028 – Analiza kału

Badanie kału jest jednym z najtańszych i najbardziej informatywnych badań w gastroenterologii, ponieważ to, co opuszcza organizm w stanie nieniestrawionym, dokładnie wskazuje, gdzie zawiodło trawienie lub wchłanianie. Tłuszcz w kale wskazuje na trzustkę, która nie dostarcza wystarczającej ilości lipazy, lub na uszkodzoną błonę śluzową jelit; nieniestrawione białko wskazuje na to samo; natomiast cukry, które powinny zostać rozłożone i wchłonięte w jelicie cienkim, pojawiają się w kale, gdy brakujeenzymu takiego jak laktaza. Żaden z tych wyników nie wymaga do wykrycia skomplikowanego sprzętu. Każda klasa składników odżywczych ma test kolorymetryczny, który jest używany od ponad wieku: odczynnik Fehlinga tworzy ceglastoczerwony osad w obecności cukru redukującego, jod daje barwę niebiesko-czarną ze skrobią, Sudan IV wybarwia kropelki lipidów na czerwono, a miedź w środowisku zasadowym barwi się na fioletowo w obecności wiązań peptydowych. W tym laboratorium wykonasz wszystkie cztery testy na dwóch próbach jednocześnie – próbce N od osoby z prawidłowym trawieniem oraz próbce P od pacjenta – i na podstawie różnicy między obiema kolumnami wyników określisz, których klas składników odżywczych pacjent nie trawi prawidłowo. Trzy z tych testów wykonuje się w studzienkach płytki mikrotytracyjnej; test Fehlinga wymaga ogrzewania, dlatego przeprowadza się go w probówkach umieszczonych w łaźni wodnej na płycie grzejnej.

Cele edukacyjne

Zapoznanie się ze środowiskiem laboratoryjnym

• Zidentyfikuj płytkę mikrotitracyjną, statyw do probówek, pipety, pipetę automatyczną (lub zakraplacz), płytę grzejną z mieszadłem magnetycznym, termometr cyfrowy oraz pojemnik na odpady, i określ rolę każdego z nich.
• Pracuj z dwoma próbkami jednocześnie bez ich wzajemnego zanieczyszczania i czyść szklaną pałeczkę po każdym mieszaniu.

Postępowanie z materiałem biologicznym

• Próbkę stolca należy traktować jako potencjalnie zakaźną: rękawice przez cały czas, zakaz pobierania pipetą ustami, nadmiar odczynnika do pojemnika na odpady zamiast do zlewki.
• Płyta wielodołkowa, w której znajdował się materiał biologiczny, jest utylizowana, a nie myta i ponowie używana, ze względu na ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego, trudności w całkowitym usunięciu mikroskopijnych pozostałości biologicznych i chemicznych (takich jak białka, DNA czy toksyny) oraz zagrożenie biologiczne dla personelu laboratoryjnego. Jednorazowe płytki zapewniają powtarzalność i wiarygodność wyników badań, eliminując zmienność, którą mogłoby powodować niedokładne czyszczenie.

Obsługa próbek i układ testu

• Odlać 10 mL każdej próbki do oznaczonych probówek i umieścić krople każdej z nich w trzech wgłębieniach oznaczonych tą samą etykietą.
• Przygotuj płytkę tak, aby każdą studzienkę można było później zidentyfikować, i zarejestruj układ przed dodaniem jakiegokolwiek odczynnika.

Działanie łaźni wodnej z grzałką

• Napełnij i przygotuj łaźnię wodną z mieszadłem, doprowadź ją do temperatury zadanej, a następnie zamocuj w niej probówkę za pomocą zacisku tak, aby jej zawartość – a nie łaźnia – osiągnęła temperaturę wymaganą dla reakcji.
• Zweryfikuj temperaturę wewnątrz rurki za pomocą termometru cyfrowego, zamiast polegać na ustawieniu płyty grzejnej, i wyjaśnij różnicę między tymi dwoma odczytami.

Zastosowanie czterech jakościowych testów na obecność składników odżywczych

• Podaj, przed dodaniem czegokolwiek, co wykrywa każdy odczynnik i jaki kolor jest uznawany za wynik pozytywny.
• Dodaj odczynniki biuretowe w odpowiedniej kolejności — najpierw wodorotlenek sodu, a następnie siarczan miedzi — i wyjaśnij, dlaczego zasada musi znajdować się tam przed miedzią.

