024 – Observació de cèl·lules animals

El microscopi òptic compost és l'instrument que va fer possible la biologia cel·lular, i les cèl·lules que recobreixen l'interior de la galta humana en són la primera mostra clàssica. L'epiteli bucal és un teixit escamós estratificat: les cèl·lules més externes es desprenen contínuament, de manera que es pot recollir una mostra sense tallar, tenyir ni fer seccions de res. Els citòlegs encara utilitzen exactament aquest material per a cribratges de càncer oral i per a frotis bucals en proves genètiques, la qual cosa el converteix en una mostra diagnòstica real més que no pas en una comoditat docent.

Les cèl·lules animals vives són gairebé invisibles en un microscopi òptic per un motiu físic ben senzill: són majoritàriament aigua, i el seu índex de refracció gairebé no difereix del de l'aigua on es troben, de manera que absorbeixen i desvien molt poca llum de la transmesa. El que un microscopista veu en aquestes condicions és una silueta tènue i poca cosa més. Un colorant soluciona el problema unint-se de manera selectiva a unes estructures i a d'altres no, i converteix una diferència de química en una diferència de color que l'ull pot distingir. La solució de Lugol —iode dissolt en iodur potàssic— és l'elecció estàndard per a aquesta preparació: tinteix el citoplasma d'un color groc-marró pàl·lid i destaca el nucli com un cos clarament més fosc, i ho fa a l'instant i sense necessitat d'escalfar.

En aquest laboratori preparareu la mateixa mostra dues vegades i fareu una comparació entre totes dues. La primera porta objectes és un preparat humit simple amb aigua; la segona rep una gota de solució de Lugol abans de posar el cubreobjectes. Encendreu la il·luminació transmesa, partireu del augment més baix i anireu pujant a 40×, 100× i 400×, enfokant amb el cargol macromètric només a baix augment i amb el micromètric a partir d'aleshores, i desareu una imatge a cada pas. La comparació entre les dues preparacions és la gràcia de l'exercici: mostra què fa un colorant i per què gairebé no es fa cap microscopia de teixit animal sense un de colorant.

Objectius educatius

Familiarització amb l'entorn del laboratori

• Localitzeu el microscopi i el seu interruptor d'encesa, els tres objectius, els cargols d'enfocament macromètric i micromètric, la platina, les mostres, els cobreobjectes, els comptagotes i el paper absorbent abans de començar.

Funcionament d'un microscopi òptic compost

• Configureu la il·luminació transmesa (de camp clar) des de baix i expliqueu per què s'adapta a un espècimen prim transparent i seria inútil per a un de opac.
• Canvia els objectius en ordre ascendent — 4×, després 10× i després 40× — i calcula la magnificació total que proporciona cadascun amb un ocular de 10×.
• Utilitzeu el cargol macromètric només amb el augment més baix i el micromètric amb els augments més alts, i expliqueu què passaria amb la preparació i l'objectiu si s'utilitzés el cargol macromètric a 400×.

Preparació d'una preparació humida

• Dipositareu una sola gota de suspensió cel·lular en un portaobjectes net, hi abaixareu un cobreobjectes a sobre sense atrapar bombolles d'aire i eixugareu l'excés de líquid de manera que el cobreobjectes quedi pla contra la mostra.
• Perquè la llum pugui passar a través de la mostra, aquesta ha de ser prima per permetre que els fotons la travessin sense ser absorbits o dispersos excessivament, i s'ha de banyar en un líquid (sovint amb un índex de refracció similar al del vidre) per minimitzar la refracció i la reflexió de la llum a les vores, millorant així la transparència, la claredat i el contrast de la imatge.

Ús d'un tint biològic

• Afegiu solució de Lugol a un portaobjectes duplicat i indiqueu quines estructures fa visibles i quines no.
• Compareu directament les preparacions tenyides i no tenyides, i expliqueu la diferència en termes de contrast en lloc de magnificació.

Observació i registre

• Deseu una imatge de microscopi a cada augment per a ambdues portades, i annotateu la membrana cel·lular, el citoplasma i el nucli a la vista tintejada a 400×.
• Estimeu la mida d'una cèl·lula i del seu nucli a partir del camp de visió conegut en lloc d'endevinar-ho.

Protocol

Preparació

1. Enceneu el microscopi prement l'interruptor situat a la part frontal de l'aparell. S'activarà el il·luminador, de manera que la llum transmesa travessarà la mostra des de baix, cosa que és ideal per a exemplars transparents.
2. Poseu dos portaobjectes nets a la vostra zona de treball.

