DNA 추출은 분자생물학에서 거의 모든 실험의 첫 단계입니다. 유전체 염기서열 분석, 작물 품종의 병 저항성 유전자 검사, 범죄 현장 감정물 대조, 임상 진단 확정 등은 모두 세포 밖으로 DNA를 꺼내어 튜브에 담는 것에서 시작합니다. 화학적 원리는 모든 규모에서 동일합니다. 세포는 인지질로 이루어진 세포막 뒤에 내용물을 보호하고 있으며, 그 안의 DNA는 매우 긴 폴리음이온으로 중성 pH에서 골격을 이루는 모든 인산基가 하나의 음전하를 띱니다. 세제는 세포막을 녹여 세포 내 물질을 방출시키고, 용해된 염은 나트륨 이온을 공급하여 이러한 음전하를 상쇄함으로써 이웃한 가닥들이 서로 밀어내지 않게 합니다. 그런 다음 DNA가 물에서보다 용해도가 훨씬 낮은 차가운 알코올을 이용하여, 전하가 상쇄된 분자들을 육안으로 볼 수 있을 만큼 커다란 덩어리로 용액 밖으로 침전시킵니다. 바나나는 실험 재료로 쓰기에 매우 편리한데, 과육이 유봉으로 으깨어 페이스트를 만들기 에는 충분히 부드럽고 섬유질이 적으며, 재배종 바나나는 3배체이므로 모든 세포가 세 개의 염색체 세트를 지니고 있기 때문입니다. 이번 실험에서는 증류수, 염화나트륨, 주방 세제로 추출 용액을 만들고, 바나나 조각을 균질한 페이스트 상태로 으깬 뒤, 이 페이스트를 추출 용액과 섞고, 그 혼합물을 거름종이를 통해 시험관에 거른 후, 여과액 위에 차가운 메탄올을 층층이 얹을 것입니다. 잠시 후 두 액체가 만나는 곳에 회색의 실 모양 침전물이 나타납니다. 이는 세포에서 방출된 다른 일부 물질과 함께 엉긴 DNA입니다.
교육 목표
실험실 환경 익숙해지기
- 시작하기 전에 저울, 눈금 실린더, 비커, 막자와 막자사발, 스탠드와 클램프, 깔때기, 시약병을 확인하고 각각의 용도를 설명하세요.
- 여과 장치를 설치하고, 액체를 붓기 전에 안정적인지 판단하십시오.
유독성 시약 다루기
- 메탄올을 흡입, 삼킴 및 피부 접촉 시 유독한 물질로 인식하고, 화기를 멀리하고 환기가 잘 되는 곳에서 장갑과 보안경을 착용하고 작업하십시오.
- 에탄올 95 %나 이소프로판올이 DNA를 똑같이 잘 침전시키면서도 실제 실험실 환경에서 더 안전한 선택인 이유를 설명하십시오.
수용액의 조제
- 70 mL 눈금 실린더에 증류수 30 mL를 측정하여 담고, 눈높이에서 메니스커스의 아랫부분을 읽으십시오.
- 영점 저울 위에 놓인 칭량 보트에서 염화나트륨의 무게를 재고, 손실 없이 옮긴 후, 결정이 남지 않을 때까지 유리 막대로 저어줍니다.
- 세제 몇 방울을 넣고 균일한 용액이 되도록 섞습니다.
식물 조직의 기계적 파괴
- 절구로 바나나 조각을 으깨어 페이스트가 균일해지도록 만들고, 왜 세포막을 파괴하는 화학적 용해에 앞서 갈아내는 과정이 선행되어야 하는지 설명하시오.
중력 여과법
- 시험관을 약 30 cm 높이에 고정하고, 거름종이가 든 깔때기를 장치한 후, 여과액을 대략 15 mL 모으세요.
- 논문이 남기는 것(세포벽 조각, 녹말 알갱이, 섬유질)과 논문을 통과하는 것을 명시하시오.
에탄올 침전
- 차가운 메탄올 10 mL를 측정하여 여과액과 섞이지 않고 그 위에 층을 이루도록 시험관 벽을 따라 천천히 부으십시오.
