026 – Rostlinná DNA

Izolace DNA je prvním krokem téměř každého postupu v molekulární biologii: sekvenování genomu, testování odrůdy plodiny na gen odolnosti vůči chorobám, porovnání forenzního vzorku nebo potvrzení klinické diagnózy – to vše začíná tím, že se DNA dostane z buněk do zkumavky. Chemie je v každém měřítku stejná. Buňka uchovává svůj obsah za membránami tvořenými fosfolipidy a DNA uvnitř je velmi dlouhý polyaniont – každá fosfátová skupina na její páteři nese při neutrálním pH jeden záporný náboj. Detergent rozpustí membrány a uvolní obsah buňky; rozpuštěná sůl dodává sodné ionty, které stíní tyto záporné náboje, takže sousední řetězce se přestanou vzájemně odpuzovat; a studený alkohol, ve kterém je DNA mnohem méně rozpustná než ve vodě, pak vytlačí odstíněné molekuly z roztoku v podobě hmoty dostatečně velké na to, aby byla viditelná pouhým okem. Banán je vhodný výchozí materiál: dužina je dostatečně měkká na to, aby ji bylo možné tloučkem rozmělnit na pastu, obsahuje málo vlákniny a pěstovaný banán je triploidní, takže každá buňka nese tři sady chromozomů. V této laboratoři připravíte extrakční roztok z destilované vody, chloridu sodného a saponátu na nádobí, rozmělníte kousek banánu na homogenní pastu, smícháte pastu s tímto roztokem, přefiltrujete směs přes papír do zkumavky a na filtrát opatrně vrstvíte studený metanol. Během chvíle se na rozhraní obou kapalin objeví šedá, vláknitá sraženina – DNA spolu s některými dalšími látkami uvolněnými z buněk.

Vzdělávací cíle

Seznámení s laboratorním prostředím

• Před zahájením identifikujte váhy, odměrné válce, kádinku, hmoždíř s tloučkem, stojan se svorkou, nálevku a reagenční lahvičky a ukažte, k čemu se každá z nich používá.
• Sestavte filtrační aparaturu a předtím, než do ní cokoliv nalijete, posuďte, zda je stabilní.

Zacházení s toxickým činidlem

• Uvědomte si, že methanol je toxický při vdechnutí, požití a styku s kůží, a pracujte v rukavicích a s ochranou očí, mimo dosah jakéhokoli plamene, v odvětrávaném prostoru.
• Vysvětlete, proč by ethanol 95 % nebo isopropanol vylučovaly DNA stejně dobře a proč představují bezpečnější volbu při praktické práci v laboratoři.

Příprava vodného roztoku

• Odměřte 30 ml destilované vody v 70ml odměrném válci, přičemž spodní část menisku odečtěte v úrovni očí.
• Zvažte chlorid sodný v lodičce na vynulovaných vahách, beze ztráty jej přeneste a míchejte skleněnou tyčinkou, dokud nezmizí všechny krystaly.
• Přidejte předepsaný počet kapek saponátu a promíchejte na homogenní roztok.

Mechanické narušení rostlinného pletiva

• Rozmačkejte kousek banánu v hmoždíři tloučkem, dokud nevznikne stejnorodá kaše, a vysvětlete, proč drcení musí předcházet chemické lýze.

Gravitační filtrace

• Upevněte zkumavku zhruba ve 30 cm, nasaďte nálevku s filtračním papírem a zachyťte přibližně 15 ml filtrátu.
• Uveďte, co papír zadržuje – fragmenty buněčných stěn, škrobová zrna a vlákninu – a co jím prochází.

Alkoholová srážení

• Odměřte 10 ml studeného methanolu a pomalu jej nalijte po stěně zkumavky tak, aby se vrstvil na filtrátu místo toho, aby se s ním smíchal.
• Promíchejte jemně a jen tak ‚tak, aby se obě kapaliny dostaly do kontaktu, a vysvětlete, proč by prudké třepání srazilo sraženinu.

