebuie interpretat cu atenție. Așa arată reactivul de unul singur, motiv pentru care este notat ca negativ, dar un student ar trebui să știe că amidonul parțial digerat poate da, de asemenea, o culoare roșu-maronie și că testul își pierde sensibilitatea tocmai acolo unde biologia devine interesantă.

De ce Sudan IV și reactivul Biuret funcționează de fapt. Sudan IV este un lizocrom: un colorant care nu suferă nicio reacție chimică, dar este de multe ori mai solubil în grăsimi decât în apă, astfel încât se distribuie în orice picătură de lipidă prezentă și o colorează în roșu-portocaliu, în timp ce apa din jur rămâne aproape incoloră. Un rezultat pozitiv este, prin urmare, picături roșii distincte, nu o schimbare uniformă de culoare, iar citirea ei ține de căutarea unei structuri mai degrabă decât a unei nuanțe. Reacția Biuret este celălalt tip de test: este o reacție autentică de coordonare, în care Cu²⁺ în soluție puternic alcalină este chelat de atomii de azot a cel puțin două legături peptidice adiacente pentru a da un complex violet cu un maxim de absorbție în jur de 540 nm. Două consecințe decurg de aici. Aminoacizii liberi și dipeptidele nu reacționează, astfel încât testul evidențiază legăturile peptidice mai degrabă decât azotul; și deoarece intensitatea culorii violet este proporțională cu concentrația legăturilor peptidice, acesta este singurul test dintre cele patru care se transformă direct într-o determinare cantitativă cu ajutorul unui spectrofotometru și al unei curbe de etalonare. Ordinea de adăugare contează: alcaliul trebuie să fie prezent înainte de cupru, altfel cuprul precipită sub formă de hidroxid în loc să formeze complexul.

Rezumatul temei pe intervale de note

Clasele a IX-a și a X-a

• Concentrare: cele patru clase de nutrienți, reactivul care evidențiază fiecare dintre ele și disciplina de a înregistra o culoare înainte de a o interpreta.
• Activități: amenajați și etichetați plăcerea; efectuați cele patru teste pe ambele probe; notați culoarea observată a tuturor celor opt rezultate într-un tabel precum Tabelul 2 înainte de a decide ceva; notați fiecare rezultat ca fiind pozitiv sau negativ în raport cu criteriile din protocol; menționați într-o singură propoziție ce eșantion P nu reușește să digere și numiți măsurile de precauție pentru siguranță care se aplică la manipularea unei probe de scaun.

Clasa a XI-a

• Concentrare: chimia din spatele fiecărei culori și condițiile pe care le necesită fiecare reacție.
• Activități: să scrie ecuația Fehling și să identifice ce se oxidează și ce se reduce; să explice de ce tubul trebuie să depășească 70 °C și de ce valoarea citită în tub diferă de temperatura setată a plitei; să explice de ce zaharoza dă un rezultat Fehling negativ, în timp ce lactoza dă unul pozitiv; să explice culoarea albastru-negru prin elicea amilozei și triiodură; să explice de ce Sudan IV nu are nevoie de nicio reacție pentru a funcționa; și să justifice ordinea în care se adaugă cei doi reactivi Biuret.

Clasa a XII-a / Nivel universitar

• Concentrare: pasul de la o evaluare calitativă la o măsurătoare diagnostică și interpretarea unui șablon de rezultate.
• Activități: să descrie cum reacția Biuret este transformată într-un test cantitativ de proteine, incluzând curba de etalonare, lungimea de undă folosită și motivul pentru care absorbanța este proporțională cu concentrația legăturilor peptidice; să propună controalele pozitive și negative care lipsesc acestui protocol și să precizeze ce ar exclude fiecare; să explice de ce rezultatele pozitive simultane la Fehling și Biuret indică o insuficiență digestivă generală, mai degrabă decât lipsa unei singure enzime, și să enumere testele suplimentare care ar distinge insuficiența pancreatică de o leziune a mucoasei; să evalueze sensibilitatea și specificitatea fiecăruia dintre cele patru teste ca metodă de depistare; și să explice de ce un rezultat negativ nu poate exclude o boală.

Esențiale de laborator

Instrumente

• Eprubete, 50 mL (2, etichetate N și P)
• Suport pentru eprubete
• Picurătoare, 1 mL (8)
• Pipetă
• Pahar Berzelius (500 mL, umplut cu 400 mL de apă de la robinet)
• Microplacă (placă cu godeuri, 6 godeuri utilizate)
• Plită electrică, setată la 75 °C
• Agitator magnetic și bară de agitare magnetică
• Termometru digital
• Tije de sticlă
• Suport și clemă universală
• Prosop de hârtie
• Coșul de reciclare

Produse

• Probă de scaun normală (N)
• Probă de scaun de la pacient
• Reactivul Fehling, soluțiile A și B (câte 10 mL din fiecare pe eprubetă)
• Soluția de iod a lui Lugol 2 %
• Soluție Sudan IV
• Reactiv Biuret — hidroxid de sodiu, NaOH 2,5 M
• Reactiv Biuret — sulfat de cupru, CuSO₄ 0,0094 M
• Apă de la robinet (400 mL pentru baie)