026 – DNA roślinne

Ekstrakcja DNA to pierwszy krok prawie każdej procedury w biologii molekularnej: sekwencjonowanie genomu, testowanie odmiany rośliny uprawnej pod kątem genów odporności na choroby, dopasowywanie próby kryminalistycznej lub potwierdzanie diagnozy klinicznej – wszystkie te działania zaczynają się od uwolnienia DNA z komórek do probówki. Chemia tego procesu jest taka sama na każdą skalę. Komórka utrzymuje swoją zawartość za błonami zbudowanymi z fosfolipidów, a znajdujący się wewnątrz DNA jest bardzo długim polianionem – każda grupa fosforanowa wzdłuż jego szkieletu niesie jeden ujemny ładunek przy obojętnym pH. Detergent rozpuszcza błony i uwalnia zawartość komórki; rozpuszczona sól dostarcza jonów sodu, które neutralizują te ujemne ładunki, dzięki czemu sąsiadujące nici przestają się wzajemnie odpychać; a zimny alkohol, w którym DNA jest znacznie mniej rozpuszczalne niż w wodzie, wytrąca zneutralizowane cząsteczki z roztworu w postaci masy dużej na tyle, by zobaczyć ją gołym okiem. Banan jest wygodnym materiałem wyjściowym: jego miąższ jest na tyle miękki, że można go rozgnieść tłuczkiem na pastę, zawiera niewiele błókien, a uprawny banan jest triploidalny, co oznacza, że każda komórka niesie trzy zestawy chromosomów. W tym laboratorium przygotujesz roztwór do ekstrakcji z wody destylowanej, chlorku sodu i płynu do naczyń, rozgnieciesz kawałek banana na jednorodną pastę, wymieszasz pastę z tym roztworem, przesączysz mieszaninę przez bibułę do probówki i nawarstwisz zimny metanol na wierzch przesączu. W ciągu chwili na styku obu cieczy pojawia się szary, włóknisty osad – DNA wraz z częścią innego materiału uwolnionego z komórek.

Cele edukacyjne

Zapoznanie się ze środowiskiem laboratoryjnym

• Zidentyfikuj wagę, cylindry miarowe, zlewekę, moździerz z tłuczkiem, statyw z łapą, lejek oraz butle z odczynnikami i przed rozpoczęciem wyjaśnij, do czego służy każda z tych rzeczy.
• Złóż zestaw do filtracji i oceń, czy jest stabilny, zanim cokolwiek do niego wlejesz.

Obchodzenie się z toksycznym odczynnikiem

• Uznaj metanol za toksyczny w przypadku wdychania, połknięcia i w kontakcie ze skórą, i pracuj w rękawicach oraz w okularach ochronnych, z dala od jakiegokolwiek ognia, w wentylowanym pomieszczeniu.
• Wyjaśnij, dlaczego etanol 95 % lub izopropanol równie skutecznie powodują wytrącanie DNA i stanowią bezpieczniejszy wybór w warunkach laboratoryjnych.

Przygotowanie roztworu wodnego

• Odmierz 30 ml wody destylowanej w 70-mililitrowym cylindrze miarowym, odczytując poziom dołu menisku na wysokości wzroku.
• Zważ chlorek sodu w naczyniu wagowym na tarowanej wadze, przenieś go bez strat i mieszaj szklaną pałeczką, aż nie pozostaną żadne kryształy.
• Dodaj określoną liczbę kropel detergentu i wymieszaj do uzyskania jednorodnego roztworu.

Mechaniczne uszkodzenie tkanki roślinnej

• Rozgnieć kawałek banana za pomocą tłuczka, aż powstanie jednolita pasta, i wyjaśnij, dlaczego rozcieranie musi poprzedzać lizę chemiczną.

Filtracja grawitacyjna

• Zamocuj probówkę w uchwycie na wysokości około 30 cm, umieść w niej a lejek z bibułą filtracyjną i przesącz około 15 ml przesączu.
• Podaj, co papier zatrzymuje – fragmenty ścian komórkowych, ziarna skrobi i włókna – oraz co przez niego przechodzi.

Trącanie alkoholem

• Odmierz 10 ml zimnego metanolu i wlej go powoli po ściance probówki tak, aby ułożył się warstwą na filtracie, zamiast się z nim wymieszać.
• Wymieszaj delikatnie i tylko w takim stopniu, aby doprowadzić oba płyny do kontaktu, oraz wyjaśnij, dlaczego energiczne wstrząsanie spowodowałoby ścięcie osadu.