- 두 액체가 서로 닿을 정도로만 부드럽게 잘 섞고, 왜 강하게 흔들면 침전물이 부서지는지 설명하시오.
결과 관찰 및 해석
- 침전물의 색상, 위치, 질감을 기술하고, 실험의 각 단계를 그것을 유발한 시약과 연관시키십시오.
- 조추출물과 정제된 DNA를 구별하고, 방금 수집한 물질 내에 함께 존재하는 다른 성분들의 이름을 말하시오.
프로토콜
안전 — 메탄올. 이 실험에서는 메탄올을 사용하여 DNA를 침전시킵니다. 메탄올은 흡입, 섭취 및 피부 접촉 시 유독하며, 에탄올과 달리 체내에서 포름산으로 전환되어 시신경에 영구적인 손상을 줄 수 있습니다. 30mL보다 훨씬 적은 양을 섭취한 경우에도 실명을 유발한 사례가 있습니다. 장갑과 눈 보호구를 착용하고, 병은 마개를 단 상태로 유지하며 화염으로부터 멀리 떨어진 곳에 두십시오. 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고, 절대로 입으로 피펫을 사용하지 마십시오. 작업 후에는 반드시 손을 씻으십시오. 95% 에탄올(%)이나 이소프로판올도 DNA를 똑같이 잘 침전시키며, 실제 실험대에서 이 실험을 반복할 경우 더 안전한 선택입니다.
파트 A: 추출 용액 준비
- 70mL 눈금 실린더를 사용하여 증류수 30mL를 측정하십시오.
- 증류수를 50mL 비커로 옮기세요.
- 빈 칭량을 보려 저울에 올려 놓으시오.
- 2.5 mL (5.4 g)의 염화나트륨을 전자저울 위의 칭량 접시에 넣으시오.
- 증류수가 담긴 비커에 염화나트륨을 따르십시오.
- 유리가 완전히 녹을 때까지 유리 막대로 혼합물을 저어줍니다.
- 비커에 주방 세제 10 방울을 넣으세요.
- 유리 막대로 용액을 다시 저어 균일한 혼합물을 보장합니다.
파트 B: DNA 추출 절차
- 바나나 조각을 절구에 넣으세요.
- 바나나를 으깨봉으로 굵고 균질한 페이스트가 될 때까지 조심스럽게 으깨십시오.
- A부 1단계부터 10단계까지 준비된 추출 용액을 절구 속 바나나 페이스트에 천천히 첨가하십시오.
- 유리 막대를 사용하여 절구 안의 내용물을 고르게 섞어줍니다.
- 만능 클램프를 스탠드에 약 30cm 높이로 부착합니다.
- 시험관을 만능 클램프에 부착하십시오.
- 시험관 위에 깔때기를 놓으세요.
- 깔때기에 여과지를 넣으십시오.
- 바나나 혼합물을 시험관에 여과하여 약 3분의 1(약 15mL)을 채우십시오.
- 10 mL 눈금 실린더를 사용하여 차가운 메탄올 10 mL를 측정하십시오. 메탄올은 유독성 물질입니다: 장갑과 보안경을 착용하고, 화기에서 멀리하며, 환기가 잘 되는 곳에서 작업하고, 절대 입으로 피펫을 사용하지 마십시오.
- 시험관에서 깔때기와 필터를 제거하십시오.
- 메탄올을 시험관 벽을 따라 천천히 부으세요. 메탄올의 부피는 여과액의 약 두 배가 되어야 하므로, 10 mL의 메탄올을 넣기 전에 여과액을 약 5 mL로 줄이세요.
- 시험관을 유리 막대로 부드럽게 저어 용액을 섞으시오. 용액이 흐트러지지 않도록 시험관을 흔들지 마시오.
DNA는 젤라틴처럼 끈적끈적한 흰색 침전물로 나타날것입니다.