Preparació de la primera diapositiva

1. Utilitza el comptagotes per col·locar suaument 1 gota d'epiteli bucal al primer portaobjectes.
2. Cobriu el portaobjectes amb un cobrallentilles.
3. Eixuga l'excés d'aigua amb paper absorbent.

Preparació de la segona diapositiva

1. Utilitza el comptagotes per col·locar suaument 1 gota d'epiteli bucal al segon portaobjectes.
2. Poseu una gota de Lugol a la segona làmina.
3. Cobriu el portaobjectes amb un cobrallàmines.
4. Eixuga l'excés d'aigua amb paper absorbent.

Observació de la primera diapositiva

1. Col·loca el portaobjectes a la platina del microscopi.
2. Feu clic al botó «Microscopi» a la tauleta per veure la imatge del microscopi.
3. Podeu desar una imatge de la vista del microscopi observada fent clic al botó «Desa la imatge«, situat a la zona inferior esquerra de la secció «Microscopi«.

Ajustament del microscopi

1. Ajusteu la magnificació tocant els objectius del microscopi. Comenceu l'observació amb una magnificació de 40x (objectiu vermell – marcat com Plan 4/0.10).
2. Preciseu l'enfocament amb els botons d'ajust gruixut situats a l'esquerra i a la dreta del microscopi. Utilitzeu els botons gruixuts només a aquest augment.
3. Incrementeu gradualment el augment de 40x a 100x (objectiu groc – etiquetat com a Plan 10/0.25), després a 400x (objectiu blau – etiquetat com a Plan 40/0.65), reenfocant cada vegada només amb el cargol micromètric. A aquests augments, el cargol macromètric pot fer xocar l'objectiu contra el portaobjectes.

Nota: Una ampliació de 1000x (objectiu de blanc – etiquetat Plan 100/1.25) requereix l'ús d'oli entre l'objectiu i la làmina de vidre. Per tant, no utilitzem aquest objectiu en aquest laboratori.

Observació de la segona diapositiva

1. Substitueix la primera diapositiva per la segona amb les cèl·lules i el lugol.
2. Observeu a un augment de 400x (objectiu blau – etiquetat com a Plan 40/0,65) per identificar el nucli d'una cèl·lula, que s'hauria de veure de color groc pel Lugol.
3. Enregistrament d'observacions: Documenteu o registreu les observacions importants.

Apagar el microscopi

1. Apagueu el microscopi prement l'interruptor a la part frontal del dispositiu.

Resultats previstos

Un conjunt d'imatges de referència de les vistes del microscopi esperades està disponible a aquest document (PDF).

Com són les cèl·lules i per què

Les cèl·lules epitelials bucals són escamoses —aplanades i en forma de placa— i, un cop despreses de la superfície del teixit, es troben lliures i sense suport al portaobjectes. Una cèl·lula animal no té paret cel·lular, només una membrana plasmàtica flexible, de manera que res no la manté en una geometria fixa: les cèl·lules s'estenen, adopten contorns poligonals arrodonits i irregulars, i sovint se superposen o es pleguen a les vores. Cadascuna és una cèl·lula gran per als estàndards animals, normalment d'uns 50–70 µm de diàmetre però de només uns pocs micròmetres de gruix, amb un sol nucli rodó d'aproximadament 8–10 µm situat a prop del centre. Val la pena assenyalar explícitament el contrast amb les cèl·lules vegetals del laboratori 025: aquestes són rectangulars, apinyades de vora a vora en una quadrícula rígida, perquè una paret de cel·lulosa determina la seva forma.

Augment, resolució i camp de visió

El augment total és el producte de l'objectiu i l'ocular. Amb l'ocular estàndard de 10×, M = M_objecte × M_ull dona 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× i 40 × 10 = 400×. Tanmateix, la magnificació només engrandeix; el que determina el detall més fi que es pot arribar a separar és l'obertura numèrica impresa després de la potència de l'objectiu. Segons el criteri d'Abbe, d = λ / (2 × ON); agafant llum verda a λ = 550 nm, l'objectiu de 0,10 resol d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, el de 0,25, 1,1 µm, i el de 0,65, 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Per tant, un nucli de 8 µm d'amplada és en principi resoluble fins i tot a 40×; és el contrast, i no pas la resolució, el que fa que continuï sent invisible a la preparació no tenyida.

El camp de visió es redueix en proporció a mesura que augmenta la potència de l'objectiu: per a una lent ocular de nombre de camp de 18 mm, el diàmetre visible és de 18 ÷ 4 = 4,5 mm a l'objectiu vermell, 1,8 mm al groc i 18 ÷ 40 = 0,45 mm —és a dir, 450 µm— al blau. Això proporciona una manera directa de mesurar una cèl·lula sense reticle: un camp de 400× d'unes 450 µm d'amplada ocupat per aproximadament set cèl·lules de vora a vora situa cada cèl·lula al voltant de les 60 µm. També explica per què primer s'ha de centrar la mostra amb un augment baix, perquè a 400× només una quatre-centesena part de l'àrea de poc augment continua a la vista.

