024 – Observation des cellules animales

Le microscope optique composé est l'instrument qui a rendu la biologie cellulaire possible, et les cellules qui tapissent l'intérieur de la joue humaine constituent le premier spécimen classique. L'épithélium buccal est un tissu malpighien stratifié : ses cellules les plus externes se détachent continuellement, de sorte qu'un échantillon peut être prélevé sans rien couper, colorer ou couper en sections. Les cytologues utilisent encore exactement ce matériel pour le dépistage du cancer bucco-dentaire et pour les frottis buccaux dans les tests génétiques, ce qui en fait un véritable spécimen diagnostique plutôt qu'une simple commodité pédagogique.

Les cellules animales vivantes sont presque invisibles dans un microscope optique pour une raison physique simple : elles sont composées principalement d'eau et leur indice de réfraction est à peine différent de celui de l'eau dans laquelle elles baignent, de sorte qu'elles absorbent et dévient très peu la lumière transmise. Ce qu'un microscopiste voit dans ces conditions est un contour flou et guère plus. Une coloration résout le problème en se fixant sélectivement sur certaines structures et non sur d'autres, convertissant une différence de chimie en une différence de couleur que l'œil peut lire. La solution de Lugol — de l'iode dissous dans de l'iodure de potassium — est le choix standard pour cette préparation : elle teinte le cytoplasme en jaune-brun pâle et fait ressortir le noyau comme un corps nettement plus sombre, et ce, instantanément et sans chauffage.

Dans ce laboratoire, vous préparerez le même spécimen deux fois et comparerez les deux. La première lame est une préparation humide simple dans l'eau ; la deuxième reçoit une goutte de solution de Lugol avant la pose de la lamelle. Vous allumerez l'éclairage transmis, commencerez au plus faible grossissement et progresserez à travers 40×, 100× et 400×, en faisant la mise au point avec la vis macrométrique uniquement à faible puissance et la vis micrométrique par la suite, et enregistrerez une image à chaque étape. La comparaison entre les deux lames est l'objet de l'exercice : elle montre ce que fait une coloration et pourquoi presque aucune microscopie de tissu animal n'est réalisée sans elle.

Objectifs Éducatifs

Familiarisation avec l'environnement du laboratoire

• Repérez le microscope et son interrupteur, les trois objectifs, les vis macrométrique et micrométrique, la platine, les lames, les lamelles, les compte-gouttes et le papier absorbant avant de commencer.

Fonctionnement d'un microscope optique composé

• Installez un éclairage transmis (en fond clair) par le dessous et expliquez pourquoi il convient à un spécimen mince et transparent et serait inutile pour un spécimen opaque.
• Changez les objectifs par ordre croissant — 4×, puis 10×, puis 40× — et calculez le grossissement total que chacun procure avec un oculaire de 10×.
• Utilisez uniquement le réglage grossissant au plus faible grossissement et le réglage fin aux grossissements supérieurs, et expliquez ce qui arriverait à la lame et à l'objectif si la vis macrométrique était utilisée à 400×.

Préparation d'une préparation humide

• Déposez une seule goutte de suspension cellulaire sur une lame propre, abaissez une lamelle couvre-objet dessus sans emprisonner de bulles d'air, et épongez l'excès de liquide pour que la lamelle soit bien à plat contre le spécimen.
• Expliquez pourquoi l'échantillon doit être mince et inondé de liquide pour que la lumière puisse le traverser.

Utilisation d'un colorant biologique

• Ajouter de la solution de Lugol à une lame en double et indiquer quelles structures elle rend visibles et lesquelles elle ne rend pas visibles.
• Comparez directement les préparations colorées et non colorées, et attribuez cette différence au contraste plutôt qu'au grossissement.

Observation et enregistrement

• Enregistrez une image au microscope à chaque grossissement pour les deux lames, puis identifiez la membrane cellulaire, le cytoplasme et le noyau sur la vue colorée à 400×.
• Estimez la taille d'une cellule et de son noyau à partir du champ de vision connu, plutôt que de deviner.