예상 결과
이 프로토콜의 모든 시약에는 각각 하나의 역할이 있으며, 각 시약은 눈으로 확인할 수 있는 변화를 만들어냅니다. 아래 표는 교사가 채점할 때 기준으로 삼을 수 있는 참고 자료이며, 각 시약과 그것이 시료에 미치는 영향을 짝지어 보여줍니다.
| 시약 또는 조작 | 어떤 역할인지 | 추출에 그것이 필요한 이유 |
|---|---|---|
| 절구와 절구공이 | 셀룰로오스 세포벽을 기계적으로 찢어냅니다 | 식물 세포벽은 세제에 의해 녹지 않으며, 시약이 세포막에 도달하기 전에 물리적인 힘으로 부수어야 합니다. |
| 증류수, 30 mL | 다른 시약들을 운반하고 방출된 세포 내용물을 받습니다 | 이미 측정된 소금에 알 수 없는 농도의 용존 이온이 추가되지 않도록 수돗물 대신 증류수를 사용합니다. |
| 염화나트륨, 5.4 g | Na로 해리됨+ 그리고 Cl−; 나+ 이온들이 골격의 인산기 주위에 모인다 | 음전하를 차폐하면 DNA 분자들이 서로 반발하는 대신 서로 접근할 수 있게 되며, 이것이 응집을 가능하게 만드는 요인이다. |
| 주방세제 10방울 | 그것의 양친매성 분자들이 지질 이중층에 삽입되어 미셀로 분해한다 | 세포막과 핵막을 용해시켜 DNA를 액체 속으로 방출하며, 가닥에서 단백질을 제거하는 역할도 합니다. |
| 필터 페이퍼 | 세포벽 파편, 전분 과립 및 섬유질을 유지함 | 침전물이 생기는 것을 실제로 볼 수 있을 만큼 충분히 맑은 여과액을 남깁니다. |
| 차가운 메탄올, 10 mL | 액체의 유전율을 낮추고 DNA를 수화시키는 물을 두고 경쟁합니다. | DNA는 물에는 잘 녹지만 고농도의 알코올에는 녹지 않아 용액 밖으로 나와 눈에 보이게 되며, 찬 온도는 DNA를 분해할 수 있는 효소의 작용을 늦춰줍니다. |
두 번째 표는 각 단계에서 예상되는 외관을 보여주며, 이는 관찰 기록장에 기록되어야 하는 내용입니다.
| 단계 | 예상 관측치 |
|---|---|
| 추출 용액, 파트 A의 끝 | 세제로 인해 표면에 거품이 조금 인 맑고 무색인 액체이며, 비커 바닥에 남은 결정은 없음 |
| 으깬 바나나 | 덩어리가 전혀 없고 굵고 연한 노란색의 균일한 페이스트 |
| 추출 용액을 섞은 후의 몰타르 | 반죽보다 눈에 띄게 더 유동성이 있는, 묽고 탁한 슬러리 |
| 시험관 속의 여과액 | 탁하고 옅은 노란색, 약 15 mL로 50 mL 튜브의 대략 3분의 1 정도이며, 여과가 느리고 거름종이가 막힘 |
| 메탄올을 얹은 직후에 | 뚜렷한 경계를 가진 두 개의 층, 더 밀도가 높은 여과액 위에 메탄올이 위치함 |
| 부드럽게 섞은 후 | 층 사이의 경계에 모여 알코올 속으로 떠오르는 회색의 실 모양 젤라틴 덩어리 |
계산해 볼 가치가 있는 두 가지 양. 소금물의 농도는 다음에서 비롯됩니다 c = m / (M × V). 함께 M(NaCl) = 58.44 g/mol, c = 5.4 g / (58.44 g/mol × 0.0300 L) = 3.1 mol/L. 염화나트륨은 20 °C에서 약 359 g/L, 즉 6.1 mol/L에서 포화되므로, 이 추출 용액은 대략 반 정도 포화 상태이며, 대부분의 교실용 추출 완충액에서 사용하는 0.15~0.5 mol/L보다 몇 배 더 농도가 높습니다. 침전 반응은 여전히 일어나는데, 이는 선별 효과가 이미 3 mol/L보다 훨씬 낮은 농도에서 포화 상태에 이르기 때문이다. 그러나 이 값을 계산한 학생에게는 이를 표준적인 것으로 가정하게 두기보다는 이 농도가 이례적으로 높다는 점을 알려주어야 한다. 두 번째 수치는 알코올 분율입니다. 시험관에는 15 mL의 여액이 들어 있고 10 mL의 메탄올이 추가되므로, 알코올은 부피 기준으로 10 / (15 + 10) = 40 %를 차지합니다. DNA는 대략 35~40 %의 알코올 농도에서 용액 밖으로 나오기 시작하여 65~70 % 근처에서 완전히 침전됩니다. 이것이 바로 이 실험 절차에서 국소 알코올 분율이 40 %보다 훨씬 높은 계면 부위에서 침전물이 생성되는 이유이며, 또한 시험관을 뒤집지 않고 가볍게만 혼합하는 이유이기도 합니다.