Odczytywanie, rejestrowanie i interpretowanie wyników

• Zapisz kolor wszystkich ośmiu wyników w takiej postaci, w jakiej zostały zaobserwowane, a dopiero potem zdecyduj o wyniku pozytywnym lub negatywnym względem określonych kryteriów.
• Wyciągnij wniosek na temat pacjenta na podstawie wzorca we wszystkich czterech testach i powiedz, czego ten wzorzec nie potwierdza.

Protokół

Przygotowanie próbek kału

1. Za pomocą pipety odmierz 10 mL normalnej próbki kału.
2. Wlej 10 ml próbki do probówki N.
3. Za pomocą zakraplacza umieść 5 do 10 kropli normalnej próbki stolca w każdej z 3 studzienek oznaczonych następująco:

• Studzienka N (Lugol)
• Studzienka N (Sudan IV)
• Studzienka N (Biuret)

4. Powtórz kroki od 1 do 3 dla próbki kału pacjenta (P), napełniając probówkę i 3 odpowiadające jej studzienki.

Identyfikacja prostych węglowodanów

1. Napełnij 400 ml wody z kranu do zlewki o pojemności 500 ml.
2. Włóż mieszadło magnetyczne do zlewki.
3. Ustaw zlewkę na płycie grzewczej i ustaw temperaturę na 75°C. Poczekaj, aż temperatura zostanie osiągnięta.
4. Włącz mieszadło magnetyczne (przycisk po lewej).
5. Za pomocą pipety dodać 10 ml Fehling A do probówki N.
6. Za pomocą pipety dodać 10 ml Fehling B do probówki N.
7. Zmieszaj zawartość probówki N ruchem okrężnym.
8. Umieść zacisk uniwersalny na lewej statywie, nad zlewką o pojemności 500 ml przygotowaną w kroku 1.
9. Zamocuj probówkę N w zacisku uniwersalnym nad środkiem zlewki.
10. Za pomocą termometru cyfrowego zweryfikuj, czy w probówce została osiągnięta temperatura powyżej 70°C.
11. Weź probówkę N i odłóż ją na jej pierwotne miejsce na stojaku na probówki.
12. Zmieszać zawartość probówki przez kilka sekund potrząsając nią szklanym pręcikiem.
13. Za pomocą pipety dodać 10 ml Fehling A do probówki P.
14. Za pomocą pipety dodaj 10 ml Fehling B do probówki P.
15. Wymieszaj zawartość probówki P ruchem okrężnym.
16. Zamocuj probówkę P w zacisku uniwersalnym nad środkiem zlewki.
17. Za pomocą termometru cyfrowego zweryfikuj, czy w probówce została osiągnięta temperatura powyżej 70°C.
18. Weź probówkę P i odłóż ją na jej pierwotne miejsce na stojaku na probówki.
19. Zmieszać zawartość probówki przez kilka sekund potrząsając nią szklanym pręcikiem.
20. Obniż temperaturę płyty grzewczej do 15°C.
21. Wyłącz mieszadło magnetyczne.

Obserwacje reakcji kontrolnej znajdują się w tabeli wyników.

Identyfikacja złożonych węglowodanów

1. Za pomocą zakraplacza dodaj 5 do 10 kropli płynu Lugola do każdej z 2 studzienek oznaczonych następująco:

• Studzienka N (Lugol)
• Studzienka P (Lugol)

2. Wylej nadmiar z zakraplacza do pojemnika na odpady.
3. Wymieszaj zawartość szklanym pręcikiem. Ostrzeżenie: pamiętaj, aby dokładnie czyścić szklany pręcik po każdym mieszaniu, aby uniknąć zmieszania substancji!

