026 – Pflanzliche DNA

Die Extraktion von DNA ist der erste Schritt fast jeder molekularbiologischen Methode: Die Sequenzierung eines Genoms, die Untersuchung einer Pflanzensorte auf ein Gen für Krankheitsresistenz, der Abgleich einer forensischen Probe oder die Bestätigung einer klinischen Diagnose beginnen alle damit, dass DNA aus Zellen heraus und in ein Reagenzglas überführt wird. Die Chemie ist bei jedem Maßstab dieselbe. Eine Zelle hält ihren Inhalt hinter Membranen zurück, die aus Phospholipiden aufgebaut sind, und die darin enthaltene DNA ist ein sehr langer Polyanion – jede Phosphatgruppe entlang ihres Rückgrats trägt bei neutralem pH-Wert eine negative Ladung. Ein Reinigungsmittel löst die Membranen auf und gibt den Zellinhalt frei; gelöstes Salz liefert Natriumionen, die diese negativen Ladungen abschirmen, sodass sich benachbarte Stränge nicht länger gegenseitig abstoßen; und ein kalter Alkohol, in dem DNA weitaus weniger löslich ist als in Wasser, zwingt die abgeschirmten Moleküle dann dazu, als eine Masse aus der Lösung auszufällen, die groß genug ist, um mit bloßem Auge gesehen zu werden. Banane ist ein praktisches Ausgangsmaterial: Das Fruchtfleisch ist weich genug, um mit einem Stößel zu einer Paste zermahlen zu werden, sie enthält wenig Fasern, und die Kulturbanane ist triploid, sodass jede Zelle drei Chromosomensätze trägt. In diesem Labor bereiten Sie eine Extraktionslösung aus destilliertem Wasser, Natriumchlorid und Spülmittel zu, zerdrücken ein Stück Banane zu einer homogenen Paste, mischen die Paste mit dieser Lösung, filtrieren das Gemisch durch Papier in ein Reagenzglas und schichten kaltes Methanol auf das Filtrat. Nach wenigen moments erscheint ein graues, fadenförmiges Präparat dort, wo die beiden Flüssigkeiten aufeinandertreffen – DNA, zusammen mit einigen anderen Materialien, die aus den Zellen freigesetzt wurden.

Bildungsziele

Einarbeitung in die Laborumgebung

• Identifizieren Sie die Waage, die Messzylinder, das Becherglas, den Mörser mit Pistill, das Stativ mit Klammer, den Trichter und die Reagenzflaschen und geben Sie vor Beginn an, wofür die einzelnen Geräte verwendet werden.
• Baue eine Filtrationsapparatur auf und prüfe, ob sie stabil ist, bevor du etwas hineingießt.

Handhabung eines toxischen Reagenzes

• Methanol als giftig bei Einatmung, Verschlucken und Hautkontakt anerkennen und mit Handschuhen und Augenschutz, fern von jeglichen Flammen in einem gut belüfteten Bereich arbeiten.
• Erläutern Sie, warum Ethanol 95 % oder Isopropanol die DNA ebenso gut ausfällen würden und im Labor die sicherere Wahl darstellen.

Herstellung einer wässrigen Lösung

• Messen Sie 30 ml destilliertes Wasser in einem 70-ml-Messzylinder ab, indem Sie die Unterseite des Meniskus auf Augenhöhe ablesen.
• Wiegen Sie Natriumchlorid in einem Wägeschiffchen auf einer tarierten Waage ein, überführen Sie es quantitative und rühren Sie mit einem Glasstab um, bis keine Kristalle mehr vorhanden sind.
• Fügen Sie eine gezählte Anzahl von Tropfen Reinigungsmittel hinzu und mischen Sie zu einer homogenen Lösung.

Mechanische Zerstörung von Pflanzengewebe

• Zerdrücken Sie ein Stück Banane mit einem Mörser, bis eine gleichmäßige Paste entsteht, und erklären Sie, warum das Zermahlen der chemischen Lyse vorausgehen muss.

Schwerkraftfiltration

• Spannen Sie ein Reagenzglas bei etwa 30 cm ein, setzen Sie einen Trichter mit einem Filterpapier ein und sammeln Sie etwa 15 ml Filtrat auf.
• Geben Sie an, was das Papier zurückhält – Zellwandfragmente, Stärkekörner und Fasern – und was hindurchgeht.

Alkoholpräzipitation

• Messen Sie 10 mL kaltes Methanol ab und gießen Sie es langsam an der Wand des Reagenzglases herunter, so dass es sich auf dem Filtrat absetzt, anstatt sich mit ihm zu vermischen.
• Mischen Sie vorsichtig und nur so viel, dass die beiden Flüssigkeiten in Kontakt kommen, und erklären Sie, warum kräftiges Schütteln den Niederschlag zerkleinern würde.

