024 – Osservazione di cellule animali

Il microscopio ottico composto è lo strumento che ha reso possibile la biologia cellulare, e le cellule che rivestono l'interno della guancia umana sono il primo campione classico. L'epitelio buccale è un tessuto squamoso stratificato: le sue cellule più esterne vengono continuamente esfoliate, quindi è possibile raccogliere un campione senza tagliare, colorare o sezionare nulla. I citologi usano ancora esattamente questo materiale per lo screening del cancro orale e per i tamponi buccali nei test genetici, il che lo rende un vero campione diagnostico piuttosto che una comodità didattica.

Le cellule animali viventi sono quasi invisibili in un microscopio ottico per una semplice ragione fisica: sono costituite principalmente da acqua e il loro indice di rifrazione è appena diverso da quello dell'acqua in cui sono immerse, per cui assorbono e deviano pochissimo della luce trasmessa. Ciò che un microscopista vede in tali condizioni è un debole contorno e poco altro. Una colorazione risolve il problema legandosi selettivamente ad alcune strutture e non ad altre, convertendo una differenza chimica in una differenza di colore che l'occhio può leggere. La soluzione di Lugol — iodio sciolto in ioduro di potassio — è la scelta standard per questa preparazione: tinge il citoplasma di un giallo-marrone tenue e mette in evidenza il nucleo come un corpo decisamente più scuro, e lo fa all'istante e senza riscaldamento.

In questo laboratorio preparerai due volte lo stesso campione e confronterai i due. Il primo vetrino è un preparato fresco in acqua; il secondo riceve una goccia di soluzione di Lugol prima che venga applicato il coprioggetto. Accenderai l'illuminatore a trasmissione, partirai dall'ingrandimento più basso per salire a 40×, 100× e 400×, mettendo a fuoco con la vite macrometrica solo a basso ingrandimento e con la vite micrometrica per i successivi, e salverai un'immagine a ogni passaggio. Il confronto tra i due vetrini è il punto chiave dell'esercitazione: mostra l'effetto di una colorazione e il motivo per cui quasi nessuna microscopia di tessuto animale viene eseguita senza di essa.

Obiettivi Educativi

Familiarizzazione con l'ambiente di laboratorio

• Individuare il microscopio e il suo interruttore di accensione, i tre obiettivi, le manopole di messa a fuoco macrometrica e micrometrica, il tavolino, i vetrini, i coprioggetti, i contagocce e la carta assorbente prima di iniziare.

Funzionamento di un microscopio ottico composto

• Imposta l'illuminazione trasmessa (in campo chiaro) dal basso e spiega perché è adatta a un campione sottile e trasparente e sarebbe inutile per uno opaco.
• Cambia gli obiettivi in ordine crescente — 4×, poi 10×, poi 40× — e calcola l'ingrandimento totale fornito da ciascuno con un oculare da 10×.
• Usare la messa a fuoco macrometrica solo al minor ingrandimento e quella micrometrica a quelli superiori, e spiegare cosa accadrebbe al vetrino e all'obiettivo se si usasse la manopola macrometrica a 400×.

Preparazione di un preparato a fresco

• Depositare una singola goccia di sospensione cellulare su un vetrino pulito, abbassarvi sopra un coprioggetto senza intrappolare bolle d'aria e tamponare il liquido in eccesso in modo che il coprioggetto poggi piatto contro il campione.
• Spiega perché il campione deve essere sottile e inondato di liquido affinché la luce possa attraversarlo.

Uso di una colorazione biologica

• Aggiungere la soluzione di Lugol a un vetrino duplicato e indicare quali strutture rende visibili e quali no.
• Confronta direttamente i preparati colorati e non colorati e spiega la differenza in termini di contrasto anziché di ingrandimento.

Osservazione e registrazione

• Salvare un'immagine al microscopio a ciascun ingrandimento per entrambi i vetrini e annotare la membrana cellulare, il citoplasma e il nucleo sulla vista colorata a 400×.
• Stima le dimensioni di una cellula e del suo nucleo dal campo visivo noto anziché andare a tentoni.

Protocollo

Preparazione

1. Accendi il microscopio premendo l'interruttore sulla parte anteriore dell'apparecchio. Accenderai l'illuminatore, in modo che la luce trasmessa passi attraverso il campione dal basso, il che è ideale per campioni trasparenti.
2. Posiziona due vetrini puliti sulla tua area di lavoro.

Preparazione della prima slide

1. Usa il contagocce per posizionare delicatamente 1 goccia di epitelio buccale sul primo vetrino.
2. Coprire il vetrino con un coprioggetto.
3. Tamponare delicatamente l'acqua in eccesso con carta assorbente.

