024 – Pozorování živočišných buněk

Složený světelný mikroskop je přístroj, který umožnil vznik buněčné biologie, a buňky vystýlající vnitřek lidské tváře představují klasický první vzorek. Bukální epitel je vrstevnatá dlaždicová tkáň: jeho nejvzdálenější buňky se neustále odlupují, takže vzorek lze odebrat bez jakéгokolivřezání, barvení nebo tvorby řezů. Cytologové tento materiál dodnes používají přesně k těmto účelům při screeningových vyšetřeních ústní rakoviny a pro bukální stěry při genetických testech, což z něj činí skutečný diagnostický vzorek spíše než výukovou pomůcku.

Živé buňky jsou ve světelném mikroskopu téměř neviditelné z jednoduchého fyzikálního důvodu: jsou tvořeny převážně vodou a jejich index lomu se téměř neliší od vody, ve které se nacházejí, takže absorbují a ohýbají jen velmi málo procházejícího světla. To, co mikroskopista za takových podmínek vidí, je slabý obrys a téměř nic jiného. Barvivo tento problém řeší tak, že se selektivně váže na některé struktury a na jiné nikoli, čímž převádí rozdíl v chemickém složení na rozdíl v barvě, který lidské oko dokáže rozpoznat. Lugolův roztok – jód rozpuštěný v jodidu draselném – je pro tuto přípravu standardní volbou: zbarví cytoplazmu do bledě žlutohnědé barvy a zvýrazní jádro jako zřetelně tmavší útvar, a to okamžitě a bez zahřívání.

V této laboratoři připravíte stejný vzorek dvakrát a oba porovnáte. První sklíčko je obyčejný mokrý preparát ve vodě; na druhé se před přiložením krycího sklíčka kapne kapka Lugolova roztoku. Zapnete prosvětlovací osvětlení, začnete při nejmenším zvětšení a postupně projdete 40×, 100× a 400×, přičemž při malém zvětšení budete zaostřovat pouze hrubým šroubem a poté jemným šroubem, a v každém kroku uložíte snímek. Porovnání obou sklíček je smyslem tohoto cvičení: ukazuje, co barvivo dělá a proč se téměř žádná mikroskopie živočišné tkáně neobejde bez barvení.

Vzdělávací cíle

Seznámení s laboratorním prostředím

• Před začátkem vyhledejte mikroskop a jeho hlavní vypínač, tři objektivy, knoflíky pro hrubé a jemné zaostření, pracovní stolek, podložní sklíčka, krycí sklíčka, kapátka a absorpční papír.

Provoz složeného světelného mikroskopu

• Nastavte prosvětlovací (jasné pole) osvětlení zdola a vysvětlete, proč se hodí pro tenký průhledný vzorek a bylo by nepoužitelné pro neprůhledný.
• Změňte objektivy v sestupném pořadí — 4×, poté 10× a 40× — a vypočítejte celkové zvětšení, které každý z nich poskytuje s 10× okulárem.
• Hububé zaostření používejte pouze při nejmenším zvětšení a jemné zaostření při vyšších a vysvětlete, co by se stalo s preparátem a objektivem, kdyby se při zvětšení 400× použil knoflík hrubého zaostření.

Příprava vlhkého preparátu

• Naneste jedinou kapku buněčné suspenze na čisté podložní sklíčko, přiložte na ni krycí sklíčko tak, abyste nevytvořili vzduchové bubliny, a odsajte přebytečnou tekutinu, aby krycí sklíčko leželo rovně na vzorku.
• Vysvětlete, proč musí být vzorek tenký a zalitý tekutinou, aby jím mohlo projít světlo.

Použití biologického barviva

• Přidejte Lugolův roztok na duplicitní podložní sklíčko a uveďte, které struktury činí viditelnými a které nikoli.
• Porovnejte přímo obarvený a neobarvený preparát a vysvětlete rozdíl z hlediska kontrastu namísto zvětšení.

Pozorování a záznam

• Uložte snímek z mikroskopu při každém zvětšení pro oba sklíčky a na 400× obarveném zobrazení popište buněčnou membránu, cytoplazmu a jádro.
• Odhadněte velikost buňky a jejího jádra ze známého zorného pole namísto tipování.

Protokol

Příprava

1. Zapněte mikroskop stisknutím spínače na přední straně přístroje. Tím zapnete osvětlení, takže procházející světlo bude procházet vzorkem zespodu, což je ideální pro průhledné vzorky.
2. Položte dva čisté podložní sklíčka na pracovní plochu.

Příprava první snímku

1. Kapátkem opatrně naneste 1 kapku bukálního epitelu na první sklíčko.
2. Přikryjte preparát krycím sklíčkem.
3. Opatrně odsajte přebytečnou vodu absorpčním papírem.

