026 – DNA Vegetale

L'estrazione del DNA è il primo passo di quasi tutte le procedure in biologia molecolare: il sequenziamento di un genoma, il test su una varietà di raccolto per un gene di resistenza alle malattie, l'esame comparativo di un campione forense o la conferma di una diagnosi clinica iniziano tutti con l'estrazione del DNA dalle cellule per metterlo in una provetta. La chimica è la stessa a qualsiasi scala. Una cellula trattiene il proprio contenuto dietro membrane costituite da fosfolipidi, e il DNA all'interno è un polianione molto lungo: ogni gruppo fosfato lungo la sua spina dorsale trasporta una carica negativa a pH neutro. Un detergente scioglie le membrane e rilascia il contenuto della cellula; il sale sciolto fornisce ioni di sodio che schermano quelle cariche negative, facendo sì che i filamenti vicini smettano di respingersi a vicenda; e un alcol freddo, in cui il DNA è molto meno solubile che nell'acqua, spinge quindi le molecole schermate fuori dalla soluzione sotto forma di una massa abbastanza grande da poter essere vista a occhio nudo. La banana è un materiale di partenza conveniente: la polpa è abbastanza morbida da essere ridotta in una pasta con un pestello, contiene poche fibre e la banana coltivata è triploide, quindi ogni cellula trasporta tre set di cromosomi. In questo laboratorio preparerete una soluzione di estrazione con acqua distillata, cloruro di sodio e detersivo per piatti, schiaccerete un pezzo di banana fino a ottenere una pasta omogenea, mescolerete la pasta con quella soluzione, filtrerete la miscela attraverso la carta in una provetta e stratificherete del metanolo freddo sopra il filtrato. Nel giro di pochi momenti compare un precipitato grigio e filamentoso dove i due liquidi si incontrano: DNA, insieme ad parte dell'altro materiale rilasciato dalle cellule.

Obiettivi Educativi

Familiarizzazione con l'ambiente di laboratorio

• Identificare la bilancia, i cilindri graduati, il beker, il mortaio con il pestello, il supporto con la pinza, l'imbuto e i flaconi di reagenti, e indicare a cosa serve ciascuno di essi prima di iniziare.
• Montare un sistema di filtrazione e verificare che sia stabile prima di versarvi qualsiasi cosa.

La manipolazione di un reagente tossico

• Riconoscere il metanolo come tossico per inalazione, ingestione e contatto con la pelle, e lavorare con guanti e protezione per gli occhi, lontano da qualsiasi fiamma, in un'area ventilata.
• Spiega perché l'etanolo 95 % o l'isopropanolo sarebbero altrettanto efficaci nel far precipitare il DNA e rappresentano la scelta più sicura in un laboratorio vero e proprio.

Preparazione di una soluzione acquosa

• Misurare 30 mL di acqua distillata in un cilindro graduato da 70 mL, leggendo la parte inferiore del menisco a livello degli occhi.
• Pesa il cloruro di sodio in una barchetta di pesata su una bilancia tarata, trasferiscilo senza perdite e mescola con una bacchetta di vetro fino a quando non rimangono cristalli.
• Aggiungere un numero contato di gocce di detersivo e mescolare fino ad ottenere una soluzione omogenea.

Disruzione meccanica del tessuto vegetale

• Schiaccia un pezzo di banana con un pestello finché la pasta non è uniforme e spiega perché la macinazione deve precedere la lisi chimica.

Filtrazione per gravità

• Fissa una provetta a circa 30 cm, posiziona un imbuto con una carta da filtro e raccogli circa 15 mL di filtrato.
• Indica ciò che la carta trattiene — frammenti di parete cellulare, granuli di amido e fibre — e ciò che la attraversa.

Precipitazione alcolica

• Misurare 10 mL di metanolo freddo e versarlo lentamente lungo la parete della provetta in modo che si stratifichi sul filtrato invece di mescolarsi con esso.
• Mescola delicatamente e solo quanto basta per mettere a contatto i due liquidi, e spiega perché un'agitazione vigorosa frammenterebbe il precipitato.

