028 – Anàlisi de femta

Un examen de femtes és una de les proves més barates i informatives de la gastroenterologia, perquè allò que surt del cos sense digerir diu exactament on ha fallat la digestió o l'absorció. El greix a la femta assenyala un pàncrees que no subministra prou lipasa o un revestiment intestinal danyat; la proteïna no digerida assenyala en la mateixa direcció; i els sucres que s'haurien d'haver descompost i absorbit a l'intestí prim apareixen a la femta quan falta un enzim com la lactasa. Cap d'aquests resultats requereix equipament sofisticat per a ser detectat. Cada classe de nutrient té una prova de color que s'utilitza des de fa ben bé més d'un segle: la solució de Fehling produeix un precipitat vermell maó en presència d'un sucre reductor, el iode es torna blau-negre amb el midó, el Sudan IV tenyeix les gotetes de lípids de vermell, i el coure en solució alcalina es torna violat amb els enllaços peptídics. En aquest laboratori fareu les quatre proves en dues mostres col·locades una al costat de l'altra —la mostra N d'una persona la digestió de la qual és normal, i la mostra P d'un pacient— i fareu servir la diferència entre les dues columnes de resultats per a dir quines classes de nutrients el pacient no aconsegueix digerir. Tres de les proves es fan als pocs d'una microplaca; la prova de Fehling necessita calor, de manera que es fa en tubs d'assaig subjectats en un bany maria sobre una placa calenta.

Objectius educatius

Familiarització amb l'entorn del laboratori

• Identifiqueu la microplaca, el gradell per a tubs d'assaig, els comptagotes, la pipeta, la placa calenta amb el seu agitador magnètic, el termòmetre digital i el recipient de recuperació, i indiqueu la funció de cadascun.
• Treballeu amb dues mostres alhora sense contaminar-les mútuament, i netegeu el broquet de vidre entre cada remenada.

Manipulació de material biològic

• Tractar una mostra de femta com a potencialment infecciosa: guants en tot moment, no fer transferències per la boca, abocar el reactiu sobrat al recipient de recuperació en lloc del colador.
• Una placa de cultiu que ha contingut material biològic es llença en lloc de rentar-la i reutilitzar-la principalment per motius de seguretat, prevenció de la contaminació i viabilitat econòmica: 1. **Risc de contaminació creuada:** Les plaques de cultiu sovint s'utilitzen per cultivar cèl·lules, bacteris o virus. Si no es netegessin a la perfecció, podrien quedar restes biològiques o molècules (com ara ADN, proteïnes o residus metabòlics) que arruïnarien completament els experiments futurs. 2. **Dificultat de neteja i esterilització:** Moltes plaques tenen desenes o centenars de pous diminuts amb geometries complexes. Assegurar l'eliminació total de biofilms, residus químics o toxines adherides a la superfície plàstica és extremadament difícil, fins i tot després de l'autoclau o amb tractaments químics agressius. 3. **Degradació del material:** La majoria de plaques de microtitulació estan fetes de plàstics d'un sol ús (com el poliestirè). Els processos rigorosos necessaris per desinfectar-les i esterilitzar-les (com l'autoclau a alta temperatura o productes químics forts) deformarien o danyarien el plàstic, alterant les seves propietats òptiques i de superfície (sovint tractades per afavorir l'adhesió cel·lular). 4. **Seguretat biològica:** Reutilitzar material que ha estat en contacte amb patògens suposa un risc innecessari per al personal de laboratori pel que fa a l'exposició a agents biològics perillosos. 5. **Cost-eficiència:** El cost de fabricació massiva de les plaques de plàstic d'un sol ús és molt baix. El temps, l'energia, els reactius i la mà d'obra necessaris per rentar, provar i refer l'esterilització de manera fiable superen amb escreix el cost d'utilitzar una placa nova.

Manipulació de mostres i disposició d'un assaig

• Mesureu 10 mL de cada mostra en el seu tub d'assaig etiquetat i poseu gotes de cadascuna en els tres pous que porten la seva etiqueta.
• Prepareu una placa de manera que cada pouet es pugui identificar posteriorment, i registreu la distribució abans d'afegir cap reactiu.

Funcionament d'un bany maria escalfat

• Ompliu i configureu un bany maria amb agitació, porteu-lo al seu punt de consigna i subjecteu un tub d'assaig amb pinces de manera que el seu contingut —i no el bany— arribi a la temperatura que necessita la reacció.
• Verifiqueu la temperatura a l'interior del tub amb el termòmetre digital en comptes de confiar en la configuració de la placa calefactora, i expliqueu la diferència entre les dues lectures.

Ús de les quatre proves qualitatives de nutrients

• Estat, abans d'afegir res, què detecta cada reactiu i quin color compta com a resultat positiu.
• Afegeix els reactius de Biuret en l'ordre correcte — primer l'hidròxid de sodi, després el sulfat de coure — i explica per què l'àlcalí ha d'estar present abans del coure.