소금과 알코올이 함께 작용해야 하는 이유. 추출 용액의 pH에서 골격의 모든 포스포디에스테르기는 이온화되므로, DNA 분자는 서로 반발하고 이웃한 분자들과도 반발하는 음전하들의 사슬이 된다. 나트륨 이온들은 그 전하들 주머니로 몰려들어 그것들을 차폐한다. 그것들이 얼마나 강하게 붙잡혀 있는지는 쿨롱의 법칙을 통해 매질에 따라 달라진다. F = q1q2 / (4πε0엡실론rr2): 상대 유전율 εr 25 °C에서 물은 약 78, 메탄올은 약 33이므로, 물의 일부를 메탄올로 대체하면 동일한 거리에서 나트륨 이온과 인산기 사이의 인력이 약 78 / 33 ≈ 2.4배 강화됩니다. 전하가 더 효과적으로 중화되어 가닥들이 서로 반발하는 것을 멈추고 응집됩니다. 알코올은 또한 물보다 DNA 골격에 수소 결합을 훨씬 덜 쉽게 형성하므로, DNA를 용액 상태로 유지하는 정돈된 물 분자 외피가 벗겨집니다. 두 시약 중 어느 하나만으로는 충분하지 않습니다. 염이 없으면 차폐된 응집체가 절대 형성되지 않고, 알코올이 없으면 DNA는 용액 상태로 남습니다.
질량은 눈에 보이는데 분자는 보이지 않는 이유. DNA 이중 나선은 너비가 약 2nm로, 가시광선 현미경의 해상도 한계인 200nm의 대략 100분의 1 수준이며, 약 104 ~105 인간 머리카락보다 몇 배 더 얇습니다. 시험관에서 보이는 것은 단일 분자가 아니며, 이중 나선 자체도 여기서 관찰할 수 없습니다. 그것의 구조는 침전물을 보는 것이 아니라 X선 회절에 의해 밝혀졌습니다. 보이는 것은 엄청난 수의 분자들의 집합체입니다. 자릿수는 확인할 수 있습니다: 재배되는 바나나는 3배체입니다. 무사 아쿠미나타 3과 함께n = 33개의 염색체를 가지며, 반수체 게놈은 약 5억 2,300만 염기쌍이므로, 하나의 핵에는 대략 1.6 × 109 염기쌍. 염기쌍당 평균 650 g/mol일 때, 하나의 핵 안에 있는 DNA의 무게는 1.6 × 10이다9 × 650 / (6.02 × 1023) ≈ 1.7 × 10-12 g, 그것은 약 1.7 피코그램이다. 따라서 1밀리그램의 눈에 보이는 덩어리는 수억 개의 세포의 핵 DNA 양을 나타내며, 그것이 바로 이를 얻기 위해 조직 한 조각 전체를 갈아야 하는 이유이다.
