026 – ADN vegetal

Extragerea ADN-ului este primul pas al aproape fiecărei proceduri în biologia moleculară: secvențierea unui genom, testarea unei soi de cultură pentru o genă de rezistență la boli, potrivirea unei probe medico-legale sau confirmarea unui diagnostic clinic încep toate prin a scoate ADN-ul din celule și a-l pune într-o eprubetă. Chimia este aceeași la orice scară. O celulă își păstrează conținutul în spatele unor membrane alcătuite din fosfolipide, iar ADN-ul din interior este un polianion foarte lung — fiecare grupare fosfat de pe lanțul său principal poartă o sarcină negativă la pH neutru. Un detergent dizolvă membranele și eliberează ceea ce conține celula; sarea dizolvată furnizează ionii de sodiu care ecranează acele sarcini negative, astfel încât catenele învecinate încetează să se respingă reciproc; iar un alcool rece, în care ADN-ul este mult mai puțin solubil decât în apă, determină apoi precipitarea moleculelor ecranate din soluție sub forma unei mase suficient de mari încât să poată fi văzută cu ochiul liber. Banana este un material de pornire convenabil: pulpa este suficient de moale pentru a fi redusă la o pastă cu un pistil, conține puține fibre, iar banana cultivată este triploidă, astfel încât fiecare celulă poartă trei seturi de cromozomi. În acest laborator veți prepara o soluție de extracție din apă distilată, clorură de sodiu și detergent de vase, veți zdrobi o bucată de banană până la obținerea unei paste omogene, veți amesteca pasta cu acea soluție, veți filtra amestecul prin hârtie într-o eprubetă și veți turna metanol rece în strat deasupra filtratului. În câteva momente, un precipitat gri, cu aspect de fire, apare la interfața celor două lichide — ADN-ul, împreună cu o parte din celălalt material eliberat din celule.

Obiective educaționale

Familiarizarea cu mediul de laborator

• Identificați balanța, cilindrii gradați, paharul de laborator, mojorul cu pistil, stativul cu clemă, pâlnia și sticlele de reactivi și precizați utilitatea fiecăruia înainte de a începe.
• Montați un sistem de filtrare și asigurați-vă că este stabil înainte de a turna ceva în el.

Manipularea unui reactiv toxic

• Recunoașteți metanolul ca fiind toxic prin inhalare, ingestie și contact cu pielea și lucrați cu mănuși și ochelari de protecție, departe de orice flacără, într-o zonă ventilată.
• Explicați de ce etanolul 95 % sau izopropanolul ar precipita ADN-ul la fel de bine și reprezintă opțiunea mai sigură în condiții reale de laborator.

Prepararea unei soluții apoase

• Măsurați 30 mL de apă distilată într-un cilindru gradat de 70 mL, citind partea inferioară a meniscului la nivelul ochilor.
• Cântăriți clorura de sodiu într-o nacelă de cântărire pe o balanță tarată, transferați-o fără pierderi și amestecați cu o baghetă de sticlă până nu mai rămân cristale.
• Adăugați un număr numărat de picături de detergent și amestecați până se obține o soluție omogenă.

Disrupția mecanică a țesutului vegetal

• Zdrobește o bucată de banană cu un pistil până când pasta devine omogenă și explică de ce Măcinarea trebuie să precede liza chimică.

Filtrare gravitațională

• Prinde o eprubetă la aproximativ 30 cm, fixează o pâlnie cu o hârtie de filtru și colectează aproximativ 15 mL de filtrat.
• Menționați ce reține hârtia — fragmente de perete celular, granule de amidon și fibre — și ce trece prin ea.

Precipitare cu alcool

• Măsurați 10 mL de metanol rece și turnați-l încet pe peretele eprubetei, astfel încât să se așeze în straturi peste filtrat, în loc să se amestece cu acesta.
• Amestecați ușor și atât cât să aduceți cele două lichide în contact, și explicați de ce o agitare viguroasă ar fărâmița precipitatul.