Lectura, registre i interpretació de resultats

• Registra el color de tots vuit resultats tal com s'observen i només llavors decideix si són positius o negatius segons els criteris establerts.
• Treu una conclusió sobre el pacient a partir del patró de les quatre proves i diu què no estableix el patró.

Protocol

Preparació de mostres de femta

1. Amb la pipeta, mesureu 10 mL de la mostra de femta normal.
2. Aboca la mostra de 10 ml al tub d'assaig N.
3. Amb un comptagotes, posa de 5 a 10 gotes de la mostra de femta normal a cadascun dels 3 pous identificats de la manera següent:

• Pou N (Lugol)
• Pou N (Sudan IV)
• Pou N (Biuret)

4. Repetiu els passos 1 a 3 per a la mostra de femta del pacient (P) omplint el tub d'assaig i els 3 pous corresponents.

Identificació de carbohidrats simples

1. Ompliu un vas de precipitats de 500 ml amb 400 ml d'aigua de l'aixeta.
2. Introduïu la vareta d'agitació magnètica al vas de precipitats.
3. Poseu el vas de precipitats a la placa calefactora i poseu-la a 75°C. Espereu fins que s'assoleixi la temperatura.
4. Encén l'agitador magnètic (botó esquerre).
5. Amb el comptagotes, afegeix 10 ml de Fehling A al tub d'assaig N.
6. Amb el comptagotes, afegeix 10 ml de Fehling B al tub d'assaig N.
7. Barreja els continguts del tub d'assaig N amb un moviment circular.
8. Col·loca una pinça universal a la pota esquerra, per sobre del vas de 500 ml preparat al pas 1.
9. Fixa el tub d'assaig N a la pinça universal per sobre del centre del vas de precipitats.
10. Utilitza el termòmetre digital per verificar que al tub d'assaig s'assoleix una temperatura superior a 70°C.
11. Pren el tub d'assaig N i torna'l al seu lloc original a la gradeta de tubs d'assaig.
12. Barregeu el contingut del tub d'assaig agitant-lo durant uns segons amb la vareta de vidre.
13. Amb el comptagotes, afegiu 10 ml de Fehling A al tub d'assaig P.
14. Utilitzant la pipeta, afegir 10 ml de Fehling B al tub d'assaig P.
15. Barreja el contingut del tub d'assaig P amb un moviment circular.
16. Fixa el tub d'assaig P a la pinça universal per sobre del centre del vas de precipitats.
17. Utilitza el termòmetre digital per verificar que al tub d'assaig s'assoleix una temperatura superior a 70°C.
18. Pren el tub d'assaig P i torna'l al seu lloc original a la gradeta de tubs d'assaig.
19. Barregeu el contingut del tub d'assaig agitant-lo durant uns segons amb la vareta de vidre.
20. Baixa la temperatura de la placa calenta a 15°C.
21. Apaga l'agitador magnètic.

Les observacions de la reacció de control es troben a la taula de resultats.

Identificació de carbohidrats complexos

1. Amb el comptagotes, afegeix de 5 a 10 gotes de Lugol a cadascun dels 2 pous identificats de la manera següent:

• Pou N (Lugol)
• Pou P (Lugol)

2. Buidar l'excés del comptagotes al recipient de recuperació.
3. Barreja el contingut amb la vareta de vidre. Atenció: assegura't de netejar bé la vareta de vidre després de cada barreja per evitar barrejar les substàncies!

Identificació de lípids

1. Amb el comptagotes, afegeix de 5 a 10 gotes de Sudan IV a cadascun dels 2 pous identificats de la manera següent:

• Pou N (Sudan IV)
• Pou P (Sudan IV)

2. Buidar l'excés del comptagotes al recipient de recuperació.
3. Barreja els continguts amb la vareta de vidre.

Identificació de proteïnes

1. Amb el comptagotes, posa 1 gota d'hidròxid de sodi (NaOH) a cadascun dels 2 pous identificats de la manera següent:

• Pou N (Biuret)
• Pou P (Biuret)

2. Buidar l'excés del comptagotes al recipient de recuperació.
3. Utilitza la pipeta per extreure 1 pipeta plena (10 mL) de sulfat de coure (CuSO4).
4. Amb la pipeta, dispensa 1 mL de sulfat de coure (CuSO4) als pous N i P (Biuret).
5. Buidar l'excés de la pipeta a la paperera de recuperació.
6. Barreja els continguts amb la vareta de vidre.

Les observacions es troben a la taula de resultats.

