026 – ADN vegetal

La extracción de ADN es el primer paso de casi todos los procedimientos en biología molecular: secuenciar un genoma, analizar una variedad de cultivo para detectar un gen de resistencia a enfermedades, comparar una muestra forense o confirmar un diagnóstico clínico comienzan con la extracción del ADN de las células y su colocación en un tubo. La química es la misma a cualquier escala. Una célula mantiene su contenido tras membranas formadas por fosfolípidos, y el ADN que contiene es un polianión muy largo: cada grupo fosfato a lo largo de su esqueleto porta una carga negativa a pH neutro. Un detergente disuelve las membranas y libera el contenido celular; la sal disuelta aporta iones de sodio que neutralizan esas cargas negativas, de modo que las hebras vecinas dejan de repelerse entre sí; y un alcohol frío, en el que el ADN es mucho menos soluble que en agua, precipita entonces las moléculas neutralizadas formando una masa lo suficientemente grande como para verla a simple vista. El plátano es un material de partida conveniente: la pulpa es lo suficientemente blanda como para reducirla a una pasta con un mortero, contiene poca fibra y el plátano cultivado es triploide, por lo que cada célula porta tres juegos de cromosomas. En este laboratorio preparará una solución de extracción a partir de agua destilada, cloruro de sodio y lavavajillas, triturará un trozo de plátano hasta obtener una pasta homogénea, mezclará la pasta con dicha solución, filtrará la mezcla a través de papel en un tubo de ensayo y añadirá metanol frío en la superficie del filtrado. Al cabo de unos instantes aparece un precipitado gris y filamentoso donde se encuentran los dos líquidos: ADN, junto con parte del resto del material liberado de las células.

Objetivos Educativos

Familiarización con el entorno del laboratorio

• Identifique la balanza, las probetas graduadas, el vaso de precipitados, el mortero con mano, el soporte con pinza, el embudo y los frascos de reactivos, y explique para qué se utiliza cada uno antes de empezar.
• Monta un equipo de filtración y comprueba que sea estable antes de verter nada en él.

Manejo de un reactivo tóxico

• Reconocer que el metanol es tóxico por inhalación, ingestión y contacto con la piel, y trabajar con guantes y protección ocular, lejos de cualquier llama, en un área ventilada.
• Explica por qué el etanol 95 % o el isopropanol precipitarían el ADN igual de bien y son la opción más segura en un laboratorio real.

Preparación de una solución acuosa

• Mida 30 mL de agua destilada en una probeta graduada de 70 mL, leyendo la parte inferior del menisco a la altura de los ojos.
• Pese cloruro de sodio en un platillo de pesaje en una balanza tarada, transfiéralo sin pérdida y agite con una varilla de vidrio hasta que no queden cristales.
• Añadir un número contado de gotas de detergente y mezclar hasta obtener una solución homogénea.

Disrupción mecánica del tejido vegetal

• Tritura un trozo de banana con un mortero hasta que la pasta esté uniforme y explica por qué la trituración debe preceder a la lisis química.

Filtración por gravedad

• Sujete un tubo de ensayo a unos 30 cm, coloque un embudo con un papel de filtro y recoja aproximadamente 15 mL de filtrado.
• Señale lo que retiene el papel —fragmentos de pared celular, granos de almidón y fibra— y lo que pasa a través de él.

Precipitación por alcohol

• Mida 10 mL de metanol frío y viértalo lentamente por la pared del tubo de ensayo para que forme una capa sobre el filtrado en lugar de mezclarse con él.
• Mezcle suavemente y solo lo necesario para poner en contacto los dos líquidos, y explique por qué una agitación vigorosa rompería el precipitado.

Observación e interpretación del resultado

• Describe el precipitado en cuanto a su color, ubicación y textura, y atribuye cada fase del experimento al reactivo responsable de la misma.
• Distingue un extracto bruto del ADN purificado y señala qué otros componentes están presentes en la muestra que acabas de recoger.

Protocolo

Seguridad: metanol. En este laboratorio se utiliza metanol para precipitar el ADN. El metanol es tóxico por inhalación, ingestión y contacto con la piel y, a diferencia del etanol, el organismo lo transforma en ácido fórmico, que puede dañar de forma permanente el nervio óptico. Se han dado casos de ceguera con dosis muy inferiores a 30 ml. Utiliza guantes y protección ocular, mantén el frasco tapado y alejado de cualquier llama, trabaja en un lugar bien ventilado, nunca pipetees con la boca y lávate las manos después. El etanol al 95 % % o el isopropanol precipitan el ADN igual de bien y son la opción más segura si repites este experimento en un laboratorio real.

