026 – ADN végétal

L'extraction de l'ADN est la première étape de presque toutes les procédures en biologie moléculaire : le séquençage d'un génome, le test d'une variété de culture pour un gène de résistance aux maladies, la comparaison d'un échantillon médicolégal ou la confirmation d'un diagnostic clinique commencent tous par extraire l'ADN des cellules pour le placer dans un tube. La chimie est la même à toutes les échelles. Une cellule retient son contenu derrière des membranes constituées de phospholipides, et l'ADN qu'elle contient est un très long polyanion — chaque groupe phosphate le long de son squelette porte une charge négative à pH neutre. Un détergent dissout les membranes et libère le contenu de la cellule ; du sel dissous fournit des sodium ions qui masquent ces charges négatives, de sorte que les brins voisins cessent de se repousser mutuellement ; et un alcool froid, dans lequel l'ADN est beaucoup moins soluble que dans l'eau, fait ensuite sortir les molécules masquées de la solution sous la forme d'une masse suffisamment grande pour être visible à l'œil nu. La banane est un matériau de départ pratique : la chair est suffisamment tendre pour être réduite en pâte avec un pilon, elle contient peu de fibres, et la banane cultivée est triploïde, de sorte que chaque cellule transporte trois jeux de chromosomes. Dans ce laboratoire, vous préparerez une solution d'extraction à partir d'eau distillée, de chlorure de sodium et de liquide vaisselle, vous écraserez un morceau de banane pour obtenir une pâte homogène, vous mélangerez la pâte avec cette solution, vous filtrerez le mélange à travers du papier dans un tube à essai, et vous déposerez de l'alcool méthylique froid en couche au-dessus du filtrat. En quelques instants, un précipité gris et filamenteux apparaît là où les deux liquides se rencontrent — de l'ADN, ainsi qu'une partie du reste du matériel libéré par les cellules.

Objectifs Éducatifs

Familiarisation avec l'environnement du laboratoire

• Identifiez la balance, les éprouvettes graduées, le bécher, le mortier et le pilon, le support et la pince, l'entonnoir et les flacons de réactifs, et indiquez l'utilité de chacun avant de commencer.
• Montez un dispositif de filtration et vérifiez s'il est stable avant d'y verser quoi que ce soit.

Manipulation d'un réactif toxique

• Reconnaître que le méthanol est toxique par inhalation, ingestion et contact cutané, et travailler avec des gants et des lunettes de protection, loin de toute flamme, dans un endroit ventilé.
• Expliquez pourquoi l'éthanol 95 % ou l'isopropanol permettraient de précipiter l'ADN tout aussi efficacement et constituent le choix le plus sûr en laboratoire.

Préparation d'une solution aqueuse

• Mesurez 30 mL d'eau distillée dans une éprouvette graduée de 70 mL, en lisant le bas du ménisque au niveau des yeux.
• Pesez le chlorure de sodium dans une barquette de pesée sur une balance tarée, transférez-le sans perte et agitez avec un saphir ou un agitateur en verre jusqu'à ce qu'il ne reste plus de cristaux.
• Ajouter un nombre compté de gouttes de détergent et mélanger jusqu'à l'obtention d'une solution homogène.

Perturbation mécanique des tissus végétaux

• Écrasez un morceau de banane avec un pilon jusqu'à ce que la consistance de la pâte soit uniforme, et expliquez pourquoi le broyage doit précéder la lyse chimique.

Filtration par gravité

• Fixez un tube à essai à environ 30 cm, installez unentonnoir muni d'un papier filtre et récupérez environ 15 mL de filtrat.
• Indiquez ce que le papier retient — des fragments de paroi cellulaire, des grains d'amidon et des fibres — et ce qui le traverse.

Précipitation par l'alcool

• Mesurez 10 mL de méthanol froid et versez-le lentement le long de la paroi du tube à essai de manière à ce qu'il forme une couche sur le filtrat au lieu de se mélanger avec celui-ci.
• Mélangez délicatement et juste assez pour mettre les deux liquides en contact, et expliquez pourquoi une agitation vigoureuse cisellerait le précipité.

