ADN vegetal

Extraer ADN es el primer paso de casi todos los procedimientos en biología molecular: secuenciar un genoma, analizar una variedad de cultivo en busca de un gen de resistencia a enfermedades, hacer coincidir una muestra forense o confirmar un diagnóstico clínico, todo comienza sacando el ADN de las células y colocándolo en un tubo. La química es la misma a cualquier escala. Una célula mantiene su contenido detrás de membranas construidas con fosfolípidos, y el ADN que está dentro es un polianión muy largo; cada grupo fosfato a lo largo de su esqueleto porta una carga negativa a pH neutro. Un detergente disuelve las membranas y libera lo que la célula contiene; la sal disuelta suministra iones de sodio que apantallan esas cargas negativas, por lo que las hebras vecinas dejan de repelerse entre sí; y un alcohol frío, en el cual el ADN es mucho menos soluble que en el agua, precipita entonces las moléculas apantalladas fuera de la solución formando una masa lo suficientemente grande como para verla a simple vista. El plátano es un material de partida conveniente: la pulpa es lo suficientemente blanda como para reducirla a una pasta con un mortero, contiene poca fibra y el plátano cultivado es triploide, por lo que cada célula porta tres juegos de cromosomas. En este laboratorio, usted preparará una solución de extracción a partir de agua destilada, cloruro de sodio y detergente para trastes, triturará un trozo de plátano hasta obtener una pasta homogénea, mezclará la pasta con esa solución, filtrará la mezcla a través de papel hacia un tubo de ensayo y añadirá metanol frío en capas sobre el filtrado. Al cabo de unos momentos, aparece un precipitado gris y filamentoso donde se encuentran los dos líquidos: ADN, junto con parte del otro material liberado de las células.

Metas educativas

Familiarización con el entorno de laboratorio

• Identifique la balanza, las probetas graduadas, el vaso de precipitados, el mortero con mano, el soporte con pinza, el embudo y los frascos de reactivos, e indique para qué se utiliza cada uno antes de empezar.
• Arma un equipo de filtración y evalúa si es estable antes de verterle cualquier cosa.

Manejo de un reactivo tóxico

• Reconozca que el metanol es tóxico por inhalación, ingestión y contacto con la piel, y trabaje con guantes y protección ocular, lejos de cualquier llama, en un área ventilada.
• Explica por qué el etanol 95 % o el isopropanol precipitarían el ADN igual de bien y son la opción más segura en un laboratorio real.

Preparación de una solución acuosa

• Mida 30 mL de agua destilada en una probeta graduada de 70 mL, leyendo la parte inferior del menisco a la altura de los ojos.
• Pese cloruro de sodio en un platillo de pesaje sobre una balanza tarada, transfiéralo sin pérdida y agite con una varilla de vidrio hasta que no queden cristales.
• Agregue un número contado de gotas de detergente y mezcle hasta obtener una solución homogénea.

Disrupción mecánica del tejido vegetal

• Tritura un trozo de plátano con un mortero hasta que la pasta sea uniforme y explica por qué la trituración debe preceder a la lisis química.

Filtración por gravedad

• Sujete un tubo de ensayo a unos 30 cm, coloque un embudo con un papel filtro y recolecte aproximadamente 15 mL de filtrado.
• Señale lo que el papel retiene —fragmentos de pared celular, granos de almidón y fibra— y lo que pasa a través de él.

Precipitación por alcohol

• Mida 10 mL de metanol frío y viértalo lentamente por la pared del tubo de ensayo para que forme una capa sobre el filtrado en lugar de mezclarse con este.
• Mezcle suavemente y solo lo suficiente para poner los dos líquidos en contacto, y explique por qué una agitación vigorosa rompería el precipitado.

Observación e interpretación del resultado

• Describa el precipitado en cuanto a color, posición y textura, y atribuya cada etapa del experimento al reactivo responsable de ella.
• Distinga un extracto crudo de ADN purificado y nombre qué más está presente en la masa que se acaba de recolectar.

Protocolo

Seguridad: metanol. En este laboratorio se utiliza metanol para precipitar el ADN. El metanol es tóxico por inhalación, ingestión y contacto con la piel, y, a diferencia del etanol, el cuerpo lo convierte en ácido fórmico, lo cual puede dañar de manera permanente el nervio óptico. Se han registrado casos de ceguera con dosis muy inferiores a 30 mL. Usa guantes y protección para los ojos, mantén la botella tapada y alejada de cualquier llama, trabaja en un área ventilada, nunca pipetees con la boca y lávate las manos después. El etanol 95 % o el isopropanol precipitan el ADN igual de bien y son la opción más segura si repites este experimento en un laboratorio real.