Osservazione e interpretazione del risultato

• Descrivere il precipitato in termini di colore, posizione e consistenza, e attribuire ogni fase dell'esperimento al reagente responsabile di essa.
• Distinguer un estratto grezzo dal DNA purificato e indicare cos'altro è presente nella massa appena raccolta.

Protocollo

Sicurezza — metanolo. In questo laboratorio si utilizza il metanolo per precipitare il DNA. Il metanolo è tossico se inalato, ingerito o a contatto con la pelle e, a differenza dell’etanolo, l’organismo lo converte in acido formico, che può causare danni permanenti al nervo ottico. Dosi ben inferiori a 30 mL hanno causato casi di cecità. Indossare guanti e occhiali protettivi, tenere il flacone tappato e lontano da qualsiasi fonte di fiamma, lavorare in un’area ben ventilata, non pipettare mai con la bocca e lavarsi le mani al termine dell’operazione. L’etanolo al 95% % o l’isopropanolo precipitano il DNA altrettanto efficacemente e rappresentano la scelta più sicura se si ripete questo esperimento su un vero banco di laboratorio.

Parte A: Preparazione della soluzione di estrazione

1. Misura 30 mL di acqua distillata usando un cilindro graduato da 70 mL.
2. Trasferire l'acqua distillata in un becher da 50 mL.
3. Pesare la barchetta vuota sulla bilancia.
4. Aggiungere 2,5 mL (5,4 g) di cloruro di sodio nella barchetta di pesata sulla bilancia.
5. Versare il cloruro di sodio nel becher contenente l'acqua distillata.
6. Mescolare la miscela con una bacchetta di vetro finché il sale non si sarà completamente sciolto.
7. Aggiungi 10 gocce di detersivo per piatti nel becher.
8. Mescolare nuovamente la soluzione con la bacchetta di vetro per assicurare una miscela omogenea.

Parte B: Procedura di estrazione del DNA

1. Metti un pezzo di banana in un mortaio.
2. Schiaccia accuratamente la banana con un pestello fino ad ottenere una pasta densa e omogenea.
3. Aggiungere lentamente la soluzione di estrazione preparata nei passaggi da 1 a 10 della parte A, alla pasta di banana nel mortaio.
4. Con la bacchetta di vetro, mescolare bene il contenuto del mortaio per una distribuzione uniforme.
5. Attacca un morsetto universale allo stativo a un'altezza di circa 30 cm.
6. Attacca una provetta alla pinza universale.
7. Posiziona l'imbuto sul provetta.
8. Metti una carta filtro nell'imbuto.
9. Filtra il miscuglio di banana nel provettino, riempiendone circa un terzo (circa 15 mL).
10. Misura 10 mL di metanolo freddo usando un cilindro graduato da 10 mL. Il metanolo è tossico: Indossare guanti e protezione per gli occhi, tenere lontano da qualsiasi fiammata, lavorare in un'area ventilata e non pipettare mai a bocca.
11. Rimuovere l'imbuto e il filtro dalla provetta.
12. Versare lentamente il metanolo lungo la parete della provetta. Il volume del metanolo deve essere circa il doppio di quello del filtrato, quindi ridurre il filtrato a circa 5 mL prima di aggiungere i 10 mL di metanolo.
13. Mescolare delicatamente il contenuto della provetta con una bacchetta di vetro. Evitare di agitare la provetta per non disturbare la soluzione.

Il DNA apparirà come un precipitato grigio, simile a una sostanza filamentosa o gelatinosa.

Risultati Previsti

Ogni reagente in questo protocollo ha un solo compito e ciascuno produce un cambiamento che può essere visto. La tabella sottostante è il riferimento rispetto al quale un insegnante può valutare: associa ogni reagente all'effetto che ha sul campione.

La seconda tabella fornisce l'aspetto previsto in ogni fase, che è ciò che il taccuino delle osservazioni dovrebbe registrare.