Příprava druhého snímku

1. Pomocí kapátka jemně naneste 1 kapku bukálního epitelu na druhý sklíčko.
2. Naneste kapku Lugolova roztoku na druhý držák.
3. Přikryjte preparát krycím sklíčkem.
4. Opatrně odsajte přebytečnou vodu absorpčním papírem.

Pozorování prvního snímku

1. Položte preparát na mikroskopickou stolek.
2. Klepněte na tlačítko «Mikroskop» na tabletu pro zobrazení snímku z mikroskopu.
3. Obrázek pozorovaného pohledu z mikroskopu můžete uložit kliknutím na tlačítko « Uložit obrázek «, které se nachází v levé dolní části sekce « Mikroskop «.

Nastavení mikroskopu

1. Zvětšení nastavte dotykem objektivů mikroskopu. Začněte pozorování při zvětšení 40x (červený objektiv – označený Plan 4/0.10).
2. Zaostřete pomocí hrubých zaostřovacích šroubů umístěných vlevo a vpravo na mikroskopu. Při tomto zvětšení používejte pouze hrubé šrouby.
3. Postupně zvyšujte zvětšení ze 40x na 100x (žlutý objektivem – označeným Plan 10/0.25) a poté na 400x (modrý objektivem – označeným Plan 40/0.65), přičemž pokaždé zaostřujte pouze pomocí knoflíku jemného zaostřování. Při těchto zvětšeních může hrubý posuv narazit objektiv do sklíčka.

Poznámka: Zvětšení 1000× (objektiv na bílém podstavci – označený Plan 100/1,25) vyžaduje použití oleje mezi objektivem a krycím sklíčkem. Proto tento objektiv v této laboratoři nepoužíváme.

Pozorování druhého snímku

1. Nahraďte první snímek druhým snímkem obsahujícím buňky a Lugolův roztok.
2. Pozorujte při zvětšení 400x (modrý objektiv – označený Plan 40/0.65), abyste identifikovali buněčné jádro, které by mělo být zabarveno Lugolovým roztokem do žluta.
3. Záznam pozorování: Zdokumentujte nebo zaznamenejte důležitá pozorování.

Vypínání mikroskopu

1. Vypněte mikroskop stisknutím vypínače na přední straně přístroje.

Předvídané výsledky

Sada referenčních snímků očekávaných pohledů mikroskopu je k dispozici v tento dokument (PDF).

Jak buňky vypadají a proč

Bukální epiteliální buňky jsou dlaždicové – sploštělé a destičkovité – a jelikož se odlouply z povrchu tkáně, leží na sklíčku volně a bez opory. Živočišná buňka nemá žádnou buněčnou stěnu, pouze flexibilní plazmatickou membránu, takže ji nic nedrží v pevné geometrii: buňky se rozprostírají, nabývají nepravidelně zaobleně-polygonálních obrysů a často se na okrajích překrývají nebo skládají. Na živočišné poměry jde o velké buňky, obvykle 50–70 µm široké, ale jen několik mikrometrů tlusté, s jediným kulatým jádrem o velikosti zhruba 8–10 µm, které se nachází blízko středu. Kontrast s rostlinnými buňkami z laboratoře 025 stojí za to výslovně uvést: ty jsou obdélníkové, naskládané okraj k okraji v pevné mřížce, protože jejich tvar diktuje celulózová stěna.

Zvětšení, rozlišení a zorné pole

Celkové zvětšení je součinem objektivu a okuláru. S standardním 10× okulárem je M = M_předmět × M_oko dává 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× a 40 × 10 = 400×. Zvětšení však obraz pouze zvětšuje; to, co určuje nejjemnější detail, který lze vůbec rozlišit, je numerická apertura vytištěná za hodnotou zvětšení objektivu. Podle Abbeova kritéria je d = λ / (2 × NA); vezmeme-li zelené světlo o vlnové délce λ = 550 nm, objektivem s NA 0,10 lze rozlišit d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, s NA 0,25 to je 1,1 µm a s NA 0,65 je to 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Jádro o šířce 8 µm je tedy teoreticky rozlišitelné i při 40násobném zvětšení – na neobarveném preparátu zůstává neviditelné kvůli kontrastu, nikoli kvůli rozlišení.

Zorné pole se zmenšuje úměrně tomu, jak roste výkon objektivu: pro okulár s číslem zorného pole 18 mm je viditelný průměr 18 ÷ 4 = 4,5 mm u červeného objektivu, 1,8 mm u žlutého a 18 ÷ 40 = 0,45 mm – tedy 450 µm – u modrého. To poskytuje přímý způsob, jak změřit buňku bez měřicího okénka: pole při 400násobném zvětšení široké přibližně 450 µm, které je překryto zhruba sedmi buňkami vedle sebe, dává velikost každé buňky okolo 60 µm. To také vysvětluje, proč musí být vzorek nejprve vystředěn při malém zvětšení, protože při 400násobném zvětšení je v zorném poli stále pouze asi jedna čtyřsetina plochy při malém zvětšení.