Parte A: Preparación de la solución de extracción

1. Mida 30 mL de agua destilada usando una probeta graduada de 70 mL.
2. Transfiera el agua destilada a un vaso de precipitados de 50 mL.
3. Pese el platillo de pesaje vacío en la balanza.
4. Agregue 2.5 mL (5.4 g) de cloruro de sodio en el platillo de pesaje en la balanza.
5. Vierta el cloruro de sodio en el vaso de precipitados que contiene el agua destilada.
6. Agite la mezcla con una varilla de vidrio hasta que la sal se disuelva por completo.
7. Agregue 10 gotas de jabón para platos al vaso de precipitados.
8. Agite la solución nuevamente con la varilla de vidrio para asegurar una mezcla homogénea.

Parte B: Procedimiento de extracción de ADN

1. Coloque un trozo de plátano en un mortero.
2. Muele cuidadosamente el plátano con un mazo hasta obtener una pasta espesa y homogénea.
3. Agregue lentamente la solución de extracción preparada durante los pasos 1 al 10 de la parte A a la pasta de plátano en el mortero.
4. Usando la varilla de vidrio, mezcle bien el contenido del mortero para lograr una distribución uniforme.
5. Acople una pinza universal al soporte a una altura de unos 30 cm.
6. Fije un tubo de ensayo a la pinza universal.
7. Coloque el embudo en el tubo de ensayo.
8. Coloque un papel de filtro en el embudo.
9. Filtre la mezcla de plátano en el tubo de ensayo, llenando aproximadamente un tercio del mismo (unos 15 mL).
10. Mida 10 mL de metanol frío usando una probeta graduada de 10 mL. El metanol es tóxico: use guantes y protección ocular, manténgalo alejado de cualquier llama, trabaje en un área ventilada y nunca pipetee con la boca.
11. Retira el embudo y el filtro del tubo de ensayo.
12. Vierta lentamente el metanol a lo largo de la pared del tubo de ensayo. El volumen de metanol debe ser aproximadamente el doble que el del filtrado, así que reduzca el filtrado a unos 5 mL antes de añadir los 10 mL de metanol.
13. Mezcle suavemente el contenido del tubo de ensayo con una varilla de vidrio. Evite agitar el tubo de ensayo para no perturbar la solución.

El ADN aparecerá como un precipitado gris, que se asemeja a una sustancia fibrosa o gelatinosa.

Resultados esperados

Cada reactivo en este protocolo tiene una función, y cada uno produce un cambio que se puede ver. La tabla a continuación es la referencia con la que un profesor puede calificar: vincula cada reactivo con el efecto que tiene en la muestra.

La segunda tabla indica la apariencia esperada en cada etapa, que es lo que se debe registrar en la libreta de observaciones.

Las dos cantidades que vale la pena calcular. La concentración de la solución salina se deduce de c = m / (M × V). Con M(NaCl) = 58.44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. El cloruro de sodio se satura a aproximadamente 359 g/L a 20 °C, o 6,1 mol/L, por lo que la solución de extracción está aproximadamente a la mitad de su saturación y es varias veces más concentrada que los 0,15 a 0,5 mol/L que utilizan la mayoría de los tampones de extracción en las aulas. La precipitación sigue funcionando, ya que el efecto de cribado ya está saturado muy por debajo de los 3 mol/L, pero a un estudiante que calcule el valor se le debe indicar que es inusualmente alto, en lugar de dejar que asuma que es estándar. La segunda cantidad es la fracción de alcohol: el tubo contiene 15 mL de filtrado y recibe 10 mL de metanol, por lo que el alcohol representa 10 / (15 + 10) = 40 % por volumen. El ADN comienza a salir de la solución aproximadamente entre 35 y 40 % de alcohol y se precipita por completo cerca de 65 a 70 %, por lo que este protocolo produce su precipitado en la interfaz, donde la fracción de alcohol local es mucho mayor que 40 %, y por qué el tubo solo se agita suavemente en lugar de invertirse.

Por qué la sal y el alcohol tienen que actuar juntos. Al pH de la solución de extracción, cada grupo fosfodiéster en el esqueleto está ionizado, por lo que una molécula de ADN es una cadena de cargas negativas que se repelen entre sí y repelen a las moléculas vecinas. Los iones de sodio se agrupan alrededor de esas cargas y las apantallan. Qué tan fuertemente se mantienen unidos depende del medio, a través de la ley de Coulomb. F = q₁q₂ / (4πε₀₀ε_rr²): la permitividad relativa ε_r es de aproximadamente 78 para el agua a 25 °C y de alrededor de 33 para el metanol, por lo que reemplazar parte del agua con metanol fortalece la atracción entre un ion de sodio y un grupo fosfato en un factor de aproximadamente 78 / 33 ≈ 2.4 a la misma separación. La carga se neutraliza con mayor eficacia, las cadenas dejan de repelerse y se agregan. El alcohol también forma enlaces de hidrógeno con la cadena principal con mucha menos facilidad que el agua, por lo que la capa ordenada de moléculas de agua que mantiene disuelto el ADN se elimina. Ninguno de los reactivos por sí solo es suficiente: sin sal nunca se forma el agregado apantallado y sin alcohol el ADN permanece en solución.