Parte A: Preparación de la solución de extracción

1. Mide 30 ml de agua destilada utilizando una probeta graduada de 70 ml.
2. Transfiera el agua destilada a un vaso de precipitados de 50 mL.
3. Pese la barquilla de pesaje vacía en la balanza.
4. Agregue 2.5 mL (5.4 g) de cloruro de sodio a la cápsula de pesaje en la balanza.
5. Vierte el cloruro de sodio en el vaso de precipitados que contiene el agua destilada.
6. Agite la mezcla con una varilla de vidrio hasta que la sal se disuelva por completo.
7. Añade 10 gotas de jabón para platos al vaso de precipitados.
8. Remueve la solución nuevamente con la varilla de vidrio para asegurar una mezcla homogénea.

Parte B: Procedimiento de extracción de ADN

1. Coloca un trozo de plátano en un mortero.
2. Tritura bien el plátano con un mortero hasta obtener una pasta espesa y homogénea.
3. Agregue lentamente la solución de extracción preparada durante los pasos del 1 al 10 de la parte A, a la pasta de plátano en el mortero.
4. Con la varilla de vidrio, mezcle bien el contenido del mortero para una distribución uniforme.
5. Fije una abrazadera universal al soporte a una altura de aproximadamente 30 cm.
6. Sujeta un tubo de ensayo a la pinza universal.
7. Coloca el embudo sobre el tubo de ensayo.
8. Coloca un papel de filtro en el embudo.
9. Filtra la mezcla de plátano en el tubo de ensayo, llenando aproximadamente un tercio (unos 15 ml).
10. Mida 10 mL de metanol frío usando una probeta graduada de 10 mL. El metanol es tóxico: Utiliza guantes y protección ocular, mantén el producto alejado de cualquier llama, trabaja en un lugar bien ventilado y nunca pipetees con la boca.
11. Retire el embudo y el filtro del tubo de ensayo.
12. Vierta lentamente el metanol a lo largo de la pared del tubo de ensayo. El volumen de metanol debe ser aproximadamente el doble que el del filtrado, así que reduzca el filtrado a unos 5 mL antes de añadir los 10 mL de metanol.
13. Mezcle suavemente el contenido del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. Evite agitar el tubo de ensayo para no alterar la solución.

El ADN aparecerá como un precipitado gris, que se asemeja a una sustancia fibrosa o gelatinosa.

Resultados esperados

Cada reactivo en este protocolo tiene una función, y cada uno produce un cambio que se puede ver. La tabla a continuación es la referencia con la que un profesor puede calificar: empareja cada reactivo con el efecto que tiene en la muestra.

La segunda tabla indica el aspecto esperado en cada etapa, que es lo que el cuaderno de observaciones debe registrar.

Las dos cantidades que vale la pena calcular. La concentración de la solución salina se deduce de c = m / (M × V). Con M(NaCl) = 58,44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. El cloruro de sodio se satura a unos 359 g/L a 20 °C, es decir, a 6,1 mol/L, por lo que la solución de extracción está aproximadamente a la mitad de su saturación y es varias veces más concentrada que las soluciones tampón de extracción que se utilizan habitualmente en las aulas, que suelen tener una concentración de entre 0,15 y 0,5 mol/L. La precipitación sigue funcionando, ya que el efecto de cribado ya está saturado muy por debajo de los 3 mol/L, pero a un alumno que calcule este valor se le debería indicar que es inusualmente alto, en lugar de dejar que dé por sentado que es el valor estándar. La segunda cantidad es la fracción de alcohol: el tubo contiene 15 ml de filtrado y se le añaden 10 ml de metanol, por lo que el alcohol representa 10 / (15 + 10) = 40 % en volumen. El ADN comienza a precipitarse a una concentración de alcohol de aproximadamente entre 35 y 40 % y se precipita por completo cerca de los 65 a 70 %, razón por la cual este protocolo produce el precipitado en la interfaz, donde la fracción de alcohol local es mucho mayor que 40 %, y por eso el tubo solo se agita suavemente en lugar de invertirse.

Por qué la sal y el alcohol tienen que actuar juntos. A pH de la solución de extracción, cada grupo fosfodiéster en la estructura principal está ionizado, de modo que una molécula de ADN es una cadena de cargas negativas que se repelen entre sí y repelen a las moléculas vecinas. Los iones de sodio se agrupan alrededor de esas cargas y las apantallan. Con qué fuerza se retienen depende del medio, a través de la ley de Coulomb. F = q₁q₂ / (4πε₀ε_rr²): la permitividad relativa ε_r es de aproximadamente 78 para el agua a 25 °C y de unos 33 para el metanol, por lo que reemplazar parte del agua con metanol fortalece la atracción entre un ion de sodio y un grupo fosfato en un factor de aproximadamente 78 / 33 ≈ 2.4 a la misma separación. La carga se neutraliza con mayor eficacia, las cadenas dejan de repelerse y se agregan. El alcohol también forma enlaces de hidrógeno con la cadena principal con mucha menos facilidad que el agua, por lo que la capa ordenada de moléculas de agua que mantiene disuelto el ADN es eliminada. Ninguno de los dos reactivos por sí solo es suficiente: sin sal nunca se forma el agregado apantallado y sin alcohol el ADN permanece en solución.