Obserwacja i interpretacja wyniku

• Opisz osad pod względem barwy, położenia i konsystencji oraz przypisz każdy etap eksperymentu odczynnikowi, który go wywołał.
• Rozróżnij ekstrakt surowy od oczyszczonego DNA i wymienij, co jeszcze znajduje się w świeżo zebranej masie.

Protokół

Bezpieczeństwo — metanol. W tym ćwiczeniu do wytrącania DNA stosuje się metanol. Metanol jest toksyczny w przypadku wdychania, spożycia oraz kontaktu ze skórą, a w przeciwieństwie do etanolu organizm przekształca go w kwas mrówkowy, który może trwale uszkodzić nerw wzrokowy. Nawet dawki znacznie poniżej 30 ml spowodowały przypadki ślepoty. Należy nosić rękawiczki i okulary ochronne, utrzymywać butelkę zakorkowaną i z dala od ognia, pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, nigdy nie pipetować ustami oraz umyć ręce po zakończeniu pracy. Etanol 95 % lub izopropanol wytrącają DNA równie skutecznie i stanowią bezpieczniejszy wybór, jeśli eksperyment ten zostanie powtórzony na prawdziwym stole laboratoryjnym.

Część A: Przygotowanie roztworu ekstrakcyjnego

1. Odmierzyć 30 ml wody destylowanej za pomocą cylindra miarowego o pojemności 70 ml.
2. Przenieś wodę destylowaną do zlewki o pojemności 50 ml.
3. Zważ pustą łódkę wagową na wadze.
4. Wsypać 2,5 ml (5,4 g) chlorku sodu do łódki wagowej na wadze.
5. Wsyp.
6. Wymieszaj mieszaninę szklaną bagietką, aż sól całkowicie się rozpuści.
7. Dodaj 10 kropli płynu do naczyń do zlewki.
8. Ponownie zamieszaj roztwór szklaną bagietką, aby zapewnić jednorodną mieszaninę.

Część B: Procedura ekstrakcji DNA

1. Umieść kawałek banana w moździerzu.
2. Ostrożnie rozgnieć banana tłuczkiem, aż uzyskasz gęstą i jednolitą pastę.
3. Stopniowo dodawaj roztwór ekstrahujący przygotowany w krokach od 1 do 10 części A, do pasty bananowej w moździerzu.
4. Używając szklanego pręcika, dokładnie wymieszaj zawartość moździerza w celu równomiernego rozprowadzenia.
5. Przymocuj uniwersalny zacisk do statywu na wysokości około 30 cm.
6. Przymocuj probówkę do zacisku uniwersalnego.
7. Umieść lejek na probówce.
8. Umieść bibułę filtracyjną w lejku.
9. Przecedź mieszaninę bananową do probówki, napełniając ją do około jednej trzeciej objętości (około 15 ml).
10. Odmierz 10 mL zimnego metanolu za pomocą cylindra miarowego o pojemności 10 mL. Metanol jest toksyczny: Noś rękawice i okulary ochronne, trzymaj z dala od otwartego ognia, pracuj w wentylowanym pomieszczeniu i nigdy nie pipetuj ustami.
11. Wyjmij lejek i filtr z probówki.
12. Powoli wlej metanol wzdłuż ścianki probówki. Objętość metanolu powinna wynosić około dwukrotności objętości przesączu, dlatego przed dodaniem 10 ml metanolu należy odparować przesącz do objętości około 5 ml.
13. Delikatnie wymieszaj zawartość probówki szklaną bagietką. Unikaj potrząsania probówką, aby nie zmącić roztworu.

DNA będzie wyglądać jak szary osad, przypominający włóknistą lub galaretowatą substancję.

Przewidywane wyniki

Każdy odczynnik w tym protokole ma jedno zadanie, a każdy z nich wywołuje zmianę, którą można zobaczyć. Poniższa tabela stanowi punkt odniesienia, według którego nauczyciel może oceniać: przyporządkowuje ona każdemu odczynnikowi wywoływany przez niego efekt na próbce.

Druga tabela przedstawia wygląd oczekiwany na każdym etapie, co należy odnotować w zeszycie obserwacji.