Le due grandezze che vale la pena calcolare. La concentrazione della soluzione salina risulta da c = m / (M × V). Con M(NaCl) = 58,44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. Il cloruro di sodio raggiunge la saturazione a circa 359 g/L a 20 °C, ovvero a 6,1 mol/L; pertanto, la soluzione di estrazione è approssimativamente a metà della saturazione ed è diverse volte più concentrata rispetto alle concentrazioni comprese tra 0,15 e 0,5 mol/L utilizzate nella maggior parte dei tamponi di estrazione utilizzati in classe. La precipitazione avviene comunque, poiché l’effetto di schermatura è già saturo ben al di sotto dei 3 mol/L; tuttavia, a uno studente che calcoli tale valore andrebbe precisato che si tratta di un valore insolitamente elevato, anziché lasciargli supporre che sia standard. La seconda quantità è la frazione alcolica: la provetta contiene 15 mL di filtrato e riceve 10 mL di metanolo, quindi l’alcol rappresenta il 10 / (15 + 10) = 40 % in volume. Il DNA inizia a precipitare da soluzione a una concentrazione di alcol compresa tra circa 35 e 40 % e precipita completamente in prossimità di 65–70 %; questo spiega perché il presente protocollo produca il precipitato all’interfaccia, dove la frazione alcolica locale è molto superiore a 40 %, ed è per questo che la provetta viene agitata solo delicatamente anziché capovolta.

Perché il sale e l'alcol devono agire insieme. Al pH della soluzione di estrazione, ogni gruppo fosfodiestere nella catena principale è ionizzato; pertanto, una molecola di DNA è costituita da una catena di cariche negative che si respingono tra loro e respingono le molecole vicine. Gli ioni sodio si aggregano attorno a tali cariche, schermandole. L’intensità con cui vengono trattenuti dipende dal mezzo, secondo la legge di Coulomb F = q₁q₂ / (4πε₀ε_rr²): la permittività relativa ε_r è pari a circa 78 per l’acqua a 25 °C e a circa 33 per il metanolo; pertanto, sostituendo parte dell’acqua con metanolo, l’attrazione tra uno ione sodio e un gruppo fosfato si rafforza di un fattore pari a circa 78 / 33 ≈ 2,4 a parità di distanza. La carica viene neutralizzata in modo più efficace, i filamenti smettono di respingersi e si aggregano. Inoltre, l’alcol forma legami idrogeno con la catena principale molto meno facilmente rispetto all’acqua, quindi il guscio ordinato di molecole d’acqua che mantiene il DNA disciolto viene eliminato. Nessuno dei due reagenti da solo è sufficiente: senza sale l’aggregato schermato non si forma mai, mentre senza alcol il DNA rimane in soluzione.

Perché una massa è visibile mentre una molecola non lo è. Una doppia elica di DNA ha un diametro di circa 2 nm, pari all’incirca a un centesimo del limite di risoluzione di 200 nm di un microscopio a luce visibile e circa 10⁴ a 10⁵ volte più sottile di un capello umano. Nulla di ciò che si vede nella provetta è una singola molecola, e la doppia elica stessa non può essere osservata qui: la sua struttura è stata stabilita mediante diffrazione a raggi X, non guardando un precipitato. Ciò che è visibile è un aggregato di un numero immenso di molecole. L'ordine di grandezza può essere verificato: la banana coltivata è triploide Musa acuminata con 3n = 33 cromosomi, e il genoma aploide è di circa 523 milioni di paia di basi, quindi un nucleo contiene circa 1,6 × 10⁹ paia di basi. Con una media di 650 g/mol per paia di basi, il DNA in un nucleo pesa 1,6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1,7 × 10⁻¹² g, cioè circa 1,7 picogrammi. Un grumo visibile di un milligrammo rappresenta quindi il contenuto nucleare di centinaia di milioni di cellule, motivo per cui un intero pezzo di tessuto deve essere macinato per ottenerlo.