Observarea și interpretarea rezultatului

• Descrieți precipitatul în funcție de culoare, poziție și textură și atribuiți fiecare etapă a experimentului reactivului responsabil pentru aceasta.
• Diferențiați un extract crud de ADN-ul purificat și numiți ce altceva este prezent în masa care tocmai a fost colectată.

Protocol

Siguranță — metanol. În acest laborator se utilizează metanolul pentru precipitarea ADN-ului. Metanolul este toxic prin inhalare, ingestie și contact cu pielea și, spre deosebire de etanol, organismul îl transformă în acid formic, care poate provoca leziuni permanente ale nervului optic. Doze cu mult sub 30 ml au provocat orbire. Purtați mănuși și ochelari de protecție, țineți sticla închisă cu dopul și departe de orice sursă de flacără, lucrați într-un spațiu bine ventilat, nu pipetați niciodată cu gura și spălați-vă pe mâini după terminarea experimentului. Etanolul 95 % sau izopropanolul precipită ADN-ul la fel de bine și reprezintă opțiunea mai sigură dacă repetați acest experiment într-un laborator real.

Partea A: Prepararea soluției de extracție

1. Măsurați 30 mL de apă distilată folosind un cilindru gradat de 70 mL.
2. Transferați apa distilată într-un pahar Berzelius de 50 mL.
3. Cântăriți barca goală pe cântar.
4. Adăugați 2,5 ml (5,4 g) de clorură de sodiu în barca de cântărire de pe balanță.
5. Toarnă clorura de sodiu în vasul de sticlă care conține apa distilată.
6. Amestecați amestecul cu o baghetă de sticlă până când sarea este complet dizolvată.
7. Adaugă 10 picături de detergent de vase în paharul Berzelius.
8. Amestecați din nou soluția cu bagheta de sticlă pentru a obține un amestec omogen.

Partea B: Procedura de extracție a ADN-ului

1. Pune o bucată de banană într-un mojar.
2. Zdrobește cu grijă banana cu un pistil până obții o pastă groasă și omogenă.
3. Adăugați lent soluția de extracție preparată în etapele 1 până la 10 din partea A, la pasta de banane din mojar.
4. Folosind bagheta de sticlă, amestecați bine conținutul mojarului pentru o distribuție uniformă.
5. Atașați o clemă universală de stativ la o înălțime de aproximativ 30 cm.
6. Atașați un eprubetă la clema universală.
7. Așează pâlnia pe eprubetă.
8. Pune o hârtie de filtru în pâlnie.
9. Filtrați amestecul de banană în eprubetă, umplând aproximativ o treime din ea (aproximativ 15 mL).
10. Măsurați 10 mL de metanol rece folosind o eprubetă gradată de 10 mL. Metanolul este toxic: purtați mănuși și ochelari de protecție, feriți produsul de orice flacără, lucrați într-o zonă ventilată și nu pipetați niciodată cu gura.
11. Scoateți pâlnia și filtrul din eprubetă.
12. Turnați încet metanolul de-a lungul peretelui eprubetei. Volumul de metanol trebuie să fie de aproximativ două ori mai mare decât cel al filtratului, așa că reduceți filtrul la aproximativ 5 mL înainte de a adăuga cei 10 mL de metanol.
13. Amestecați ușor conținutul eprubetei cu o baghetă de sticlă. Evitați agitarea eprubetei pentru a nu tulbura soluția.

ADN-ul va apărea ca un precipitat gri, asemănător unei substanțe filamentoase sau gelatinoase.

Rezultate anticipate

Fiecare reactiv din acest protocol are un singur rol, iar fiecare dintre ele produce o schimbare care poate fi observată. Tabelul de mai jos reprezintă referința în funcție de care un profesor poate nota: el asociază fiecare reactiv cu efectul pe care îl are asupra probei.

A doua tabelă oferă aspectul așteptat în fiecare etapă, ceea ce ar trebui să înregistreze caietul de observații.