Identyfikacja lipidów

1. Za pomocą zakraplacza dodaj 5 do 10 kropli Sudanu IV do każdej z 2 studzienek oznaczonych następująco:

• Studzienka N (Sudan IV)
• Studzienka P (Sudan IV)

2. Wylej nadmiar z zakraplacza do pojemnika na odpady.
3. Wymieszaj zawartość za pomocą bagietki szklanej.

Identyfikacja białek

1. Za pomocą zakraplacza umieść 1 kroplę wodorotlenku sodu (NaOH) w każdej z 2 studzienek oznaczonych następująco:

• Studzienka N (Biuret)
• Studzienka P (Biuret)

2. Wylej nadmiar z zakraplacza do pojemnika na odpady.
3. Za pomocą pipety pobierz 1 pełną pipetę (10 mL) siarczanu miedzi (CuSO4).
4. Za pomocą pipety odmierz 1 mL siarczanu miedzi (CuSO4) do studzienek N i P (Biuret).
5. Opróżnij nadmiar z pipety do pojemnika z odpadami.
6. Wymieszaj zawartość za pomocą bagietki szklanej.

Obserwacje znajdują się w tabeli wyników.

• Pozytywny wynik na obecność cukrów prostych objawi się ceglastoczerwonym osadem (Cu2O) w probówce (reakcja Fehlinga).
• Wynik pozytywny na obecność węglowodanów złożonych spowoduje purpurowe zabarwienie (jod – kompleks skrobi) w studzience (próba Lugola).
• Pozytywny wynik na obecność lipidów objawi się czerwonym zabarwieniem (kompleks Sudan IV – lipidy) w studzience (test Sudanu IV).
• Pozytywny wynik obecności białek spowoduje purpurowe zabarwienie (kompleks biuretowy) w studzience (próba biuretowa).

Przewidywane wyniki

Każdy z czterech testów odpowiada na jedno pytanie i każdy ma pozytywny kolor, który trzeba znać, zanim dodany zostanie odczynnik. Pierwsza tabela określa, czego się szuka i co uznaje się za wynik.

Druga tabela przedstawia osiem wyników wraz z wywołaniem, które każdy z nich obsługuje.

Wniosek, który popierają wyniki. Próbka N dała cztery wyniki ujemne: nic wykrywalnego nie uniknęło trawienia, co jest oczekiwanym wynikiem w przypadku zdrowego jelita. Próbka P dała dwa wyraźne wyniki dodatnie – cukry redukujące i białko – w tych samych testach, które dla próbki N dały wyniki ujemne, przy użyciu tych samych odczynników z tych samych butelek, więc różnica wynika z właściwości próbki, a nie z metody. Niestrawione białko i niewchłonięty cukier pojawiające się razem w stolcu wskazują raczej na ogólną niewydolność trawienia w jelicie cienkim niż na brak jednego konkretnego enzymu — na niewydolność trzustki, w której brakuje jednocześnie kilku enzymów trawiennych, lub na uszkodzenie błony śluzowej jelita, które skraca czas i zmniejsza powierzchnię dostępną do wchłaniania. Wynik ten nie pozwala na określenie nazwy choroby; wskazuje jedynie, które procesy uległy zaburzeniu, a lekarz powinien następnie przeprowadzić badania, które mierzą, a nie tylko wykrywają.

Dlaczego studzienka dodatnia wykazuje zarówno zabarwienie, jak i osad. Dwa sygnały w studzience P to dwa różne związki tej samej miedzi. Fioletowy odcień cieczy to sam kompleks biuretowy: w zasadowym roztworze utworzonym przez wodorotlenek sodu jon Cu²⁺ jest chelatowany przez atomy azotu sąsiednich wiązań peptydowych, a ten kompleks miedziowo-peptydowy jest rozpuszczalny, dzięki czemu zabarwia całą studzienkę równomiernie, zamiast opadać na dno. Osadem jest wodorotlenek miedzi(II), powstający wszędzie tam, gdzie jon Cu²⁺ napotka jony wodorotlenkowe, zanim napotka wiązanie peptydowe: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), bladoniebieskie ciało stałe. Wodorotlenek miedzi(II) należy do najmniej rozpuszczalnych spośród pospolitych wodorotlenków, więc gdy obecne wiązania peptydowe pobiorą już swoją część miedzi, nadmiar opuszcza roztwór w postaci tego ciała stałego. Obie obserwacje opowiadają zatem tę samą historię dwa razy: białko wiąże część miedzi jako rozpuszczalny fioletowy kompleks, a wodorotlenek wiąże resztę w postaci ciała stałego.