Observation et interprétation du résultat

• Décrivez le précipité en termes de couleur, de position et de texture, et attribuez chaque étape de l'expérience au réactif qui en est responsable.
• Distinguer un extrait brut d'ADN purifié, et nommer ce qui est également présent dans la masse qui vient d'être collectée.

Protocole

Sécurité — méthanol. Ce laboratoire utilise du méthanol pour précipiter l'ADN. Le méthanol est toxique par inhalation, ingestion et contact cutané, et contrairement à l'éthanol, l'organisme le transforme en acide formique, qui peut endommager de manière irréversible le nerf optique. Des doses bien inférieures à 30 ml ont déjà provoqué la cécité. Portez des gants et des lunettes de protection, gardez le flacon bouché et à l'écart de toute flamme, travaillez dans un local aéré, ne pipetez jamais avec la bouche et lavez-vous les mains après l'opération. L'éthanol à 95 % % ou l'isopropanol précipitent tout aussi bien l'ADN et constituent un choix plus sûr si vous refaites cette expérience sur une véritable paillasse.

Partie A : Préparation de la solution d'extraction

1. Mesurer 30 mL d'eau distillée à l'aide d'une éprouvette graduée de 70 mL.
2. Transférez l'eau distillée dans un bécher de 50 mL.
3. Pesez la nacelle vide sur la balance.
4. Ajouter 2,5 mL (5,4 g) de chlorure de sodium dans le plateau de pesée sur la balance.
5. Versez le chlorure de sodium dans le bécher contenant l'eau distillée.
6. Remuez le mélange avec une tige de verre jusqu'à ce que le sel soit complètement dissous.
7. Ajoutez 10 gouttes de liquide vaisselle dans le bécher.
8. Remuez à nouveau la solution avec la tige de verre pour assurer un mélange homogène.

Partie B : Procédure d'extraction de l'ADN

1. Placez un morceau de banane dans un mortier.
2. Écrasez soigneusement la banane avec un pilon jusqu'à obtenir une pâte épaisse et homogène.
3. Ajouter lentement la solution d'extraction préparée lors des étapes 1 à 10 de la partie A, à la pâte de banane dans le mortier.
4. À l'aide de la tige de verre, mélangez bien le contenu du mortier pour une répartition uniforme.
5. Fixez une pince universelle sur le support à une hauteur d'environ 30 cm.
6. Fixez un tube à essai à la pince universelle.
7. Placez l'entonnoir sur le tube à essai.
8. Placez un papier filtre dans l'entonnoir.
9. Filtrez le mélange de banane dans le tube à essai, en le remplissant environ d'un tiers (environ 15 ml).
10. Mesurez 10 mL de méthanol froid à l'aide d'une éprouvette graduée de 10 mL. Le méthanol est toxique : Portez des gants et des lunettes de protection, tenez-le éloigné de toute flamme, travaillez dans un endroit ventilé et ne pipetez jamais à la bouche.
11. Retirer l'entonnoir et le filtre de l'éprouvette.
12. Versez lentement le méthanol le long de la paroi du tube à essai. Le volume de méthanol doit être d'environ deux fois celui du filtrat, réduisez donc le filtrat à environ 5 mL avant d'ajouter les 10 mL de méthanol.
13. Mélangez doucement le contenu du tube à essai avec une tige de verre. Évitez de secouer le tube à essai afin de ne pas perturber la solution.

L'ADN apparaîtra sous forme de précipité gris, ressemblant à une substance filandreuse ou gélatineuse.

Résultats attendus

Chaque réactif de ce protocole a un rôle précis, et chacun produit un changement visible. Le tableau ci-dessous sert de référence pour la correction par l'enseignant : il associe chaque réactif à l'effet qu'il produit sur l'échantillon.