Di cosa si tratta effettivamente il precipitato. In questo protocollo non vengono utilizzate né proteasi né ribonucleasi, e dopo la precipitazione non segue alcuna fase di lavaggio; pertanto, il materiale raccolto è una preparazione grezza di acido nucleico piuttosto che DNA: DNA nucleare insieme a DNA cloroplastico e mitocondriale, una grande quantità di RNA, proteine residue, polisaccaridi provenienti dalla banana e detergente intrappolato. È proprio quella miscela il motivo per cui la massa appare grigia, grumosa e gelatinosa invece di formare il filo bianco e pulito di una preparazione purificata, ed è questa la risposta onesta alla domanda su cosa sia stato estratto.

Riepilogo del compito per intervallo di voti

Classe 9-10

• Concentrazione: che il DNA è presente in ogni cellula vivente e può essere reso visibile con reagenti comuni, e che ogni reagente svolge una funzione ben precisa.
• Attività: eseguire il protocollo e nominare ciascuno strumento man mano che viene utilizzato; registrare l'aspetto della soluzione, della pasta, del filtrato e del precipitato in una tabella simile alla Tabella 2; dichiarare in una frase ciascuno cosa fanno il sapone, il sale e l'alcol; elencare le precauzioni applicabili al metanolo e spiegare perché si applicano; descrivere il precipitato senza pretendere di aver visto una doppia elica.

Undicesimo anno

• Concentrazione: preparazione quantitativa di una soluzione e chimica fisica della precipitazione.
• Attività: calcolare la concentrazione della soluzione di estrazione a partire dalla massa di sale e dal volume d’acqua (3,1 mol/L) e confrontarla con quella di saturazione a 20 °C; calcolare la frazione finale di alcol (40 % in volume) e metterla in relazione con la soglia alla quale il DNA si separa dalla soluzione; spiegare lo schermamento di carica in termini di gruppi fosfato negativi e ioni sodio; prevedere cosa accadrebbe se la quantità di sale fosse dimezzata o se il metanolo fosse sostituito da un volume equivalente di acqua, e giustificare la previsione; spiegare perché l’alcol deve essere freddo e perché la provetta va agitata delicatamente.

12ª classe / Livello universitario

• Concentrazione: la differenza tra un lisato grezzo e un campione utilizzabile a fini analitici, nonché la definizione dei controlli necessari a stabilire il ruolo di ciascun reagente.
• Attività: utilizzare la legge di Coulomb e le permittività relative dell’acqua e del metanolo per spiegare quantitativamente perché l’alcol favorisce l’aggregazione; stimare la massa del DNA presente in un nucleo di banana sulla base della dimensione del genoma triploide e del valore di 650 g/mol per coppia di basi, e utilizzarla per stimare quante cellule rappresenti un aggregato visibile; confrontare questo protocollo con un’estrazione standard da piante, come la procedura CTAB o la colonna di silice, e identificare le fasi qui mancanti — ribonucleasi, proteasi, lavaggio con alcool, risospensione in tampone; spiegare che cos’è un A₂₆₀/A₂₈₀ cosa rivelerebbe tale misurazione riguardo a questo estratto; progettare la serie di controlli che isoli il contributo della macinatura, del detersivo, del sale e dell’alcol, e indicare quale risultato dovrebbe fornire ciascun controllo.

Materiale essenziale di laboratorio

Strumenti

• Bilancia con funzione di tara e una capsula di pesata
• Cucchiai dosatori / spatole (2,5 mL)
• Pinzette
• Becher (50 mL)
• Cilindro graduato (70 mL)
• Provetta graduata (10 mL)
• Bastoncino di vetro
• Contagocce (1 mL)
• Mortaio e pestello
• Supporto in metallo con morsetto universale
• Imbuto e carta da filtro
• Provetta (50 mL)

Prodotti

• Banana (a pezzi)
• Acqua distillata (30 mL)
• NaCl, cristalli (2,5 mL, 5,4 g)
• Detersivo per piatti, liquido (10 gocce)
• Metanolo, liquido, freddo (10 mL) — tossico, vedere la nota sulla sicurezza nel protocollo