Dlaczego do przeprowadzenia reakcji Fehlinga potrzebne jest ciepło i czym jest ten czerwony osad. Odczynnik Fehlinga to miedź(II) utrzymywana w roztworze przez winian w silnym roztworze alkalicznym, dlatego jest dostarczany w dwóch butelkach i mieszany dopiero w momencie użycia. Cukier redukujący zawiera wolną grupę aldehydową, która w gorącym roztworze alkalicznym ulega utlenieniu do grupy karboksylanowej, podczas gdy miedź(II) ulega redukcji do miedzi(I), która jest nierozpuszczalna i wytrąca się w postaci ceglastoczerwonego tlenku miedzi(I): RCHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → RCOO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O. Reakcja przebiega w temperaturze pokojowej zbyt wolno, by można ją było zaobserwować, i właśnie dlatego stosuje się łaźnię wodną: płyta grzejna jest ustawiona na 75 °C, a protokół wymaga temperatury powyżej 70 °C wewnątrz rury, ponieważ tam zachodzi reakcja. Zwróć uwagę na to, co test obejmuje, a czego nie. Glukoza, fruktoza, maltoza i laktoza redukują odczynnik; sacharoza nie, ponieważ oba jej węgle anomeryczne są zablokowane wiązaniem glikozydowym, więc stolec zawierający sacharoza da wynik negatywny. Test mówi, że obecny jest cukier redukujący, ale nigdy – który konkretnie.

Dlaczego jod w połączeniu ze skrobią zmienia kolor na niebiesko-czarny?. Roztwór Lugola zawiera jod rozpuszczony w jodku potasu w postaci jonu trijodku, I₃⁻. Amylaza, nierozgałęziona frakcja skrobi, zwija się w helisę, której wnętrze jest na tyle szerokie, że mieści łańcuch jonów trijodku, a powstały w ten sposób kompleks przeniesienia ładunku pochłania promieniowanie w całym widmie światła widzialnego, nadając mu znany niebiesko-czarny odcień. Kolor ten jest zatem odzwierciedleniem kształt polysacharydu, a nie tylko na jego obecności: amylopektyna i glikogen, które są silnie rozgałęzione i nie mogą tworzyć długich helis, dają natomiast barwę czerwono-brązową, a dekstryny — częściowo rozłożona skrobia — dają wynik pośredni. Dlatego też wynik czerwono-brązowy należy interpretować ostrożnie. Tak właśnie wygląda sam odczynnik, więc wynik ten jest oceniany jako ujemny, ale student powinien wiedzieć, że częściowo strawiona skrobia również może dawać odbarwienie czerwono-brązowe i że test traci czułość właśnie tam, gdzie biologia staje się interesująca.

Dlaczego Sudan IV i biuret w ogóle działają. Sudan IV to lizoochrom: barwnik, który nie wchodzi w żadną reakcję chemiczną, ale jest wielokrotnie bardziej rozpuszczalny w tłuszczu niż w wodzie, przez co przedostaje się do każdej obecnej kropelki lipidowej i zabarwia ją na czerwono-pomarańczowo, podczas gdy otaczająca ją woda pozostaje niemal bezbarwna. Wynik dodatni oznacza zatem pojedyncze czerwone kropelki, a nie jednolita zmiana koloru, a interpretacja wyników polega raczej na poszukiwaniu struktury niż odcienia. Reakcja Biureta stanowi test o odwrotnym charakterze: jest to prawdziwa reakcja koordynacyjna, w której Cu²⁺ w roztworze o silnie zasadowym odczynie ulega chelatowaniu przez atomy azotu co najmniej dwóch sąsiednich wiązań peptydowych, tworząc fioletowy kompleks o maksimum absorpcji w pobliżu 540 nm. Wynikają z tego dwie konsekwencje. Wolne aminokwasy i dipeptydy nie reagują, więc test wykrywa raczej wiązania peptydowe niż azot; a ponieważ intensywność fioletowego zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia wiązań peptydowych, jest to jedyny z czterech testów, który można bezpośrednio przekształcić w oznaczenie ilościowe za pomocą spektrofotometru i krzywej wzorcowej. Kolejność dodawania ma znaczenie: zasada musi być obecna przed miedzią, w przeciwnym razie miedź wytrąca się w postaci wodorotlenku zamiast tworzyć kompleks.

