026 – ADN vegetal

Extreure ADN és el primer pas de gairebé tots els procediments de biologia molecular: seqüenciar un genoma, comprovar si una varietat de cultiu té un gen de resistència a alguna malaltia, comparar una mostra forense o confirmar un diagnòstic clínic comencen obtenint l'ADN de l'interior de les cèl·lules i posant-lo en un tub. La química és la mateixa a qualsevol escala. Una cèl·lula manté el seu contingut darrere de membranes formades per fosfolípids, i l'ADN del seu interior és un polianió molt llarg; cada grup fosfat al llarg del seu esquelet porta una càrrega negativa a pH neutre. Un detergent dissol les membranes i allibera allò que conté la cèl·lula; la sal dissolta proporciona ions de sodi que apantallen aquestes càrregues negatives, de manera que les cadenes veïnes deixen de repel·lir-se; i un alcohol fred, en el qual l'ADN és molt menys soluble que en l'aigua, fa precipitar les molècules apantallades formant una massa prou gran com per a veure-la a ull nu. El plàtan és un material de partida convenient: la polpa és prou tova per reduir-la a una pasta amb un morter, conté poca fibra i el plàtan comercial és triploide, de manera que cada cèl·lula conté tres jocs de cromosomes. En aquest laboratori preparareu una solució d'extracció a partir d'aigua destil·lada, clorur de sodi i sabó de rentar els plats, triturareu un tros de plàtan fins a obtenir una pasta homogènia, barrejarreu la pasta amb aquesta solució, filtrareu la barreja a través de paper en un tub d'assaig i posareu metanol fred per damunt del filtrat. Al cap d'un moment, apareix un precipitat gris i filós allà on es troben els dos líquids: ADN, juntament amb part del material restant alliberat de les cèl·lules.

Objectius educatius

Familiarització amb l'entorn del laboratori

• Identifiqueu la balança, els cilindres graduats, el vas de precipitats, el morter amb mà de morter, el suport amb pinça, l'embut i els frascos de reactius, i indiqueu per a què s'utilitza cadascun abans de començar.
• Munta un equip de filtració i comprova si és estable abans d'abocar-hi res.

Manipulació d'un reactiu tòxic

• Reconèixer el metanol com a tòxic per inhalació, ingestió i contacte amb la pell, i treballar amb guants i protecció ocular, lluny de qualsevol flama, en una zona ventilada.
• Explica per què l'etanol 95 % o l'isopropanol precipitarien l'ADN igual de bé i per què són l'opció més segura en un banc de treball real.

Preparació d'una solució aquosa

• Mesureu 30 mL d'aigua destil·lada en un proveta graduada de 70 mL, llegint la part inferior del menisc a l'alçada dels ulls.
• Peseu clorur sòdic en una barqueta de pesada en una balança tarada, transfireu-lo sense pèrdues i remeneu amb una vareta de vidre fins que no hi queden cristalls.
• Afegiu un nombre comptat de gotes de detergent i barregeu fins a obtenir una solució homogènia.

Disrupció mecànica del teixit vegetal

• Aixafar un tros de plàtan amb un morter fins que la pasta sigui uniforma, i expliqueu per què la trituració ha de precedir la lisi química.

Filtració per gravetat

• Fixeu un tub d'assaig a uns 30 cm, col·loqueu un embut amb un paper de filtre i recolliu aproximadament 15 mL de filtrat.
• Indiqueu què reté el paper —fragments de paret cel·lular, grans de midó i fibra— i què hi passa a través.

Precipitació alcohòlica

• Mesureu 10 mL de metanol fred i aboqueu-lo lentament per la paret del tub d'assaig de manera que quedi en una capa sobre el filtrat en lloc de barrejar-se-hi.
• Barrejareu suaument i just el necessari per posar en contacte els dos líquids, i expliqueu per què una agitació vigorosa trencaria el precipitat.

Observació i interpretació del resultat

• Descriviu el precipitat pel que fa al color, la posició i la textura, i atribuïu cada etapa de l'experiment al reactiu responsable.
• Distinguiu un extracte cru d'ADN purificat i anomeneu què més és present a la massa que tot just s'ha recollit.

Protocol

Seguretat: metanol. Aquest laboratori utilitza metanol per precipitar l'ADN. El metanol és tòxic per inhalació, ingestió i contacte amb la pell i, a diferència de l'etanol, el cos el converteix en àcid fòrmic, que pot danyar de manera permanent el nervi òptic. Dosis inferiors a 30 mL han causat ceguesa. Porteu guants i protecció ocular, manteniu l'ampolla tapada i allunyada de qualsevol flama, treballeu en una zona ventilada, no pipetegeu mai amb la boca i renteu-vos les mans després. L'etanol al 95 % o l'isopropanol precipiten l'ADN igual de bé i són l'opció més segura si repetiu aquest experiment en un banc de treball real.