Le deuxième tableau donne l'aspect attendu à chaque étape, ce qui correspond à ce que le carnet d'observations doit consigner.

Les deux quantités qui valent la peine d'être calculées. La concentration de la solution saline découle de c = m / (M × V). Avec M(NaCl) = 58,44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. Le chlorure de sodium atteint sa saturation à environ 359 g/L à 20 °C, soit 6,1 mol/L ; la solution d’extraction est donc à peu près à moitié saturée et plusieurs fois plus concentrée que les tampons d’extraction utilisés en cours, dont la concentration est généralement comprise entre 0,15 et 0,5 mol/L. La précipitation fonctionne tout de même, car l’effet de masquage est déjà saturé bien en dessous de 3 mol/L, mais un élève qui calcule cette valeur devrait être informé qu’elle est inhabituellement élevée, plutôt que de laisser supposer qu’il s’agit d’une valeur standard. La deuxième quantité est la fraction d’alcool : le tube contient 15 mL de filtrat et reçoit 10 mL de méthanol ; l’alcool représente donc 10 / (15 + 10) = 40 % en volume. L’ADN commence à se précipiter à une concentration d’alcool comprise entre environ 35 et 40 % et précipite complètement vers 65 à 70 % ; c’est pourquoi ce protocole produit son précipité à l’interface, où la fraction d’alcool locale est bien supérieure à 40 %, et c’est pourquoi le tube est agité très doucement plutôt que d’être renversé.

Pourquoi le sel et l'alcool doivent agir ensemble. Au pH de la solution d'extraction, chaque groupe phosphodiester du squelette est ionisé, de sorte qu'une molécule d'ADN est une chaîne de charges négatives qui se repoussent mutuellement et repoussent les molécules voisines. Les ions sodium s'accumulent autour de ces charges et les masquent. La force avec laquelle ils sont retenus dépend du milieu, par la loi de Coulomb F = q₁q₂ / (4πε₀ε_rr²): la permittivité relative ε_r est d'environ 78 pour l'eau à 25 °C et d'environ 33 pour le méthanol, de sorte que le remplacement d'une partie de l'eau par du méthanol renforce l'attraction entre un ion sodium et un groupe phosphate d'un facteur d'environ 78 / 33 ≈ 2,4 à séparation égale. La charge est neutralisée plus efficacement, les brins cessent de se repousser et ils s'agrègent. L'alcool forme également des liaisons hydrogène avec le squelette beaucoup moins facilement que l'eau, de sorte que la couche ordonnée de molécules d'eau qui maintient l'ADN en solution est éliminée. Aucun des deux réactifs seul n'suffit : sans sel, l'agrégat blindé ne se forme jamais, et sans alcool, l'ADN reste en solution.

Pourquoi une masse est visible alors qu'une molécule ne l'est pas. Une double hélice d'ADN mesure environ 2 nm de large, soit environ un centième de la limite de résolution de 200 nm d'un microscope à lumière visible et quelque 10⁴ jusqu'à 10⁵ fois plus fin qu'un cheveu humain. Rien de ce que l'on voit dans le tube à essai n'est une seule molécule, et la double hélice elle-même ne peut y être observée — sa structure a été établie par diffraction des rayons X, et non en observant un précipité. Ce que l'on voit est un agrégat d'un nombre immense de molécules. L'ordre de grandeur peut être vérifié : la banane cultivée est triploïde Musa acuminata avec 3n = 33 chromosomes, et le génome haploïde compte environ 523 millions de paires de bases, de sorte qu'un noyau contient environ 1,6 × 10⁹ paires de bases. À une moyenne de 650 g/mol par paire de bases, l'ADN d'un seul noyau pèse 1,6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1,7 × 10⁻¹² g, c'est environ 1,7 picogramme. Un amas visible d'un milligramme représente donc le contenu nucléaire de centaines de millions de cellules, c'est pourquoi un morceau entier de tissu doit être broyé pour l'obtenir.