Preparazione del secondo cursore

1. Usa il contagocce per posizionare delicatamente 1 goccia di epitelio buccale sul secondo vetrino.
2. Mettere una goccia di Lugol sul secondo vetrino.
3. Coprire il vetrino con il copri-vetrino.
4. Tamponare delicatamente l'acqua in eccesso con carta assorbente.

Osservazione della prima diapositiva

1. Posiziona il vetrino sul tavolino del microscopio.
2. Fare clic sul pulsante «Microscopio» sul tablet per visualizzare l'immagine del microscopio.
3. È possibile salvare un'immagine della vista microscopica osservata facendo clic sul pulsante «Salva immagine« situato nell'area in basso a sinistra della sezione «Microscopio«.

Regolazione del microscopio

1. Regolare l'ingrandimento toccando le lenti dell'obiettivo del microscopio. Iniziare l'osservazione a un ingrandimento di 40x (obiettivo rosso – etichettato Plan 4/0.10).
2. Affina la messa a fuoco con le manopole di regolazione macrometriche situate a sinistra e a destra del microscopio. Usa le manopole macrometriche solo a questo ingrandimento.
3. Aumentare gradualmente l'ingrandimento da 40x a 100x (obiettivo giallo - etichettato Plan 10/0.25), poi a 400x (obiettivo blu - etichettato Plan 40/0.65), riseducando la messa a fuoco ogni volta utilizzando esclusivamente la manopola micrometrica. A questi ingrandimenti la manopola macrometrica può spingere l'obiettivo contro il vetrino.

Nota: un ingrandimento di 1000x (obiettivo per immersione in olio – etichettato Plan 100/1.25) richiede l'uso di olio tra l'obiettivo e il vetrino coprioggetto. Pertanto, non utilizziamo questo obiettivo in questo laboratorio.

Osservazione della seconda diapositiva

1. Sostituisci la prima diapositiva con la seconda che contiene le cellule e il Lugol.
2. Osservare a un ingrandimento di 400x (obiettivo blu – etichettato Plan 40/0,65) per identificare un nucleo cellulare, che dovrebbe apparire colorato di giallo dal Lugol.
3. Registrazione delle osservazioni: Documentare o registrare le osservazioni importanti.

Spegnimento del microscopio

1. Spegni il microscopio premendo l'interruttore sulla parte anteriore del dispositivo.

Risultati Previsti

Un set di immagini di riferimento delle viste previste al microscopio è disponibile in questo documento (PDF).

Che aspetto hanno le cellule e perché

Le cellule epiteliali buccali sono squamose — appiattite e simili a piastrine — e, essendo sfaldate dalla superficie del tessuto, si trovano libere e prive di supporto sul vetrino. Una cellula animale non ha parete cellulare, ma solo una membrana plasmatica flessibile, quindi nulla la mantiene in una geometria fissa: le cellule si allargano, assumono contorni poligonali-arrotondati irregolari e spesso si sovrappongono o si piegano ai margini. Ciascuna è una cellula grande per gli standard animali, tipicamente di 50-70 µm di diametro ma spessa solo pochi micrometri, con un unico nucleo rotondo di circa 8-10 µm situato vicino al centro. Il contrasto con le cellule vegetali del laboratorio 025 merita di essere evidenziato esplicitamente: queste ultime sono rettangolari, impacchettate bordo a bordo in una griglia rigida, poiché una parete di cellulosa ne determina la forma.

Ingrandimento, risoluzione e campo visivo

L'ingrandimento totale è il prodotto dell'obiettivo e dell'oculare. Con l'oculare standard da 10×, M = M_ogg × M_occhio fornisce 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× e 40 × 10 = 400×. L'ingrandimento, tuttavia, si limita a ingrandire; ciò che determina il dettaglio più fine che può essere separato è l'apertura numerica stampata dopo la potenza dell'obiettivo. Secondo il criterio di Abbe, d = λ / (2 × NA); prendendo la luce verde a λ = 550 nm, l'obiettivo da 0,10 risolve d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, quello da 0,25 risolve 1,1 µm e quello da 0,65 risolve 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Un nucleo largo 8 µm è quindi in linea di principio risolvibile anche a 40×: è il contrasto, non la risoluzione, a renderlo invisibile sul vetrino non colorato.

Il campo visivo si restringe in proporzione all'aumento della potenza dell'obiettivo: per un oculare con un numero di campo di 18 mm, il diametro visibile è 18 ÷ 4 = 4,5 mm con l'obiettivo rosso, 1,8 mm con quello giallo e 18 ÷ 40 = 0,45 mm — ovvero 450 µm — con quello blu. Ciò fornisce un modo diretto per misurare le dimensioni di una cellula senza un reticolo: un campo a 400× largo circa 450 µm attraversato da circa sette cellule disposte bordo a bordo colloca ciascuna cellula intorno ai 60 µm. Spiega anche perché il campione debba essere prima centrato a basso ingrandimento, poiché a 400× solo circa un quattrocentesimo dell'area a basso ingrandimento è ancora in vista.