Pozorování a interpretace výsledku

• Popište sraženinu z hlediska barvy, umístění a konzistence a přisuzujte každou fázi experimentu činidlu, které za ni zodpovídá.
• Rozlišujte mezi surovým extraktem a vyčištěnou DNA a uveďte, co dalšího je přítomno v právě odebrané hmotě.

Protokol

Bezpečnost – methanol. V tomto laboratorním cvičení se k vysrážení DNA používá methanol. Methanol je toxický při vdechování, požití i při kontaktu s kůží a na rozdíl od etanolu ho tělo přeměňuje na kyselinu mravenčí, která může trvale poškodit zrakový nerv. K slepotě vedly již dávky výrazně nižší než 30 ml. Noste rukavice a ochranné brýle, láhev udržujte uzavřenou a mimo dosah jakéhokoli plamene, pracujte ve větraném prostoru, nikdy nepipetujte ústy a po skončení si umyjte ruce. Ethanol 95 % nebo isopropanol vysrážejí DNA stejně dobře a jsou bezpečnější volbou, pokud budete tento experiment opakovat na skutečné laboratorní lavici.

Část A: Příprava extrakčního roztoku

1. Odměřte 30 ml destilované vody pomocí 70 ml odměrného válce.
2. Přelijte destilovanou vodu do 50 mL kádinky.
3. Zvažte prázdný vážící lodičku na váze.
4. Přidejte 2,5 ml (5,4 g) chloridu sodného na vážící lodičku na váze.
5. Nalijte chlorid sodný do kádinky s destilovanou vodou.
6. Směs míchejte skleněnou tyčinkou, dokud se sůl zcela nerozpustí.
7. Přidejte do kádinky 10 kapek prostředku na nádobí.
8. Roztok znovu promíchejte skleněnou tyčinkou, abyste zajistili homogenní směs.

Část B: Postup extrakce DNA

1. Vložte kousek banánu do hmoždíře.
2. Opatrně rozmačkejte banán tloučkem, dokud nezískáte hustou homogenní kaši.
3. Pomalu přidávejte extrakční roztok připravený v krocích 1 až 10 části A do banánové pasty v hmoždíři.
4. Skleněnou tyčinkou obsah třecí misky dobře promíchejte, aby se rovnoměrně rozprostřel.
5. Připevněte univerzální svorku ke stojanu ve výšce asi 30 cm.
6. Připevněte zkumavku k univerzální svorce.
7. Umístěte nálevku na zkumavku.
8. Vložte filtrační papír do nálevky.
9. Směs banánů přefiltrujte do zkumavky, naplňte ji asi do jedné třetiny (asi 15 ml).
10. Změřte 10 ml studeného methanolu pomocí 10ml odměrného válce. Metanol je toxický: Používejte rukavice a ochranu očí, chraňte před jakýmkoliv plamenem, pracujte v dobře větraném prostoru a nikdy nepipetujte ústy.
11. Odstraňte nálevku a filtr z zkumavky.
12. Pomalu nalijte methanol po stěně zkumavky. Objem methanolu by měl být přibližně dvakrát větší než objem filtrátu, takže filtrát před přidáním 10 ml methanolu zredukujte na asi 5 ml.
13. Opatrně promíchejte obsah zkumavky skleněnou tyčinkou. Vyvarujte se třesení zkumavkou, abyste nenarušili roztok.

DNA se objeví jako šedá sraženina, připomínající vláknitou nebo želatinovou látku.

Předvídané výsledky

Každé činidlo v tomto protokolu má svůj úkol a každé z nich vyvolá změnu, kterou lze vidět. Tabulka níže slouží jako referenční příručka, podle které může učitel hodnotit: spojuje každé činidlo s jeho účinkem na vzorek.

Druhá tabulka uvádí vzhled očekávaný v každé fázi, což je to, co by měl pozorovací zápisník zaznamenat.