Por qué una masa es visible cuando una molécula no lo es. Una doble hélice de ADN mide aproximadamente 2 nm de ancho, más o menos una centésima parte del límite de resolución de 200 nm de un microscopio de luz visible y unas 10⁴ a 10⁵ veces más delgado que un cabello humano. Nada de lo que se ve en el tubo de ensayo es una sola molécula, y la doble hélice en sí no se puede observar aquí; su estructura se estableció mediante difracción de rayos X, no observando un precipitado. Lo que es visible es un agregado de una inmensa cantidad de moléculas. El orden de magnitud se puede comprobar: el plátano cultivado es triploide Musa acuminata con 3n = 33 cromosomas, y el genoma haploide es de aproximadamente 523 millones de pares de bases, por lo que un núcleo contiene aproximadamente 1.6 × 10⁹ pares de bases. Con un promedio de 650 g/mol por par de bases, el ADN en un núcleo pesa 1.6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1.7 × 10⁻¹² g, eso equivale a unos 1.7 picogramos. Por lo tanto, un cúmulo visible de un miligramo representa el contenido nuclear de cientos de millones de células, razón por la cual es necesario triturar un trozo entero de tejido para obtenerlo.

Lo que es realmente el precipitado. En este protocolo no se utilizan proteasas ni ribonucleasas, y no hay ningún paso de lavado posterior a la precipitación, por lo que el material recolectado es una preparación de ácidos nucleicos en bruto en lugar de ADN: ADN nuclear junto con ADN de cloroplastos y mitocondrias, una gran cantidad de ARN, proteínas residuales, polisacáridos del plátano y detergente atrapado. Esa mezcla es la razón por la cual la masa se ve gris, grumosa y gelatinosa en lugar de formar el hilo blanco limpio de una preparación purificada, y es la respuesta honesta a la pregunta de qué se ha extraído.

Resumen de tareas por rango de calificaciones

Grado 9-10

• Enfoque que el ADN está presente en cada célula viva y puede hacerse visible con reactivos comunes, y que cada reactivo tiene una función identificable.
• Actividades: lleve a cabo el protocolo y nombre cada instrumento a medida que se utiliza; registre la apariencia de la solución, la pasta, el filtrado y el precipitado en una tabla como la Tabla 2; indique en una sola oración qué hacen el jabón, la sal y el alcohol; enumere las precauciones que se aplican al metanol y explique por qué se aplican; describa el precipitado sin afirmar haber visto una doble hélice.

Undécimo grado

• Enfoque preparación cuantitativa de una solución y la fisicoquímica de la precipitación.
• Actividades: calcular la concentración de la solución de extracción a partir de la masa de sal y el volumen de agua (3,1 mol/L) y compararla con la concentración de saturación a 20 °C; calcular la fracción final de alcohol (40 % por volumen) y relacionarla con el umbral en el que el ADN se precipita de la solución; explicar el enmascaramiento de cargas en términos de los grupos fosfato negativos y los iones de sodio; predecir qué sucedería si se redujera a la mitad la cantidad de sal o se reemplazara el metanol por un volumen igual de agua, y justificar la predicción; explicar por qué el alcohol debe estar frío y por qué se agita suavemente el tubo.

12.º grado / Nivel universitario

• Enfoque la distancia entre un lisado crudo y una muestra analíticamente útil, y el diseño de los controles que establecerían el papel de cada reactivo.
• Actividades: Utiliza la ley de Coulomb y las permitividades relativas del agua y el metanol para argumentar cuantitativamente por qué el alcohol promueve la agregación; estima la masa de ADN en un núcleo de plátano a partir del tamaño del genoma triploide y 650 g/mol por par de bases, y utilízala para estimar cuántas células representa un grumos visible; compara este protocolo con una extracción de plantas estándar como un procedimiento CTAB o una columna de sílice, e identifica los pasos que faltan aquí: ribonucleasa, proteasa, un lavado con alcohol, resuspensión en tampón; explica qué es un A₂₆₀/A₂₈₀ la medición revelaría sobre este extracto; diseñe la serie de control que aísle la contribución de la molienda, el detergente, la sal y el alcohol, y establezca qué resultado tendría que arrojar cada control.

Elementos esenciales para el laboratorio

Instrumentos

• Balanza con función de tara y cápsula de pesaje
• Cucharas medidoras / espátulas (2.5 mL)
• Pinzas
• Vaso de precipitados (50 mL)
• Probeta graduada (70 mL)
• Probeta graduada (10 mL)
• Varilla de vidrio
• Gotero (1 mL)
• Mortero y mano
• Soporte metálico con abrazadera universal
• Embudo y papel de filtro
• Tubo de ensayo (50 mL)

Productos

• Plátano (en trozos)
• Agua destilada (30 mL)
• NaCl, cristales (2.5 mL, 5.4 g)
• Jabón líquido para platos (10 gotas)
• Metanol, líquido, frío (10 mL) — tóxico, ver la nota de seguridad en el protocolo