Beobachtung und Interpretation des Ergebnisses

• Beschreiben Sie den Niederschlag hinsichtlich Farbe, Position und Beschaffenheit und ordnen Sie jede Phase des Experimentes dem dafür verantwortlichen Reagenz zu.
• Unterscheiden Sie einen Rohextrakt von gereinigter DNA und benennen Sie, was sonst noch in der Masse vorhanden ist, die gerade gesammelt wurde.

Protokoll

Sicherheit — Methanol. In diesem Versuch wird Methanol zur Ausfällung der DNA verwendet. Methanol ist bei Einatmen, Verschlucken und Hautkontakt giftig und wird vom Körper – anders als Ethanol – in Ameisensäure umgewandelt, die den Sehnerv dauerhaft schädigen kann. Bereits Mengen von deutlich unter 30 ml haben zu Erblindung geführt. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz, halten Sie die Flasche verschlossen und von offenen Flammen fern, arbeiten Sie in einem gut belüfteten Raum, pipettieren Sie niemals mit dem Mund und waschen Sie sich anschließend die Hände. Ethanol 95 % oder Isopropanol präzipitieren DNA ebenso gut und sind die sicherere Wahl, wenn Sie dieses Experiment an einem echten Labortisch wiederholen.

Teil A: Herstellung der Extraktionslösung

1. Messen Sie 30 ml destilliertes Wasser mit einem 70 ml Messzylinder ab.
2. Füllen Sie das destillierte Wasser in einen 50-ml-Becher.
3. Wiegen Sie das leere Wägeschiffchen auf der Waage.
4. 2,5 ml (5,4 g) Natriumchlorid in die Wägeschale auf der Waage geben.
5. Gießen Sie das Natriumchlorid in den Becher mit destilliertem Wasser.
6. Die Mischung mit einem Glasstab umrühren, bis sich das Salz vollständig aufgelöst hat.
7. Gib 10 Tropfen Spülmittel in den Becher.
8. Rühren Sie die Lösung erneut mit dem Glasstab, um eine homogene Mischung sicherzustellen.

Teil B: DNA-Extraktionsverfahren

1. Legen Sie ein Stück Banane in einen Mörser.
2. Zerdrücken Sie die Banane vorsichtig mit einem Stößel, bis Sie eine dicke und homogene Paste erhalten.
3. Geben Sie langsam die in den Schritten 1 bis 10 von Teil A vorbereitete Extraktionslösung zur Bananenpaste im Mörser hinzu.
4. Mischen Sie den Inhalt des Mörsers mit dem Glasstab gut durch, damit sich alles gleichmäßig verteilt.
5. Befestigen Sie eine Universal-Klemme in etwa 30 cm Höhe am Ständer.
6. Befestigen Sie ein Reagenzglas an der Universalspange.
7. Positionieren Sie den Trichter auf dem Reagenzglas.
8. Legen Sie ein Filterpapier in den Trichter.
9. Filtern Sie die Bananenmischung in das Reagenzglas und füllen Sie etwa ein Drittel davon (ungefähr 15 ml).
10. Messen Sie 10 ml kaltes Methanol mit einem 10 ml Messzylinder ab. Methanol ist giftig: Tragen Sie Handschuhe und einen Augenschutz, halten Sie es von offenem Feuer fern, arbeiten Sie in einem gut belüfteten Bereich und pipettieren Sie niemals mit dem Mund.
11. Entferne den Trichter und den Filter aus dem Reagenzglas.
12. Gießen Sie das Methanol langsam an der Wand des Reagenzglases entlang. Das Volumen des Methanols sollte etwa das Doppelte des Filtrats betragen, reduzieren Sie das Filtrat daher auf etwa 5 ml, bevor Sie die 10 ml Methanol hinzufügen.
13. Den Inhalt des Reagenzglases vorsichtig mit einem Glasstab vermischen. Vermeiden Sie es, das Reagenzglas zu schütteln, um die Lösung nicht zu stören.

Die DNA wird als graues Präzipitat erscheinen, das einer faserigen oder gallertartigen Substanz ähnelt.

Erwartete Ergebnisse

Jedes Reagenz in diesem Protokoll hat eine Aufgabe, und jedes einzelne bewirkt eine sichtbare Veränderung. Die folgende Tabelle dient als Referenz, anhand derer eine Lehrkraft bewerten kann: Sie ordnet jedes Reagenz seiner Wirkung auf die Probe zu.