Ce qu'est réellement le précipité. Aucune protéase ni ribonucléase n'est utilisée dans ce protocole, et aucune étape de lavage ne suit la prénutrition, de sorte que le matériel recueilli est une préparation d'acides nucléiques bruts plutôt que de l'ADN : de l'ADN nucléaire ainsi que de l'ADN chloroplastique et mitochondrial, une grande quantité d'ARN, des protéines résiduelles, des polysaccharides de la banane et du détergent piégé. C'est ce mélange qui fait que la masse a l'aspect gris, grumeleux et gélatineux au lieu de former le fil blanc et propre d'une préparation purifiée, et c'est la réponse honnête à la question de savoir ce qui a été extrait.

Résumé du devoir par tranche d'âge

Classe de 3e à la 2de

• Focalisation que l'ADN est présent dans chaque cellule vivante et peut être rendu visible avec des réactifs ordinaires, et que chaque réactif a une fonction identifiable.
• Activités : exécutez le protocole et nommez chaque instrument au fur et à mesure de son utilisation ; consignez l'aspect de la solution, de la pâte, du filtrat et du précipité dans un tableau tel que le Tableau 2 ; décrivez en une phrase chacun le rôle du savon, du sel et de l'alcool ; énumérez les précautions qui s'appliquent au méthanol et expliquez pourquoi elles s'appliquent ; décrivez le précipité sans prétendre avoir vu une double hélice.

11e année

• Focalisation préparation quantitative d'une solution et physico-chimie de la précipitation.
• Activités : calculer la concentration de la solution d'extraction à partir de la masse de sel et du volume d'eau (3,1 mol/L) et la comparer à la concentration de saturation à 20 °C ; calculer la fraction finale d’alcool (40 % en volume) et la mettre en relation avec le seuil à partir duquel l’ADN se sépare de la solution ; expliquer le masquage de charge en fonction des groupes phosphate négatifs et des ions sodium ; prévoir ce qui se passerait si la quantité de sel était réduite de moitié ou si le méthanol était remplacé par un volume équivalent d’eau, et justifier cette prévision ; expliquer pourquoi l’alcool doit être froid et pourquoi le tube est agité délicatement.

12e année / Niveau universitaire

• Focalisation la distance entre un lysat brut et un échantillon utile sur le plan analytique, ainsi que la conception des contrôles qui établiraient le rôle de chaque réactif.
• Activités : Utilisez la loi de Coulomb et les permittivités relatives de l'eau et du méthanol pour démontrer quantitativement pourquoi l'alcool favorise l'agrégation ; estimez la masse d'ADN dans un noyau de banane à partir de la taille du génome triploïde et de 650 g/mol par paire de bases, et utilisez-la pour estimer combien de cellules représente un amas visible ; comparez ce protocole avec une extraction végétale standard telle qu'une procédure CTAB ou une colonne de silice, et identifiez les étapes manquantes ici — ribonucléase, protéase, lavage à l'alcool, remises en suspension dans un tampon ; expliquez ce qu'est un A₂₆₀/A₂₈₀ la mesure révélerait à propos de cet extrait ; concevez la série de témoins qui isole la contribution du broyage, du détergent, du sel et de l'alcool, et indiquez quel résultat chaque témoin devrait donner.

Essentiels de laboratoire

Instruments

• Balance avec fonction tare et barquette de pesée
• Cuillères à mesurer / spatules (2,5 mL)
• Pince à épiler
• Bécher (50 mL)
• Éprouvette graduée (70 mL)
• Éprouvette graduée (10 mL)
• Baguette de verre
• Compte-gouttes (1 mL)
• Mortier et pilon
• Support en métal avec pince universelle
• Entonnoir et papier filtre
• Tube à essai (50 mL)

Produits

• Banane (morceaux)
• Eau distillée (30 mL)
• NaCl, cristaux (2,5 mL, 5,4 g)
• Liquide vaisselle (10 gouttes)
• Méthanol, liquide, froid (10 mL) — toxique, voir la note de sécurité dans le protocole