침전물이 실제로 무엇인지. 본 프로토콜에는 단백질 분해 효소와 리보핵산 분해 효소가 사용되지 않으며, 침전 후 세척 단계도 따르지 않기 때문에 수집된 물질은 DNA라기보다는 조핵산 제제에 가깝습니다. 즉, 핵 DNA가 엽록체 및 미토콘드리아 DNA, 다량의 RNA, 잔류 단백질, 바나나에서 유래한 다당류, 그리고 포획된 세제와 함께 섞여 있는 것입니다. 이러한 혼합물 때문에 덩어리가 정제된 시료의 깨끗한 흰색 실 형태를 형성하지 못하고 회색빛을 띠며 덩어리지고 젤라틴 같은 양상을 보이는 것이며, 무엇이 추출되었는가에 대한 진정한 답변이 됩니다.
학년별 과제 요약
9~10학년
- 집중 그 DNA가 모든 살아있는 세포에 존재하며 일반적인 시약으로 눈에 보이게 만들 수 있고, 각 시약에는 식별 가능한 하나의 역할이 있다는 것.
- 활동 프로토콜을 실행하고 사용할 때마다 각 기기의 이름을 대고; 표 2와 같은 표에 용액, 페이스트, 여과액, 침전물의 외관을 기록하고; 비누, 소금, 알코올이 하는 일을 각각 한 문장으로 진술하고; 메탄올에 적용되는 주의사항을 나열하고 그것이 적용되는 이유를 설명하고; 이중 나선을 보았다고 주장하지 않고 침전물을 설명하시오.
11학년
- 집중 용액의 정량적 제조와 침전의 물리화학.
- 활동 염의 질량과 물의 부피(3.1 mol/L)를 바탕으로 추출 용액의 농도를 계산하고, 이를 20 °C에서의 포화 농도와 비교하라; 최종 알코올 분율(부피 기준 40 %)을 계산하고, 이를 DNA가 용액에서 분리되는 임계값과 연관 지어 설명하시오; 음전하를 띤 인산기 및 나트륨 이온의 관점에서 전하 차폐 현상을 설명하시오; 염의 양을 절반으로 줄이거나 메탄올을 같은 부피의 물로 대체할 경우 어떤 현상이 일어날지 예측하고, 그 예측의 근거를 제시하십시오; 알코올을 차갑게 유지해야 하는 이유와 시험관을 부드럽게 혼합해야 하는 이유를 설명하십시오.
12학년 / 대학교 수준
- 집중 조농축 용해물과 분석적으로 유용한 시료 사이의 거리, 그리고 각 시약의 역할을 규명할 대조군의 설계.
- 활동 쿨롬 법칙과 물 및 메탄올의 비유전율을 사용하여 알코올이 응집을 촉진하는 이유를 정량적으로 논증하고, 3배체 유전체 크기와 염기쌍당 650 g/mol을 바탕으로 바나나 한 개 세포 핵 속의 DNA 질량을 추정하며, 이를 이용하여 육안으로 보이는 덩어리가 몇 개의 세포를 나타내는지 추정하고, 이 실험 프로토콜을 CTAB 절차나 실리카 컬럼과 같은 표준적인 식물 추출법과 비교하여 리보뉴클레아제, 프로테아제, 알코올 세척, 완충액 내 재현탁 등 여기서 누락된 단계를 식별하고, A260/A280 측정이 이 추출물에 대해 무엇을 밝혀낼지 확인하고; 분쇄, 세제, 소금, 알코올의 기여도를 각각 분리해내는 대조군 실험을 설계하며, 각 대조군이 어떤 결과를 보여야 하는지 기술하시오.
실험실 필수품
악기
- 용기 뺄셈(영점) 기능이 있는 저울과 칭량 보트
- 계량스푼 / 주걱 (2.5 mL)
- 핀셋
- 비커 (50 mL)
- 눈금실린더 (70 mL)
- 눈금실린더 (10 mL)
- 유리봉
- 스포이트 (1 mL)
- 절구와 절구공이
- 범용 클램프가 있는 메탈 스탠드
- 깔때기와 거름종이
- 시험관 (50 mL)
제품
- 바나나 (조각)
- 증류수 (30 mL)
- NaCl, 결정 (2.5 mL, 5.4 g)
- 주방 세제, 액체 (10방울)
- 메탄올, 액체, 찬 것 (10 mL) — 독성 있음, 프로토콜의 안전 참고 사항 참조