Die zweite Tabelle zeigt das in jeder Phase zu erwartende Erscheinungsbild, das im Beobachtungsheft festgehalten werden soll.

Die beiden Größen, die sich zu berechnen lohnen. Die Konzentration der Salzlösung ergibt sich aus c = m / (M × V). Mit M(NaCl) = 58,44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. Natriumchlorid ist bei 20 °C bei etwa 359 g/L gesättigt, was 6,1 mol/L entspricht; die Extraktionslösung ist also etwa zur Hälfte gesättigt und um ein Vielfaches konzentrierter als die 0,15 bis 0,5 mol/L, die in den meisten Extraktionspuffern im Unterricht verwendet werden. Die Ausfällung funktioniert dennoch, da der Abschirmungseffekt bereits weit unter 3 mol/L gesättigt ist; ein Schüler, der den Wert berechnet, sollte jedoch darauf hingewiesen werden, dass dieser ungewöhnlich hoch ist, anstatt anzunehmen, es handele sich um einen Standardwert. Die zweite Größe ist der Alkoholanteil: Das Röhrchen enthält 15 mL Filtrat und wird mit 10 mL Methanol versetzt, sodass der Alkohol 10 / (15 + 10) = 40 % des Volumens ausmacht. DNA beginnt bei etwa 35 bis 40 % Alkohol aus der Lösung auszutreten und fällt bei etwa 65 bis 70 % vollständig aus. Deshalb bildet sich bei diesem Protokoll der Niederschlag an der Grenzfläche, wo der lokale Alkoholanteil deutlich über 40 % liegt, und weshalb das Röhrchen nur vorsichtig gemischt und nicht umgedreht wird.

Warum Salz und Alkohol zusammenwirken müssen. Beim pH-Wert der Extraktionslösung ist jede Phosphodiestergruppe im Rückgrat ionisiert, sodass ein DNA-Molekül eine Kette negativer Ladungen ist, die sich gegenseitig und benachbarte Moleküle abstoßen. Natriumionen drängen sich um diese Ladungen und schirmen sie ab. Wie stark sie festgehalten werden, hängt nach dem Coulombschen Gesetz vom Medium ab. F = q₁q₂ / (4πε₀ε_rr²): die relative Permittivität ε_r beträgt bei Wasser bei 25 °C etwa 78 und bei Methanol etwa 33, sodass der Ersatz eines Teils des Wassers durch Methanol die Anziehung zwischen einem Natriumion und einer Phosphatgruppe bei gleichem Abstand um den Faktor von grob 78 / 33 ≈ 2,4 verstärkt. Die Ladung wird effektiver neutralisiert, die Stränge hören auf, sich abzustoßen, und sie aggregieren. Alkohol geht zudem Wasserstoffbrücken mit dem Rückgrat wesentlich schlechter ein als Wasser, sodass die geordnete Hülle aus Wassermolekülen, die die DNA in Lösung hält, abgetreift wird. Keines der Reagenzien allein reicht aus: Ohne Salz bildet sich das abgeschirmte Aggregat nie, und ohne Alkohol bleibt die DNA in Lösung.

Warum eine Masse sichtbar ist, während ein Molekül es nicht ist. Eine DNA-Doppelhelix ist etwa 2 nm breit, was grob einem Hundertstel der Auflösungsgrenze eines Lichtmikroskops von 200 nm und etwa 10⁴ bis 10⁵ mal dünner als ein menschliches Haar. Nichts, was im Reagenzglas zu sehen ist, ist ein einzelnes Molekül, und die Doppelhelix selbst kann hier nicht beobachtet werden – ihre Struktur wurde durch Röntgenbeugung ermittelt, nicht durch das Betrachten eines Präzipitats. Sichtbar ist ein Aggregat aus einer immensen Anzahl von Molekülen. Die Größenordnung lässt sich überprüfen: Die Kulturbanane ist triploid Musa acuminata mit 3n = 33 Chromosomen, und das haploide Genom umfasst etwa 523 Millionen Basenpaare, sodass ein Kern ungefähr 1,6 × 10⁹ Basenpaare. Bei durchschnittlich 650 g/mol pro Basenpaar wiegt die DNA in einem Zellkern 1,6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1,7 × 10⁻¹² g, das sind etwa 1,7 Pikogramm. Ein sichtbarer Klumpen von einem Milligramm repräsentiert daher den Kerngehalt von Hunderten von Millionen von Zellen, weshalb ein ganzes Gewebestück zerkleinert werden muss, um ihn zu erhalten.