La profunditat de camp cau fins i tot més ràpidament que l'amplada de camp, des de desenes de micròmetres a 40× fins a molt per sota d'un micròmetre a 400×. És per això que el protocol limita el cargol macromètric a l'ampliació més baixa: a 400× l'objectiu blau queda a una fracció de mil·límetre per damunt del cubreobjectes, i un moviment ràpid fa xocar vidre contra vidre, de manera que trenca la preparació i fa malbé la lent frontal.

Per què funciona la taca

La solució de Lugol és iode molecular mantingut en solució per iodur potàssic com a ió triiodur: I₂ + I⁻ → I₃⁻. L'iode té una forta absorció en el visible i s'uneix fàcilment a les proteïnes i als àcids nucleics, de manera que s'acumula allà on la cèl·lula és més densa en macromolècules. El nucli, ple d'ADN i histones, absorbeix molt més iode per unitat de volum que el citoplasma aquós que l'envolta i, per tant, sembla notablement més fosc. El mecanisme és d'afinitat química, no de magnificació, la qual cosa és la idea més transferible del laboratori: per veure una estructura primer cal trobar alguna cosa que s'hi uneixi a ella i no al seu entorn.

Resum de tasques per rang de qualificació

De 9è a 10è grau

• Enfocament — fer funcionar el microscopi amb seguretat i descriure allò que s'hi veu, amb el vocabulari de l'instrument i de la cèl·lula: objectiu, ocular, platina, cargol macromètric i micromètric, preparació humida, cobreobjectes, colorant, membrana, citoplasma, nucli.
• Activitats — prepareu les dues mostres, observeu-les a 40×, 100× i 400×, i deseu les sis imatges. Dibuixeu la vista tinyada a 400× i etiqueteu la membrana, el citoplasma i el nucli. Responeu a les preguntes orientades: què es pot veure a la mostra tinyada que no es pot veure a la no tinyada, i què hi aporta, per tant, el tint? Per què es canvien els objectius de menor a major augment i mai a l'inrevés?

11è curs

• Enfocament — quantificar l'observació i connectar l'estructura cel·lular amb la funció cel·lular.
• Activitats — calculeu la magnificació total de cada objectiu amb un ocular de 10×; utilitzeu el camp de visió (18 mm ÷ potència de l'objectiu) per estimar el diàmetre d'una cèl·lula i del seu nucli en micròmetres, i compareu els resultats amb els 50–70 µm i 8–10 µm acceptats; expliqueu la forma irregular d'aquestes cèl·lules per l'absència d'una paret cel·lular, i contrasteu-la amb les cèl·lules vegetals del laboratori 025; i identifiqueu les estructures que han d'estar presents a la cèl·lula però que no es poden veure, dient el motiu en cada cas.

12è curs / Nivell universitari

• Enfocament — l'òptica que estableix els límits de l'instrument, i la química que estableix els límits de la tinció.
• Activitats — calculeu el límit de resolució d'Abbe $d = \lambda / (2 \times \text{NA})$ per als tres objectius i indiqueu quines estructures cel·lulars podria resoldre cadascun en principi; distingiu la resolució del contrast i utilitzeu aquesta distinció per explicar per què un nucli de 8 µm continua sent invisible en el muntatge d'aigua malgrat que cada objectiu el pot resoldre; expliqueu la química de la solució de Lugol (formació de triiodur i per què el iode es concentra al nucli) i proposeu un tint que en canvi marqués un orgànul diferent, justificant-ne l'elecció; estimeu la profunditat de camp a cada ampliació i relacioneu-la amb la restricció del cargol macromètric; i dissenyeu un control que distingeixi un nucli genuïnt d'una bombolla d'aire atrapada o d'una partícula de residu.

Equipament de laboratori

Instruments

• Microscopi òptic compost amb il·luminació per llum transmesa i tres objectius (Plan 4/0.10, Plan 10/0.25, Plan 40/0.65) amb un ocular de 10× — 40×, 100× i 400× en total
• 2 portaobjectes de microscopi
• 2 cobreobjectes
• Gotes
• Pinces (per manipular cobreobjectes)
• Vas de precipitats (50 mL)
• Paper absorbent

Productes

• Cèl·lules d'epiteli bucal humà en suspensió (1 gota per portaobjectes)
• Solució de Lugol 2% (1 gota, només al segon preparat)