Part A: Preparació de la solució d'extracció

1. Mesura 30 ml d'aigua destil·lada utilitzant un tub d'assaig graduat de 70 ml.
2. Transferiu l'aigua destil·lada a un vas de precipitats de 50 mL.
3. Pesa el vaixell de pesada buit a la balança.
4. Afegiu 2,5 ml (5,4 g) de clorur de sodi a la barqueta de pesatge a la balança.
5. Aboca el clorur de sodi al vas de precipitats que conté l'aigua destil·lada.
6. Remeneu la barreja amb una vareta de vidre fins que la sal es dissolgui completament.
7. Afegiu 10 gotes de sabó per plats al vas de precipitats.
8. Remeneu la solució de nou amb la vareta de vidre per assegurar una barreja homogènia.

Part B: Procediment d'extracció d'ADN

1. Posa un tros de plàtan en un morter.
2. Aixafa bé el plàtan amb un morter fins a obtenir una pasta espessa i homogènia.
3. Afegiu lentament la solució d'extracció preparada durant els passos de l'1 al 10 de la part A, a la pasta de plàtan del morter.
4. Amb la vareta de vidre, barregeu bé el contingut del morter per a una distribució uniforme.
5. Fixeu una pinça universal al suport a una alçada d'uns 30 cm.
6. Connecteu un tub d'assaig a la pinça universal.
7. Col·loca l'embut sobre el tub d'assaig.
8. Col·loca un paper de filtre a l'embut.
9. Filtreu la barreja de plàtan al tub d'assaig, omplint aproximadament un terç (uns 15 ml).
10. Mesura 10 ml de metanol fred amb un cilindre graduat de 10 ml. El metanol és tòxic: porteu guants i protecció ocular, mantingueu-ho allunyat de qualsevol flama, treballeu en una zona ventilada i no pipetegeu mai amb la boca.
11. Retira l'embut i el filtre del tub d'assaig.
12. Aboqueu lentament el metanol al llarg de la paret del tub d'assaig. El volum de metanol ha de ser aproximadament el doble del del filtrat, així que reduïu el filtrat a uns 5 mL abans d'afegir els 10 mL de metanol.
13. Barreja suaument el contingut del tub d'assaig amb una vareta de vidre. Evita agitar el tub d'assaig per a no remenar la solució.

El DNA apareixerà com un precipit gris, semblant a una substància filamentosa o gelatinosa.

Resultats previstos

Cada reactiu d'aquest protocol té una sola funció, i cadascun produeix un canvi que es pot veure. La taula següent és la referència amb la qual un professor pot avaluar: aparella cada reactiu amb l'efecte que té sobre la mostra.

La segona taula mostra l'aspecte esperat en cada etapa, que és el que s'ha d'anotar al quadern d'observació.

Les dues quantitats que val la pena calcular. La concentració de la solució salina es desprèn de c = m / (M × V). Amb M(NaCl) = 58,44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. El clorur de sodi satura a uns 359 g/L a 20 °C, o 6,1 mol/L, de manera que la solució d'extracció està aproximadament a la meitat saturada i és diverses vegades més concentrada que els 0,15 a 0,5 mol/L que utilitzen la majoria dels tampons d'extracció de l'aula. La precipitació encara funciona, perquè l'efecte de pantalla ja està saturat molt per sota dels 3 mol/L, però a un estudiant que calculi el valor se li hauria d'indicar que és inusualment alt en lloc de deixar-lo suposar que és estàndard. La segona quantitat és la fracció d'alcohol: la proveta conté 15 mL de filtrat i se li afegeixen 10 mL de metanol, de manera que l'alcohol representa 10 / (15 + 10) = 40 % en volum. L'ADN comença a sortir de la solució a uns 35-40 volums d'alcohol i precipita completament a prop de 65-70 volums, motiu pel qual aquest protocol produeix el seu precipitat a la interfície, on la fracció local d'alcohol és molt més alta que 40 volums. i per què la proveta només es remou suaument en lloc d'invertir-la.

Per què la sal i l'alcohol han d'actuar conjuntament. Pel pH de la solució d'extracció, cada grup fosfodièster de l'esquelet està ionitzat, de manera que una molècula d'ADN és una cadena de càrregues negatives que es repel·leixen mútuament i repel·leixen les molècules veïnes. Els ions de sodi s'amunteguen al voltant d'aquestes càrregues i les apantallen. La força amb què es retenen depèn del medi, a través de la llei de Coulomb F = q₁q₂ / (4πε₀ε_rr²): la permitivitat relativa ε_r és d'uns 78 per a l'aigua a 25 °C i d'uns 33 per al metanol, de manera que substituir una part de l'aigua per metanol enforteix l'atracció entre un ió de sodi i un grup fosfat en un factor d'aproximadament 78 / 33 ≈ 2,4 a la mateixa separació. La càrrega es neutralitza més eficaçment, les cadenes deixen de repel·lir-se i s'agreguen. L'alcohol també forma enllaços d'hidrogen amb el esquelet menys fàcilment del que ho fa l'aigua, de manera que la capa ordenada de molècules d'aigua que manté l'ADN dissolt s'elimina. Cap reactiu per si sol no és suficient: sense la sal no es forma mai l'agregat apantallat, i sense l'alcohol l'ADN es manté en solució.