Dwie wielkości, które warto obliczyć. Stężenie roztworu soli wynika z równania c = m / (M × V). Z M(NaCl) = 58,44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. Chlorek sodu osiąga nasycenie przy stężeniu około 359 g/l w temperaturze 20 °C, czyli 6,1 mol/l, więc roztwór ekstrakcyjny jest w przybliżeniu w połowie nasycony i kilkakrotnie bardziej stężony niż roztwory o stężeniu od 0,15 do 0,5 mol/l, które są najczęściej stosowane jako bufory ekstrakcyjne w salach lekcyjnych. Wysadzanie nadal przebiega prawidłowo, ponieważ efekt przesiewowy jest już nasycony znacznie poniżej stężenia 3 mol/l, jednak uczeń, który oblicza tę wartość, powinien zostać poinformowany, że jest ona niezwykle wysoka, a nie pozostawiony z założeniem, że jest to wartość standardowa. Drugą wielkością jest frakcja alkoholowa: probówka zawiera 15 ml filtratu i dodaje się do niej 10 ml metanolu, więc alkohol stanowi 10 / (15 + 10) = 40 % objętościowo. DNA zaczyna wytrącać się z roztworu przy stężeniu alkoholu wynoszącym około 35–40 %, a całkowicie wytrąca się przy stężeniu około 65–70 %, dlatego w tej procedurze osad powstaje na granicy faz, gdzie lokalna frakcja alkoholu jest znacznie wyższa niż 40 %, i dlatego probówkę miesza się jedynie delikatnie, a nie odwraca do góry dnem.

Dlaczego sól i alkohol muszą działać razem?. Przy danym pH roztworu ekstrakcyjnego każda grupa fosfodiesterowa w łańcuchu głównym ulega jonizacji, więc cząsteczka DNA stanowi łańcuch ładunków ujemnych, które odpychają się nawzajem oraz odpychają sąsiednie cząsteczki. Jony sodu gromadzą się wokół tych ładunków i ekranują je. Siła, z jaką są one utrzymywane, zależy od ośrodka zgodnie z prawem Coulomba F = q₁q₂ / (4πε₀ε_rr²): względna przenikalność elektryczna ε_r wynosi około 78 dla wody w temperaturze 25 °C i około 33 dla metanolu, więc zastąpienie części wody metanolem wzmacnia przyciąganie między jonem sodu a grupą fosforanową w stosunku około 78 / 33 ≈ 2,4 przy tej samej odległości. Ładunek jest neutralizowany skuteczniej, nici przestają się odpychać i ulegają agregacji. Alkohol tworzy również wiązania wodorowe z łańcuchem głównym znacznie rzadziej niż woda, więc uporządkowana powłoka cząsteczek wody, która utrzymuje DNA w stanie rozpuszczonym, zostaje usunięta. Żaden z tych odczynników sam w sobie nie wystarcza: bez soli nie powstaje agregat osłonięty, a bez alkoholu DNA pozostaje w roztworze.

Dlaczego masa jest widoczna, podczas gdy cząsteczka nie jest. Podwójna helisa DNA ma średnicę około 2 nm, co stanowi mniej więcej jedną setną granicy rozdzielczości mikroskopu światła widzialnego wynoszącej 200 nm oraz około 10⁴ to 10⁵ razy cieńsze od ludzkiego włosa. Nic, co widać w probówce, nie jest pojedynczą molekułą i samej podwójnej helisy nie da się tu zaobserwować — jej strukturę ustalono za pomocą dyfrakcji promieni rentgenowych, a nie poprzez patrzenie na osad. To, co jest widoczne, to agregat ogromnej liczby cząsteczek. Rząd wielkości można sprawdzić: banan uprawny jest triploidalny Musa acuminata z 3n = 33 chromosomy, a genom haploidalny liczy około 523 milionów par zasad, więc jądro komórkowe zawiera w przybliżeniu 1,6 × 10⁹ pary zasad. Przy średniej masie 650 g/mol na parę zasad DNA w jednym jądrze komórkowym waży 1,6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1,7 × 10⁻¹² g, czyli około 1,7 pikograma. Widoczna grudka o masie jednego miligrama zawiera zatem jądra setek milionów komórek, dlatego też, aby ją uzyskać, trzeba zmielić cały fragment tkanki.