Hloubka ostrosti klesá ještě rychleji než šířka zorného pole, z desítek mikrometrů při 40× zvětšení na výrazně méně než jeden mikrometr při 400×. Proto protokol omezuje použití hrubého šroubu na nejnižší zvětšení: při 400× je modrý objektiv jen zlomek milimetru nad krycím sklíčkem a hrubý pohyb by zatlačil sklo do skla, čímž by se rozbil preparát a poškodila čelní čočka.

Proč mořidlo funguje

Lugolův roztok je molekulární jod udržovaný v roztoku jodidem draselným ve formě trijodidového iontu: I₂ + Já⁻ → Já₃⁻. Jód silně absorbuje ve viditelném spektru a snadno se váže na proteiny a nukleové kyseliny, takže se hromadí všude tam, kde je buňka nejhustší na makromolekuly. Jádro, napěchované DNA a histony, pohltí mnohem více jódu na jednotku objemu než vodnatá cytoplazma kolem něj, a proto se jeví výrazně tmavší. Mechanismus spočívá v chemické afinitě, nikoli v zvětšení, což je vůbec nejlépe přenositelná myšlenka v laboratoři: abyste viděli nějakou strukturu, musíte nejprve najít něco, co se váže na ni a ne na její okolí.

Shrnutí úkolů podle věkové kategorie

9. až 10. ročník

• Fokus — bezpečné ovládání mikroskopu a popis toho, co je vidět, s použitím odborné terminologie mikroskopu a buňky: objektiv, okulár, stolisek, makrošroub a mikrošroub, mokrý preparát, krycí sklíčko, barvivo, membrána, cytoplazma, jádro.
• Aktivity — připravte oba preparáty, každý pozorujte při zvětšení 40×, 100× a 400× a uložte šest snímků. Nakreslete obarvený pohled při zvětšení 400× a popište membránu, cytoplazmu a jádro. Odpovězte na navádějící otázky: co je vidět na obarveném preparátu, co není vidět na neobarveném, a co tedy barvivo přidává? Proč se objektivy mění od nejnižšího po nejvyšší a nikdy naopak?

11. ročník

• Fokus — kvantifikace pozorování a propojení buněčné struktury s buněčnou funkcí.
• Aktivity — vypočítejte celkové zvětšení každého objektivu s 10× okulárem; použijte zorné pole (18 mm ÷ zvětšení objektivu) k odhadu průměru buňky a jejího jádra v mikrometrech a porovnejte výsledky s akceptovanými hodnotami 50–70 µm a 8–10 µm; vysvětlete nepravidelný tvar těchto buněk absencí buněčné stěny a porovnejte jej s rostlinnými buňkami z laboratoře 025; a identifikujte struktury, které musí být v buňce přítomny, ale nelze je vidět, a v každém případě uveďte proč.

12. ročník / Úroveň college

• Fokus — optika, která určuje limity přístroje, a chemie, která určuje limity barvení.
• Aktivity — vypočítejte Abbeův limit rozlišení d = λ / (2 × NA) pro všechny tři objektivy a uveďte, jaké buněčné struktury by každý z nich mohl teoreticky rozlišit; odlište rozlišení od kontrastu a toto rozlišení použijte k vysvětlení, proč 8 µm velké jádro zůstává ve vodním preparátu neviditelné, přestože jej každý objektiv dokáže rozlišit; vysvětlete chemii Lugolova roztoku (tvorba trijodidu a proč se jod koncentruje v jádře) a navrhněte barvivo, které by místo toho označilo jinou organelu, a volbu zdůvodněte; odhadněte hloubku ostrosti při každém zvětšení a doplňte ji do souvislosti s omezením pro hrubé zaostření; a navrhněte kontrolní pokus, který by odlišil pravé jádro od zachycené vzduchové bubliny nebo úlomku detritu.

Laboratorní potřeby

Nástroje

• Složený světelný mikroskop s prosvětlovacím iluminátorem a třemi objektivy (Plan 4/0.10, Plan 10/0.25, Plan 40/0.65) s 10× okulárem – celkové zvětšení 40×, 100× a 400×
• 2 podložní sklíčka
• 2 krycí sklíčka
• Kapátka
• Pinceta (na manipulaci s krycími sklíčky)
• Kádinka (50 ml)
• Absorpční papír

Produkty

• Bukální epitelové buňky člověka v suspenzi (1 kapka na podložní sklíčko)
• Lugolův roztok 2% (1 kapka, pouze na druhém sklíčku)