Cele două mărimi care merită calculate. Concentrația soluției saline se calculează după formula c = m / (M × V). Cu M(NaCl) = 58,44 g/mol, c = 5,4 g / (58,44 g/mol × 0,0300 L) = 3,1 mol/L. Clorura de sodiu se saturează la aproximativ 359 g/L la 20 °C, sau 6,1 mol/L, astfel încât soluția de extracție este aproximativ pe jumătate saturată și de câteva ori mai concentrată decât cele de 0,15 până la 0,5 mol/L utilizate de majoritatea tampoanelor de extracție din sălile de clasă. Precipitarea are totuși loc, deoarece efectul de ecranare este deja saturat la o concentrație mult sub 3 mol/L, dar unui elev care calculează această valoare ar trebui să i se spună că este neobișnuit de mare, în loc să i se lase să presupună că este standard. A doua mărime este fracția de alcool: eprubeta conține 15 mL de filtrat și primește 10 mL de metanol, astfel încât alcoolul reprezintă 10 / (15 + 10) = 40 % din volum. ADN-ul începe să se precipite din soluție la aproximativ 35–40 % alcool și se precipită complet în jurul valorii de 65–70 %, motiv pentru care acest protocol produce precipitatul la interfață, unde fracția locală de alcool este mult mai mare decât 40 %, și de aceea eprubeta este agitată doar ușor, în loc să fie răsturnată.

De ce sarea și alcoolul trebuie să acționeze împreună. La pH-ul soluției de extracție, fiecare grup fosfodiesteric din lanțul principal este ionizat, astfel încât o moleculă de ADN reprezintă un lanț de sarcini negative care se resping între ele și resping moleculele învecinate. Ionii de sodiu se aglomerează în jurul acestor sarcini și le ecranează. Intensitatea cu care sunt reținuți depinde de mediu, conform legii lui Coulomb F = q₁q₂ / (4πε₀ε_rr²): permitivitatea relativă ε_r este de aproximativ 78 pentru apă la 25 °C și de aproximativ 33 pentru metanol, astfel încât înlocuirea unei părți din apă cu metanol intensifică atracția dintre un ion de sodiu și o grupare fosfat cu un factor de aproximativ 78 / 33 ≈ 2,4 la aceeași distanță de separare. Sarcina este neutralizată mai eficient, catenele încetează să se respingă și se agregă. De asemenea, alcoolul formează legături de hidrogen cu lanțul principal mult mai greu decât apa, astfel încât învelișul ordonat de molecule de apă care menține ADN-ul dizolvat este îndepărtat. Niciunul dintre reactivi nu este suficient pe cont propriu: fără sare, agregatul ecranat nu se formează niciodată, iar fără alcool, ADN-ul rămâne în soluție.

De ce masa este vizibilă, în timp ce o moleculă nu este. O dublă helix de ADN are un diametru de aproximativ 2 nm, adică aproximativ o sutime din limita de rezoluție de 200 nm a unui microscop cu lumină vizibilă și cam 10⁴ la 10⁵ de ori mai subțire decât un fir de păr uman. Nimic din ceea ce se vede în eprubetă nu este o singură moleculă, iar însăși dubla helix nu poate fi observată aici — structura sa a fost stabilită prin difracție cu raze X, nu prin observarea unui precipitat. Ceea ce este vizibil este un agregat format dintr-un număr imens de molecule. Ordinea de mărime poate fi verificată: banana cultivată este triploidă Musa acuminata cu 3n = 33 de cromozomi, iar genomul haploid are aproximativ 523 de milioane de perechi de baze, astfel încât un nucleu conține aproximativ 1,6 × 10⁹ perechi de baze. La o greutate medie de 650 g/mol pe pereche de baze, ADN-ul dintr-un nucleu cântărește 1,6 × 10⁹ × 650 / (6.02 × 10²³) ≈ 1,7 × 10⁻¹² g, adică aproximativ 1,7 picograme. Prin urmare, o bucată vizibilă de un miligram reprezintă conținutul nuclear al a sute de milioane de celule, motiv pentru care este necesar să se macine o bucată întreagă de țesut pentru a o obține.