• Un resultat positiu per a la presència de glúcids simples donarà lloc a un precipitat vermell maó (Cu2O) al tub d'assaig (reacció de Fehling).
• Un resultat positiu per a la presència de carbohidrats complexos donarà lloc a una coloració morada (complex iod-midó) al pou (test de Lugol).
• Un resultat positiu per a la presència de lípids donarà lloc a una coloració vermella (complex Sudan IV – lípids) al pou (prova de Sudan IV).
• Un resultat positiu per a la presència de proteïnes donarà lloc a una coloració porpra (complex de biuret) al pou (assaig de biuret).

Resultats previstos

Cadascuna de les quatre proves respon a una pregunta, i cadascuna té un color positiu que cal conèixer abans que hi entri el reactiu. La primera taula estableix què s'està buscant i què es considera un resultat.

La segona taula mostra els vuit resultats amb la crida que cadascun d'ells recolza.

La conclusió que els resultats avalen. La mostra N dona quatre negatius: no s'ha escapat res detectable de la digestió, que és la troballa esperada per a un intestí sa. La mostra P dona dos positius clars, sucres reductors i proteïna, en les mateixes proves que han estat negatives per a N i amb els mateixos reactius de les mateixes ampolles, de manera que la diferència és una propietat de la mostra i no del mètode. La proteïna no digerida i el sucre no absorbit que arriben a la femta junts apunten a una fallada general de la digestió a l'intestí prim més que no pas a l'absència d'un enzim específic —una insuficiència pancreàtica, en la qual falten diversos enzims digestius alhora, o un dany al revestiment intestinal que escurça el temps i la superfície disponibles per a l'absorció. El que no fa el resultat és posar nom a la malaltia; diu quins processos han fallat, i un clínic ho faria seguir amb proves que mesuren en lloc de detectar.

Per què el pou positiu mostra tant un color com un precipitat. Els dos senyals del pou P són dos compostos diferents del mateix coure. El tint malva del líquid és el complex de biuret en si: en la solució alcalina creada per l'hidròxid de sodi, el Cu²⁺ està quelat pels àtoms de nitrogen d'enllaços peptídics adjacents, i aquest complex de coure i pèptid és soluble, de manera que tenyeix tot el pou de manera uniforme en lloc de precipitar. El precipitat és hidròxid de coure(II), format allà on un ió Cu²⁺ troba ions hidròxid abans de trobar un enllaç peptídic: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un sòlid de color blau pàl·lid. L'hidròxid de coure(II) és un dels hidròxids comuns menys solubles, de manera que, un cop els enllaços peptídics presents han pres la seva part del coure, l'excés abandona la solució en forma d'aquest sòlid. Les dues observacions són, per tant, una sola història explicada dues vegades: la proteïna reclama una part del coure com a complex malva soluble, i l'hidròxid reclama la resta com a sòlid.

Per què la solució de Fehling necessita calor i quin és el precipitat roig. El reactiu de Fehling és coure(II) mantingut en solució mitjançant tartrat en medi fortament alcalí, raó per la qual se subministra en dos pots i es barreja només en el moment d'utilitzar-lo. Un sucre reductor porta un grup aldehid lliure, i en solució alcalina calenta aquest grup s'oxida a un carboxilat mentre que el coure(II) es redueix a coure(I), el qual és insoluble i precipita com a òxid de coure(I) de color vermell totxo: RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂La reacció és massa lenta per veure-la a temperatura ambient, la qual cosa és el motiu de tot plegat del bany d'aigua: la placa calenta està a 75 °C i el protocol demana més de 70 °C dins del tub, perquè és allà on té lloc la reacció. Tingueu en compte què abasta i què no abasta la prova. La glucosa, la fructosa, la maltosa i la lactosa redueixen el reactiu; la sacarosa no, perquè tots dos carbonis anomèrics estan bloquejats en l'enllaç glicosídic, de manera que una femta carregada de sacarosa donaria un resultat negatiu. La prova indica que hi ha present un sucre reductor, però mai quin.

Per què el iode es torna blau-negre amb el midó. La solució de Lugol conté iode dissolt en iodur potàssic com a ió triiodur, I₃⁻. L'amilosa, la fracció no ramificada del midó, s'enrosca en una hèlix l'interior de la qual és justament prou ample per contenir una cadena d'ions triiodur, i el complex de transferència de càrrega resultant absorbeix a tot l'espectre visible per donar el familiar blau-negre. Per tant, el color és un informe sobre la forma del polisacàrid, no pas només de la seva presència: l'amilopectina i el glucogen, que són molt ramificats i no poden formar hèlices llargues, donen un color vermellós-marró, i les dextrines —midó parcialment descomposat— donen un color intermedi. És per això que un pou de color marró vermellós s'ha de llegir amb cura. És el que sembla el reactiu per si sol, de manera que es considera negatiu, però un estudiant hauria de saber que l'almidó parcialment digerit també pot donar un color marró vermellós i que la prova perd sensibilitat precisament allà on la biologia es torna interessant.