Ty dvě veličiny stojí za to vypočítat. Koncentrace solného roztoku vyplývá z c = m / (M × V). S M(NaCl) = 58,44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. Chlorid sodný se nasycuje při přibližně 359 g/l při 20 °C, což odpovídá 6,1 mol/l, takže extrakční roztok je zhruba z poloviny nasycený a několikrát koncentrovanější než roztoky o koncentraci 0,15 až 0,5 mol/l, které se běžně používají jako extrakční pufry ve výuce. Srážení stále funguje, protože screeningový efekt je již nasycený při koncentracích hluboko pod 3 mol/l, ale student, který tuto hodnotu vypočítá, by měl být upozorněn, že je neobvykle vysoká, a neměl by být ponechán v domnění, že se jedná o standardní hodnotu. Druhou veličinou je podíl alkoholu: zkumavka obsahuje 15 ml filtrátu a přidá se do ní 10 ml metanolu, takže alkohol představuje 10 / (15 + 10) = 40 % objemových. DNA se začíná vysrážet z roztoku při frakci alkoholu přibližně 35 až 40 % a zcela se vysráží při frakci 65 až 70 %, což je důvod, proč se při tomto postupu sraženina tvoří na rozhraní, kde je lokální frakce alkoholu mnohem vyšší než 40 %, a proto se zkumavka pouze jemně promíchává, místo aby se převracela.

Proč sůl a alkohol musejí působit společně. Při pH extrakčního roztoku je každá fosfodiesterová skupina v páteřním řetězci ionizovaná, takže molekula DNA je řetězcem záporných nábojů, které se vzájemně odpuzují a odpuzují i sousední molekuly. Sodné ionty se kolem těchto nábojů shlukují a stíní je. Jak pevně jsou drženy, závisí na prostředí prostřednictvím Coulombova zákona F = q₁q₂ / (4πε₀ε_rr²): relativní permitivita ε_r je přibližně 78 pro vodu při 25 °C a asi 33 pro methanol, takže nahrazení části vody methanolem zesiluje přitažlivost mezi sodným iontem a fosfátovou skupinou přibližně 2,4krát (78 / 33 ≈ 2,4) při stejné vzdálenosti. Náboj je efektivněji neutralizován, vlákna se přestávají odpuzovat a tvoří agregáty. Alkohol také tvoří vodíkové vazby s páteří DNA mnohem méně ochotně než voda, takže uspořádaná obálka molekul vody, která udržuje DNA rozpuštěnou, je odstraněna. Ani jedno činidlo samo o sobě nestačí: bez soli se stíněný agregát netvoří a bez alkoholu zůstává DNA v roztoku.

Proč je hmota viditelná, zatímco molekula nikoli. Dvojitá spirála DNA je široká asi 2 nm, což je zhruba jedna setina z 200 nm limitu rozlišení světelného mikroskopu a přibližně 10⁴ do 10⁵ krát tenčí než lidský vlas. Nic z toho, co je vidět v zkumavce, není jediná molekula a samotnou dvojitou šroubovici zde nelze pozorovat – její struktura byla stanovena rentgenovou difrakcí, nikoli pozorováním sraženiny. Viditelný je agregát obrovského množství molekul. Řád velikosti lze ověřit: pěstovaný banánovník je triploidní Musa acuminata s 3n = 33 chromozomů a haploidní genom má přibližně 523 milionů párů bází, takže jádro obsahuje zhruba 1,6 × 10⁹ páry bází. Při průměrné hmotnosti 650 g/mol na jeden pár bází váží DNA v jednom jádře 1,6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1,7 × 10⁻¹² g, to je asi 1,7 pikogramu. Viditelná shluková miligramová část tedy představuje jaderný obsah stamilionů buněk, což je důvod, proč musí být celý kousek tkáně rozemlet, aby se z něj získal.