Ce este, de fapt, precipitatul. În acest protocol nu se utilizează nicio protează și nicio ribonuclează și nicio etapă de spălare nu urmează precipitrii, astfel încât materialul colectat este o preparare brută de acizi nucleici, mai degrabă decât ADN: ADN nuclear împreună cu ADN de cloroplast și mitocondrial, o cantitate mare de ARN, proteine reziduale, polizaharide din banană și detergent prins în capcană. Acest amestec este motivul pentru care masa pare gri, gumată și gelatinoasă în loc să formeze firul alb curat al unui preparat purificat și este răspunsul sincer la întrebarea despre ce a fost extras.

Rezumatul temei pe intervale de note

Clasele a IX-a și a X-a

• Concentrare: că ADN-ul este prezent în fiecare celulă vie și poate fi evidențiat cu ajutorul unor reactivi obișnuiți, iar fiecare reactiv are o funcție specifică.
• Activități: urmați protocolul și numiți fiecare instrument pe măsură ce îl utilizați; notați aspectul soluției, al pastei, al filtratului și al precipitatului într-un tabel similar cu Tabelul 2; precizați într-o singură propoziție rolul săpunului, al sării și al alcoolului; enumerați măsurile de precauție aplicabile metanolului și explicați de ce sunt necesare; descrieți precipitatul fără a pretinde că ați observat o dublă helix.

Clasa a XI-a

• Concentrare: prepararea cantitativă a unei soluții și chimia fizică a precipitrii.
• Activități: să calculeze concentrația soluției de extracție pe baza masei de sare și a volumului de apă (3,1 mol/L) și să o compare cu concentrația de saturație la 20 °C; calculați fracția finală de alcool (40 % în volum) și corelați-o cu pragul la care ADN-ul se separă din soluție; explicați ecranarea sarcinii în termeni de grupări fosfat negative și ioni de sodiu; prezice ce s-ar întâmpla dacă cantitatea de sare ar fi redusă la jumătate sau dacă metanolul ar fi înlocuit cu un volum egal de apă și să justifice această previziune; să explice de ce alcoolul trebuie să fie rece și de ce eprubeta este agitată ușor.

Clasa a XII-a / Nivel universitar

• Concentrare: diferența dintre un lizat brut și o probă utilă din punct de vedere analitic, precum și conceperea martorilor care ar stabili rolul fiecărui reactiv.
• Activități: Folosește legea lui Coulomb și permitivitățile relative ale apei și metanolului pentru a argumenta cantitativ de ce alcoolul promovează agregarea; estimează masa ADN-ului dintr-un singur nucleu de banană pe baza dimensiunii genomului triploid și a 650 g/mol per pereche de baze și folosește-o pentru a estima câte celule reprezintă un ghem vizibil; compară acest protocol cu o extracție vegetală standard, cum ar fi procedura CTAB sau o coloană cu silicagel, și identifică etapele care lipsesc aici – ribonucleaza, proteaza, o spălare cu alcool, resuspendarea în tampon; explică ce este un A₂₆₀/A₂₈₀ ce ar revela această măsurătoare cu privire la acest extract; concepeți seria de teste de control care să izoleze contribuția măcinării, a detergentului, a sării și a alcoolului și precizați ce rezultat ar trebui să dea fiecare test de control.

Esențiale de laborator

Instrumente

• Cântar cu funcție de tarare și cu vas de cântărire
• Linguri de măsurare / spatule (2,5 ml)
• Pensetă
• Pahar de laborator (50 ml)
• Cilindru gradat (70 mL)
• Cilindru gradat (10 mL)
• Baghetă de sticlă
• Picurător (1 mL)
• Pojar și pistil
• Suport din metal cu clemă universală
• Pâlnie și hârtie de filtru
• Eprubetă (50 mL)

Produse

• Banane (bucăți)
• Apă distilată (30 mL)
• NaCl, cristale (2,5 mL, 5,4 g)
• Detergent de vase, lichid (10 picături)
• Metanol, lichid, rece (10 mL) — toxic, consultați nota de siguranță din protocol