Per què el Sudan IV i el Biuret funcionen. El Sudan IV és un lisocrom: un colorant que no experimenta cap mena de reacció química, sinó que és molt més soluble en greix que en aigua, de manera que es distribueix en qualsevol gota de lípid present i la tiny gerogenca-vermella mentre que l'aigua del voltant es manté gairebé incolora. Per tant, un resultat positiu és gotetes vermells discrets, no un canvi de color uniforme, i llegir-la és més qüestió de buscar l'estructura que no pas la tonalitat. La reacció de Biuret és el tipus de prova oposat: és una autèntica reacció de coordinació, en la qual el Cu²⁺ en solució fortament alcalina és quelatat pels àtoms de nitrogen de com a mínim dos enllaços peptídics adjacents per a donar un complex de color violeta amb un màxim d'absorbància a prop de 540 nm. Se'n deriven dues conseqüències. Els aminoàcids lliures i els dipèptids no reaccionen, de manera que la prova detecta enllaços peptídics en lloc de nitrogen; i com que la intensitat del violeta és proporcional a la concentració d'enllaços peptídics, aquesta és l'única prova de les quatre que es transforma directament en un assaig quantitatiu amb un espectrofotòmetre i una corba patró. L'ordre d'addició importa: l'àlkali ha d'estar present abans del coure, o el coure precipita com a hidròxid en comptes de formar el complex.

Resum de tasques per rang de qualificació

De 9è a 10è grau

• Enfocament les quatre classes de nutrients, el reactiu que revela cadascuna i la disciplina de registrar un color abans d'interpretar-lo.
• Activitats: disposeu i etiqueteu la placa; feu les quatre proves en totes dues mostres; anoteu el color observat dels vuit resultats en una taula com la Taula 2 abans de decidir res; puntueu cada resultat com a positiu o negatiu respecte als criteris del protocol; indiqueu en una sola frase què és allò que la mostra P no aconsegueix digerir, i esmenteu les precaucions de seguretat aplicables a la manipulació d'una mostra de femta.

11è curs

• Enfocament la química darrere de cada color i les condicions que requereix cada reacció.
• Activitats: escriure l'equació de Fehling i identificar què s'oxida i què es redueix; explicar per què el tub ha de superar els 70 °C i per què la lectura dins del tub difereix de la consigna de la placa calefactora; explicar per què la sacarosa dóna un resultat de Fehling negatiu mentre que la lactosa en dóna un de positiu; explicar el color blau-negre en termes de l'hèlix d'amilosa i el triiodur; explicar per què el Sudan IV no necessita cap reacció per funcionar; i justificar l'ordre en què s'afegeixen els dos reactius de Biuret.

12è curs / Nivell universitari

• Enfocament el pas d'un cribratge qualitatiu a un mesurament diagnòstic, i la interpretació d'un patró de resultats.
• Activitats: descriure com la reacció de Biuret es converteix en un assaig quantitatiu de proteïnes, incloent-hi la corba estàndard, l'ona d'ona utilitzada i el motiu pel qual l'absorbància és proporcional a la concentració d'enllaços peptídics; proposar els controls positius i negatius que falten en aquest protocol i indicar què descartaria cadascun; explicar per què el fet que els resultats positius de Fehling i Biuret apareguin simultàniament apunta a un fracàs digestiu general més que a l'absència d'un sol enzim, i enumerar les proves addicionals que permetrien distingir la insuficiència pancreàtica del dany mucosal; avaluar la sensibilitat i la especificitat de cadascuna de les quatre proves com a cribratge; i explicar per què un resultat negatiu no pot excloure una afecció.

Equipament de laboratori

Instruments

• Provetes de 50 mL (2, etiquetades amb N i P)
• Gradella per a tubs d'assaig
• Comptagotes, 1 mL (8)
• Pipeta
• Vas de precipitats (500 mL, omplert amb 400 mL d'aigua de l'aixeta)
• Microplaca (placa de pouets, 6 pouets utilitzats)
• Placa calenta, a 75 °C
• Agitador magnètic i barra d'agitació magnètica
• Termòmetre digital
• Barres de vidre
• Suport i mordassa universal
• Paper de cuina
• Paperera de reciclatge

Productes

• Mostra de femtes normal (N)
• Mostra de femtes del pacient (P)
• Reactiu de Fehling, solucions A i B (10 mL de cadascuna per tub)
• Solució de iode de Lugol 2 %
• Solució de Sudan IV
• Reactiu de Biuret — hidròxid de sodi, NaOH 2,5 M
• Reagent de Biuret — sulfat de coure, CuSO₄ 0,0094 M
• Aigua de l'aixeta (400 mL per al bany)