La profondità di campo diminuisce ancora più rapidamente della larghezza del campo, passando da decine di micrometri a 40× a ben al di sotto di un micrometro a 400×. È per questo motivo che il protocollo limita la manopola macrometric alla minima ingrandimento: a 400× l'obiettivo blu si trova a una frazione di millimetro sopra il coprioggetto, e un movimento macrometric spinge il vetro contro il vetro, incrinando il vetrino e danneggiando la lente frontale.

Perché la macchia funziona

La soluzione di Lugol è iodio molecolare tenuto in soluzione da ioduro di potassio come ione triioduro: I₂ + I^- Io₃^-. Lo iodio assorbe fortemente nello spettro visibile e si lega prontamente alle proteine e agli acidi nucleici, accumulandosi quindi dove la cellula è più densa di macromolecole. Il nucleo, ricco di DNA e istoni, assorbe molto più iodio per unità di volume rispetto al citoplasma acquoso circostante e appare quindi marcatamente più scuro. Il meccanismo è l'affinità chimica, non l'ingrandimento, che è il concetto più trasferibile in assoluto in laboratorio: per vedere una struttura bisogna prima trovare qualcosa che si leghi ad essa e non a ciò che la circonda.

Riepilogo del compito per intervallo di voti

Classe 9-10

• Concentrati — utilizzare il microscopio in sicurezza e descrivere ciò che si osserva, utilizzando il lessico dello strumento e della cellula: obiettivo, oculare, tavolino, messa a fuoco macrometrica e micrometrica, preparazione a umido, vetrino coprioggetto, colorante, membrana, citoplasma, nucleo.
• Attività — preparare entrambi i vetrini, osservare ciascuno a 40×, 100× e 400× e salvare le sei immagini. Disegnare la vista colorata a 400× ed etichettare la membrana, il citoplasma e il nucleo. Rispondere alle domande guida: cosa si può vedere sul vetrino colorato che non si può vedere su quello non colorato, e cosa aggiunge quindi la colorazione? Perché gli obiettivi vengono cambiati dal più basso al più alto e mai viceversa?

Undicesimo anno

• Concentrati — quantificare l'osservazione e collegare la struttura cellulare alla funzione cellulare.
• Attività — calcolare l'ingrandimento totale di ciascun obiettivo con un oculare da 10×; utilizzare il campo visivo (18 mm ÷ potenza dell'obiettivo) per stimare il diametro di una cellula e del suo nucleo in micrometri, e confrontare i risultati con i valori accettati di 50–70 µm e 8–10 µm; spiegare la forma irregolare di queste cellule con l'assenza di una parete cellulare, e confrontarla con le cellule vegetali del laboratorio 025; e identificare le strutture che devono essere presenti nella cellula ma non possono essere viste, spiegando il motivo in ogni caso.

12ª classe / Livello universitario

• Concentrati — l'ottica che stabilisce i limiti dello strumento e la chimica che stabilisce i limiti della colorazione.
• Attività — calcola il limite di risoluzione di Abbe d = λ / (2 × NA) per tutti e tre gli obiettivi e indica quali strutture cellulari ciascuno potrebbe in linea di principio risolvere; distingui la risoluzione dal contrasto e usa tale distinzione per spiegare perché un nucleo di 8 µm rimane invisibile sul montaggio in acqua nonostante ogni obiettivo possa risolverlo; spiega la chimica della soluzione di Lugol (formazione di triioduro e perché lo iodio si concentra nel nucleo) e proponi una colorazione che marcherebbe invece un organulo diverso, giustificando la scelta; stima la profondità di campo a ciascun ingrandimento e correlala alla restrizione della messa a fuoco macrometrica; e progetta un controllo che distingua un nucleo genuino da una bolla d'aria intrappolata o da una particella di detrito.

Materiale essenziale di laboratorio

Strumenti

• Microscopio ottico composto con illuminatore a luce trasmessa e tre obiettivi (Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65) con oculare 10× — ingrandimento totale 40×, 100× e 400×
• 2 vetrini da microscopio
• 2 coprivetrini
• Contagocce
• Pinzette (per la manipolazione dei coprioggetto)
• Becher (50 mL)
• Carta assorbente

Prodotti

• Cellule di epitelio boccale umano in sospensione (1 goccia per vetrino)
• Soluzione di Lugol 2% (1 goccia, solo sul secondo vetrino)