Co ta sraženina vlastně je. V tomto protokolu se nepoužívá žádná proteáza ani ribonukleáza a po srážení nenásleduje žádný promývací krok, takže získaný materiál představuje spíše surový preparát nukleových kyselin než čistou DNA: jadernou DNA spolu s chloroplastovou a mitochondriální DNA, velké množství RNA, zbytkové bílkoviny, polysacharidy z banánu a zachycený detergent. Tato směs je důvodem, proč má hmota šedivý, hrudkovitý a želatinový vzhled namísto toho, aby tvořila čistě bílé vlákno purifikovaného preparátu, a je to upřímná odpověď na otázku, co bylo vlastně exrahováno.

Shrnutí úkolů podle věkové kategorie

9. až 10. ročník

• Zaměření že DNA je přítomna v každé živé buňce a lze ji zviditelnit běžnými reagenciemi a že každá reagencie má jeden určitý úkol.
• Aktivity: proveďte protokol a při použití pojmenujte každý nástroj; zaznamenejte vzhled roztoku, pasty, filtrátu a sraženiny do tabulky podobné tabulce 2; jednou větou popište, co mýdlo, sůl a alkohol dělají; vyjmenujte preventivní opatření platící pro methanol a vysvětlete, proč platí; popište sraženinu, aniž byste tvrdili, že jste viděli dvoušroubovici.

11. ročník

• Zaměření kvantitativní příprava roztoku a fyzikální chemie srážení.
• Aktivity: vypočítat koncentraci extrakčního roztoku na základě hmotnosti soli a objemu vody (3,1 mol/l) a porovnat ji s nasycenou koncentrací při 20 °C; vypočítejte konečný podíl alkoholu (40 % podle objemu) a vztáhněte jej k prahové hodnotě, při které se DNA vylučuje z roztoku; vysvětlete stínění náboje z hlediska záporných fosfátových skupin a iontů sodíku; předpovězte, co by se stalo, kdyby se množství soli snížilo na polovinu nebo kdyby byl methanol nahrazen stejným objemem vody, a zdůvodněte svou předpověď; vysvětlete, proč musí být alkohol studený a proč se zkumavka jemně promíchává.

12. ročník / Úroveň college

• Zaměření vzdálenost mezi surovým lyzátem a analyticky užitečným vzorkem a návrh kontrol, které by stanovily úlohu každého činidla.
• Aktivity: Použijte Coulombův zákon a relativní permitivity vody a methanolu ke kvantitativnímu zdůvodnění, proč alkohol podporuje srážení; odhadněte hmotnost DNA v jednom banánovém jádře z triploidního genomu a 650 g/mol na jeden pár bází a použijte ji k odhadu, kolik buněk představuje viditelná sraženina; porovnejte tento protokol se standardní rostlinnou extrakcí, jako je CTAB procedura nebo siliková kolonka, a identifikujte zde chybějící kroky – ribonukleázu, proteázu, promytí alkoholem, resuspenzi v pufru; vysvětlete, co A₂₆₀/A₂₈₀ měření by o tomto extraktu odhalila; navrhněte kontrolní řadu, která izoluje příspěvek mletí, detergentu, soli a alkoholu, a uveďte, jaký výsledek by každá kontrola musela vykazovat.

Laboratorní potřeby

Nástroje

• Váha s funkcí tare a vážicí lodička
• Odměrné lžíce / stěrky (2,5 ml)
• Pinzeta
• Kádinka (50 ml)
• Odměrný válec (70 ml)
• Odměrný válec (10 ml)
• Skleněná tyč
• Kapátko (1 ml)
• Hmoždíř a tlouček
• Kovový stojan s univerzální svorkou
• Nálevka a filtrační papír
• Zkumavka (50 ml)

Produkty

• Banán (kousky)
• Destilovaná voda (30 ml)
• NaCl, krystaly (2,5 ml, 5,4 g)
• Tekutý prostředek na nádobí (10 kapek)
• Metanol, kapalný, studený (10 ml) – toxický, viz bezpečnostní poznámka v protokolu