Por qué una masa es visible cuando una molécula no lo es. Una doble hélice de ADN mide aproximadamente 2 nm de ancho, más o menos una centésima parte del límite de resolución de 200 nm de un microscopio de luz visible y unas 10⁴ hasta 10⁵ veces más delgado que un cabello humano. Nada de lo que se ve en el tubo de ensayo es una sola molécula, y la doble hélice en sí misma no se puede observar aquí; su estructura se estableció mediante difracción de rayos X, no observando un precipitado. Lo que es visible es un agregado de un número inmenso de moléculas. El orden de magnitud se puede comprobar: el plátano cultivado es triploide Musa acuminata con 3n = 33 cromosomas, y el genoma haploide es de aproximadamente 523 millones de pares de bases, por lo que un núcleo contiene aproximadamente 1.6 × 10⁹ pares de bases. A un promedio de 650 g/mol por par de bases, el ADN en un núcleo pesa 1.6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1,7 × 10⁻¹² g, que equivale a unos 1,7 picogramos. Por lo tanto, un cúmulo visible de un miligramo representa el contenido nuclear de cientos de millones de células, razón por la cual hay que triturar un trozo entero de tejido para obtenerlo.

Lo que es realmente el precipitado. En este protocolo no se utilizan proteasas ni ribonucleasas, y no sigue ningún paso de lavado después de la precipitación, por lo que el material recolectado es una preparación de ácidos nucleicos en bruto en lugar de ADN: ADN nuclear junto con ADN de cloroplastos y mitocondrias, una gran cantidad de ARN, proteínas residuales, polisacáridos del plátano y detergente atrapado. Esa mezcla es la razón por la cual la masa se ve gris, grumosa y gelatinosa en lugar de formar el hilo blanco y limpio de una preparación purificada, y es la respuesta honesta a la pregunta de qué se ha extraído.

Resumen de la asignación por rango de calificación

Grados 9–10

• Enfoque: que el ADN está presente en cada célula viva y puede hacerse visible con reactivos ordinarios, y que cada reactivo tiene una función identificable.
• Actividades Lleve a cabo el protocolo y nombre cada instrumento a medida que se utilice; registre el aspecto de la solución, la pasta, el filtrado y el precipitado en una tabla como la Tabla 2; indique en una sola oración qué hacen el jabón, la sal y el alcohol; enumere las precauciones aplicables al metanol y explique por qué se aplican; describa el precipitado sin afirmar haber visto una doble hélice.

Undécimo grado

• Enfoque: preparación cuantitativa de una disolución y la fisicoquímica de la precipitación.
• Actividades calcular la concentración de la solución de extracción a partir de la masa de sal y el volumen de agua (3,1 mol/l) y compararla con la concentración de saturación a 20 °C; calcular la fracción final de alcohol (40 % en volumen) y relacionarla con el umbral a partir del cual el ADN se precipita de la solución; explicar el enmascaramiento de cargas en función de los grupos fosfato negativos y los iones sodio; predecir qué ocurriría si se redujera a la mitad la cantidad de sal o se sustituyera el metanol por un volumen igual de agua, y justificar la predicción; explicar por qué el alcohol debe estar frío y por qué se agita suavemente el tubo.

12.º curso / Nivel universitario

• Enfoque: la distancia entre un lisado crudo y una muestra analíticamente útil, y el diseño de los controles que establecerían el papel de cada reactivo.
• Actividades Usa la ley de Coulomb y las permitividades relativas del agua y el metanol para argumentar cuantitativamente por qué el alcohol promueve la agregación; estima la masa de ADN en un núcleo de banano a partir del tamaño del genoma triploide y 650 g/mol por par de bases, y utilízala para estimar cuántas células representa un grumo visible; compara este protocolo con una extracción vegetal estándar, como un procedimiento con CTAB o una columna de sílice, e identifica los pasos que faltan aquí: ribonucleasa, proteasa, un lavado con alcohol, resuspensión en tampón; explica qué es un A₂₆₀/A₂₈₀ la medición revelaría sobre este extracto; diseñe la serie de control que aísle la contribución de la trituración, el detergente, la sal y el alcohol, y establezca qué resultado tendría que arrojar cada control.

Esenciales de laboratorio

Instrumentos

• Balanza con función de tara y cápsula de pesaje
• Cucharas medidoras / espátulas (2,5 mL)
• Pinzas
• Vaso de precipitados (50 mL)
• Probeta graduada (70 mL)
• Probeta graduada (10 mL)
• Varilla de vidrio
• Gotero (1 mL)
• Mortero y maja
• Soporte metálico con abrazadera universal
• Embudo y papel de filtro
• Tubo de ensayo (50 mL)

Productos

• Plátano (en trozos)
• Agua destilada (30 mL)
• NaCl, cristales (2.5 mL, 5.4 g)
• Jabón para platos, líquido (10 gotas)
• Metanol, líquido, frío (10 mL) — tóxico, ver la nota de seguridad en el protocolo