Podsumowanie zadania według zakresu ocen

Klasy 9–10

• Skupienie: cztery klasy składników odżywczych, odczynnik wykrywający każdą z nich oraz zasada zapisywania koloru przed jego zinterpretowaniem.
• Aktywności: przygotuj płytkę i opisz ją; przeprowadź cztery testy na obu próbkach; przed podjęciem jakichkolwiek decyzji zapisz zaobserwowany kolor wszystkich ośmiu wyników w tabeli podobnej do tabeli 2; oceń każdy wynik jako pozytywny lub negatywny zgodnie z kryteriami określonymi w protokole; w jednym zdaniu określ, której próbki P nie udaje się strawić, oraz wymień środki ostrożności obowiązujące podczas postępowania z próbką kału.

Klasa 11

• Skupienie: zasady chemiczne leżące u podstaw każdego koloru oraz warunki niezbędne do przebiegu każdej reakcji.
• Aktywności: zapisz równanie reakcji Fehlinga i określ, która substancja ulega utlenieniu, a która redukcji; wyjaśnij, dlaczego temperatura w probówce musi przekraczać 70 °C oraz dlaczego odczyt wewnątrz probówki różni się od wartości zadanej płyty grzejnej; wyjaśnij, dlaczego sacharoza daje wynik ujemny w teście Fehlinga, podczas gdy laktoza daje wynik dodatni; wyjaśnij powstawanie niebiesko-czarnego zabarwienia w kontekście helisy amylozy i trijodku; wyjaśnij, dlaczego Sudan IV nie wymaga reakcji, aby zadziałać; oraz uzasadnij kolejność dodawania dwóch odczynników biuretowych.

Klasa 12 / Poziom akademicki

• Skupienie: krok od jakościowego badania przesiewowego do pomiaru diagnostycznego oraz interpretacja wzorca wyników.
• Aktywności: opisać, w jaki sposób reakcja Biureta przekształca się w ilościowy test na obecność białka, uwzględniając krzywą kalibracyjną, zastosowaną długość fali oraz powód, dla którego absorbancja jest proporcjonalna do stężenia wiązań peptydowych; zaproponować kontrole pozytywne i negatywne, których brakuje w niniejszym protokole, oraz określić, co każda z nich wykluczałaby; wyjaśnić, dlaczego jednoczesne uzyskanie wyników pozytywnych w testach Fehlinga i Biureta wskazuje raczej na ogólną niewydolność trawienną niż na brak jednego enzymu, oraz wymienić dalsze badania, które pozwoliłyby odróżnić niewydolność trzustki od uszkodzenia błony śluzowej; ocenić czułość i swoistość każdego z czterech badań jako testu przesiewowego; oraz wyjaśnić, dlaczego wynik ujemny nie pozwala wykluczyć danego schorzenia.

Podstawowe wyposażenie laboratorium

Instrumenty

• Probówki o pojemności 50 ml (2 szt., oznaczone literami N i P)
• Stojak na probówki
• Kroplomierze, 1 ml (8)
• Pipeta
• Zlewka (500 ml, napełniona 400 ml wody z kranu)
• Mikropłytka (płytka z dołkami, wykorzystano 6 dołków)
• Płyta grzejna, ustawiona na 75 °C
• Mieszadło magnetyczne i mieszadełko magnetyczne
• Termometr cyfrowy
• Szklane pręty
• Stojak i uniwersalny zacisk
• Ręcznik papierowy
• Kosz

Produkty

• Prawidłowa próbka stolca (N)
• Próbka kału pacjenta (P)
• Odczynnik Fehlinga, roztwory A i B (po 10 ml każdego na probówkę)
• Roztwór jodu Lugola 2 %
• Roztwór Sudanu IV
• Odczynnik biuretowy — wodorotlenek sodu, NaOH 2,5 M
• Odczynnik biuretowy — siarczan miedzi(II), CuSO₄ 0,0094 M
• Woda z kranu (400 ml do kąpieli)