Czym właściwie jest ten osad. W niniejszym protokole nie stosuje się proteazy ani rybonukleazy, a po wytrąceniu nie następuje etap płukania, więc zebrany materiał stanowi surowy preparat kwasów nukleinowych, a nie czyste DNA: DNA jądrowe wraz z DNA chloroplastowym i mitochondrialnym, dużą ilością RNA, resztkami białka, polisacharydem z banana oraz uwięzionym detergentem. To właśnie ta mieszanina sprawia, że masa wygląda na szarą, grudkowatą i galaretowatą, zamiast przybierać postać czystej, białej nici charakterystycznej dla preparatu oczyszczonego, i stanowi ona szczerą odpowiedź na pytanie, co zostało wyekstrahowane.

Podsumowanie zadania według zakresu ocen

Klasy 9–10

• Skupienie: że DNA występuje w każdej żywej komórce i można je uwidocznić za pomocą zwykłych odczynników, a każdy odczynnik pełni jedną konkretną funkcję.
• Aktywności: przeprowadź protokół i nazwij każdy przyrząd w miarę jego użycia; odnotuj wygląd roztworu, pasty, przesączu i osadu w tabeli podobnej do Tabeli 2; określ w jednym zdaniu dla każdego przypadku, co robi mydło, sól i alkohol; wymienić środki ostrożności dotyczące metanolu i wyjaśnić, dlaczego mają one zastosowanie; opisać osad bez twierdzenia, że widziało się podwójną helisę.

Klasa 11

• Skupienie: ilościowe przygotowanie roztworu oraz fizykochemia strącania.
• Aktywności: obliczyć stężenie roztworu ekstrakcyjnego na podstawie masy soli i objętości wody (3,1 mol/l) oraz porównać je ze stężeniem nasycenia w temperaturze 20 °C; obliczyć końcową frakcję alkoholu (40 % objętościowo) i odnieść ją do progu, przy którym DNA wytrąca się z roztworu; wyjaśnić zjawisko ekranowania ładunku w odniesieniu do ujemnych grup fosforanowych i jonów sodu; przewidzieć, co by się stało, gdyby zmniejszyć ilość soli o połowę lub zastąpić metanol równą objętością wody, oraz uzasadnić tę prognozę; wyjaśnić, dlaczego alkohol musi być schłodzony i dlaczego zawartość probówki należy delikatnie wymieszać.

Klasa 12 / Poziom akademicki

• Skupienie: różnica między surowym lizatem a próbką nadającą się do analizy oraz opracowanie grup kontrolnych, które pozwoliłyby określić rolę każdego odczynnika.
• Aktywności: wykorzystaj prawo Coulomba oraz względne przenikalności elektryczne wody i metanolu, aby ilościowo uzasadnić, dlaczego alkohol sprzyja agregacji; oszacuj masę DNA w jednym jądrze komórkowym banana na podstawie wielkości genomu triploidalnego oraz wartości 650 g/mol na parę zasad, a następnie wykorzystaj tę wartość do oszacowania, ile komórek reprezentuje widoczna grudka; porównaj tę procedurę ze standardową ekstrakcją z roślin, taką jak procedura CTAB lub kolumna krzemionkowa, i zidentyfikuj brakujące tutaj etapy — rybonukleazę, proteazę, przemywanie alkoholem, ponowne zawieszenie w buforze; wyjaśnij, czym jest A₂₆₀/A₂₈₀ pomiar ujawniłby na temat tego ekstraktu; zaprojektuj serię kontrolną, która izoluje wkład mielenia, detergentu, soli i alkoholu, oraz określ, jaki wynik musiałby dać każdy układ kontrolny.

Podstawowe wyposażenie laboratorium

Instrumenty

• Waga z funkcją tarowania i miską wagową
• Łyżeczki miarowe / łopatki (2,5 ml)
• Pęseta
• Zlewka (50 mL)
• Cylindryczny cylinder miarowy (70 ml)
• Cylindryczny cylinder miarowy (10 ml)
• Szklany pręt
• Kroplomierz (1 ml)
• Moździerz i tłuczek
• Metalowy stojak z uniwersalnym zaciskiem
• Lejek i bibuła filtracyjna
• Probówka (50 mL)

Produkty

• Banan (kawałki)
• Woda destylowana (30 mL)
• NaCl, kryształy (2,5 ml, 5,4 g)
• Płyn do naczyń, w płynie (10 kropel)
• Metanol, ciekły, zimny (10 mL) — toksyczny, patrz uwaga dotycząca bezpieczeństwa w protokole