Was der Niederschlag tatsächlich ist. In diesem Protokoll werden weder Protease noch Ribonuklease verwendet, und auf die Fällung folgt kein Waschschritt, sodass es sich bei dem gesammelten Material eher um eine rohe Nukleinsäurepräparation als um DNA handelt: Kern-DNA zusammen mit Chloroplasten- und mitochondrialer DNA, eine große Menge RNA, Restprotein, Polysaccharid aus der Banane und eingeschlossenes Detergenz. Diese Mischung ist der Grund, warum die Masse grau, klumpig und gelatinös aussieht, anstatt den sauberen weißen Faden einer gereinigten Präparation zu bilden, und sie ist die ehrliche Antwort auf die Frage, was extrahiert wurde.

Zusammenfassung der Aufgaben nach Klassenstufen

9. bis 10. Klasse

• Fokus dass DNA in jeder lebenden Zelle vorhanden ist und mit gewöhnlichen Reagenzien sichtbar gemacht werden kann und dass jedes Reagenz eine erkennbare Aufgabe hat.
• Aktivitäten: Führen Sie das Protokoll aus und benennen Sie jedes Instrument bei seiner Verwendung; protokollieren Sie das Aussehen der Lösung, der Paste, des Filtrats und des Präzipitats in einer Tabelle wie Tabelle 2; beschreiben Sie in jeweils einem Satz, was die Seife, das Salz und der Alkohol bewirken; listen Sie die Vorsichtsmaßnahmen auf, die für Methanol gelten, und erklären Sie, warum sie gelten; beschreiben Sie das Präzipitat, ohne zu behaupten, eine Doppelhelix gesehen zu haben.

11. Klasse

• Fokus quantitative Zubereitung einer Lösung und die physikalische Chemie der Fällung.
• Aktivitäten: Berechnen Sie die Konzentration der Extraktionslösung aus der Salzmasse und dem Wasservolumen (3,1 mol/l) und vergleichen Sie diese mit der Sättigung bei 20 °C; Berechnen Sie den endgültigen Alkoholanteil (40 % nach Volumen) und setzen Sie ihn in Beziehung zu dem Schwellenwert, bei dem die DNA aus der Lösung ausfällt; erklären Sie die Ladungsabschirmung unter Berücksichtigung der negativen Phosphatgruppen und der Natriumionen; vorhersagen, was passieren würde, wenn die Salzmenge halbiert oder das Methanol durch das gleiche Volumen Wasser ersetzt würde, und die Vorhersage begründen; erklären, warum der Alkohol kalt sein muss und warum das Röhrchen vorsichtig geschüttelt wird.

12. Klasse / College-Niveau

• Fokus der Abstand zwischen einem Rohlysat und einer analytisch nutzbaren Probe sowie das Design der Kontrollen, die die Rolle jedes Reagens bestimmen würden.
• Aktivitäten: Verwenden Sie das Coulomb-Gesetz und die relativen Dielektrizitätskonstanten von Wasser und Methanol, um quantitativ zu begründen, warum Alkohol die Aggregation fördert; schätzen Sie die DNA-Masse in einem Bananenkern anhand der Größe des triploiden Genoms und eines Wertes von 650 g/mol pro Basenpaar und berechnen Sie daraus, wie viele Zellen ein sichtbarer Klumpen umfasst; Vergleiche dieses Protokoll mit einer Standard-Pflanzenextraktion wie einem CTAB-Verfahren oder einer Silikatsäule und identifiziere die hier fehlenden Schritte – Ribonuklease, Protease, eine Alkoholwäsche, Resuspension in Puffer; erkläre, was ein A₂₆₀/A₂₈₀ Messung über diesen Extrakt verraten würde; entwerfen Sie die Kontrollreihe, die den Beitrag von Mahlen, Detergenz, Salz und Alkohol isoliert, und geben Sie an, welches Ergebnis jede Kontrolle liefern müsste.

Labor-Grundausstattung

Instrumente

• Waage mit Tarafunktion und Wiegeschiffchen
• Messlöffel / Spatel (2,5 ml)
• Pinzette
• Becherglas (50 mL)
• Messzylinder (70 mL)
• Messzylinder (10 ml)
• Glasstab
• Pipette (1 ml)
• Mörser und Stößel
• Metallständer mit Universalklemme
• Trichter und Filterpapier
• Reagenzglas (50 mL)

Produkte

• Bananenstücke
• Destilliertes Wasser (30 mL)
• NaCl, Kristalle (2,5 ml, 5,4 g)
• Spülmittel, flüssig (10 Tropfen)
• Methanol, flüssig, kalt (10 mL) — giftig, siehe Sicherheitshinweis im Protokoll