Per què una massa és visible quan una molècula no ho és. Una doble hèlix d'ADN fa aproximadament 2 nm d'amplada, més o menys una centèsima part del límit de resolució de 200 nm d'un microscopi de llum visible i unes 10⁴ a 10⁵ vegades més prim que un cabell humà. Res del que es veu al tub d'assaig és una sola molècula, i la doble hèlix en si no es pot observar aquí: la seva estructura es va establir mitjançant difracció de raigs X, no mirant un precipitat. El que és visible és un agregat d'un nombre immens de molècules. L'ordre de magnitud es pot comprovar: el plàtan cedit és triploide Musa acuminata amb 3n = 33 cromosomes, i el genoma haploide és d'uns 523 milions de parells de bases, de manera que un nucli conté aproximadament 1,6 × 10⁹ parells de bases. Amb un pes mitjà de 650 g/mol per parell de bases, l'ADN d'un nucli pesa 1,6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1,7 × 10⁻¹² g, això equival a aproximadament 1,7 picograms. Per tant, un cúmul visible d'un mil·ligram representa el contingut nuclear de centenars de milions de cèl·lules, motiu pel qual s'ha de triturar un tros sencer de teixit per obtenir-lo.

Què és realment el precipitat. En aquest protocol no s'utilitza ni proteasa ni ribonucleasa, i no hi ha cap pas de rentat després de la precipitació, de manera que el material recollit és una preparació d'àcids nucleics en brut més que no pas ADN: ADN nuclear juntament amb ADN de cloroplasts i mitocondris, una gran quantitat d'RNA, proteïna residual, polisacàrid de la banana i detergent atrapat. Aquesta barreja és el motiu pel qual la massa sembla grisa, de consistència terrosa i gelatinosa en lloc de formar el filament blanc i net d'una preparació purificada, i és la resposta sincera a la pregunta de què s'ha extret.

Resum de tasques per rang de qualificació

De 9è a 10è grau

• Enfocament que l'ADN és present a cada cèl·lula viva i es pot fer visible amb reactius ordinaris, i que cada reactiu té una funció identificable.
• Activitats: dueu a terme el protocol i anomeneu cada instrument a mesura que s'utilitzi; registreu l'aspecte de la solució, de la pasta, del filtrat i del precipitat en una taula com la Taula 2; indiqueu en una sola frase per a cadascun què fan el sabó, la sal i l'alcohol; enumereu les precaucions que s'apliquen al metanol i expliqueu per què s'apliquen; descriviu el precipitat sense assegurar haver vist una doble hèlix.

11è curs

• Enfocament preparació quantitativa d'una solució i la fisicoquímica de la precipitació.
• Activitats: calcular la concentració de la solució d'extracció a partir de la massa de sal i el volum d'aigua (3,1 mol/L) i comparar-la amb la saturació a 20 °C; calcular la fracció final d'alcohol (40 % en volum) i relacionar-la amb el llindar al qual l'ADN surt de solució; explicar l'apantallament de càrrega en termes dels grups fosfat negatius i dels ions de sodi; preveure què passaria si la sal es reduís a la meitat o si el metanol es substituís per un volum igual d'aigua, i justificar la predicció; explicar per què l'alcohol ha d'estar fred i per què la proveta es remena suaument.

12è curs / Nivell universitari

• Enfocament la distància entre un lisat cru i una mostra analíticament útil, i el disseny dels controls que establirien el paper de cada reactiu.
• Activitats: Utilitzeu la llei de Coulomb i les permitivitats relatives de l'aigua i el metanol per argumentar quantitativament per què l'alcohol promou l'agregació; estimeu la massa d'ADN en un nucli de plàtan a partir de la mida del genoma triploide i 650 g/mol per parell de bases, i utilitzeu-la per estimar quantes cèl·lules representa un cúmul visible; compareu aquest protocol amb una extracció vegetal estàndard com un procediment CTAB o una columna de sílice, i identifiqueu els passos que falten aquí — ribonucleasa, proteasa, un rentat amb alcohol, ressuspensió en tampó; expliqueu què és un A₂₆₀/A₂₈₀ la mesura revelaria sobre aquest extracte; dissenyeu la sèrie de control que aïlla la contribució de la trituració, el detergent, la sal i l'alcohol, i indiqueu quin resultat hauria de donar cada control.

Equipament de laboratori

Instruments

• Balança amb funció de tara i una cullera pesadora
• Culleretes / espàtules mesuradores (2,5 mL)
• Pinces
• Vas de precipitats (50 mL)
• Proveta graduada (70 mL)
• Proveta graduada (10 mL)
• Barra de vidre
• Comptagotes (1 mL)
• Morter i mà de morter
• Suport metàl·lic amb mordassa universal
• Embut i paper de filtre
• Proveta (50 mL)

Productes

• Plàtan (trossos)
• Aigua destil·lada (30 mL)
• NaCl, cristalls (2,5 mL, 5,4 g)
• Rentaplats líquid (10 gotes)
• Metanol, líquid, fred (10 mL) — tòxic, vegeu la nota de seguretat del protocol