Protocole

Préparation

1. Allumez le microscope en appuyant sur l'interrupteur situé sur le devant de l'appareil. Vous allumerez ainsi le diascope, afin que la lumière transmise traverse l'échantillon par le dessous, ce qui est idéal pour les spécimens transparents.
2. Placez deux lames propres sur votre zone de travail.

Préparation de la première diapositive

1. Utilisez la pipette pour déposer délicatement 1 goutte d'épithélium buccal sur la première lame.
2. Couvrir la lame avec une lamelle.
3. Épongez doucement l'excès d'eau avec du papier absorbant.

Préparation de la deuxième diapositive

1. Utilisez la pipette pour déposer délicatement 1 goutte d'épithélium buccal sur la deuxième lame.
2. Placez une goutte de Lugol sur la deuxième lamelle.
3. Couvrir la lame avec une lamelle.
4. Épongez doucement l'excès d'eau avec du papier absorbant.

Observation de la première diapositive

1. Placez la lame sur le platine du microscope.
2. Cliquez sur le bouton « Microscope » sur la tablette pour voir l’image du microscope.
3. Vous pouvez enregistrer une image de la vue du microscope observée en cliquant sur le bouton « Enregistrer l'image « situé dans la zone inférieure gauche de la section « Microscope «.

Réglage du microscope

1. Réglez le grossissement en touchant les objectifs du microscope. Commencez l'observation à un grossissement de 40x (objectif rouge – marqué Plan 4/0.10).
2. Réglez la mise au point à l'aide des molettes de réglage grossier situées à gauche et à droite du microscope. N'utilisez les molettes de réglage grossier qu'à ce grossissement.
3. Augmentez progressivement le grossissement de 40x à 100x (objectif jaune – portant la mention « Plan 10/0,25 »), puis à 400x (objectif bleu – portant la mention « Plan 40/0,65 »), en refaisant la mise au point à chaque fois à l'aide de la molette de réglage fin uniquement. À ces grossissements, la molette de réglage grossier risque de faire entrer l'objectif en contact avec la lame.

Note : Un grossissement de 1000x (objectif à immersion – étiqueté Plan 100/1,25) nécessite l'utilisation d'huile entre l'objectif et la lamelle. Par conséquent, nous n'utilisons pas cet objectif dans ce laboratoire.

Observation de la deuxième diapositive

1. Remplacez la première diapositive par la seconde diapositive contenant les cellules et le Lugol.
2. Observer à un grossissement de 400x (objectif bleu – marqué Plan 40/0,65) pour identifier un noyau cellulaire, qui devrait apparaître coloré en jaune par le Lugol.
3. Enregistrement des observations : Documentez ou enregistrez les observations importantes.

Éteindre le microscope

1. Éteignez le microscope en appuyant sur l'interrupteur situé à l'avant de l'appareil.

Résultats attendus

Une série d'images de référence illustrant les vues microscopiques attendues est disponible dans ce document (PDF).

À quoi ressemblent les cellules, et pourquoi ?

Les cellules épithéliales buccales sont squameuses — aplaties et en forme de plaque — et, une fois détachées de la surface du tissu, elles reposent librement et sans appui sur la lame. Une cellule animale ne possède pas de paroi cellulaire, mais uniquement une membrane plasmique souple ; rien ne lui impose donc de forme géométrique fixe : les cellules s’étalent, prennent des contours irréguliers, à la fois arrondis et polygonaux, et se chevauchent ou se plissent souvent sur les bords. Chacune d’entre elles est une grande cellule selon les normes animales, mesurant généralement entre 50 et 70 µm de diamètre mais n’ayant que quelques micromètres d’épaisseur, avec un seul noyau rond d’environ 8 à 10 µm situé près du centre. Il convient de souligner explicitement le contraste avec les cellules végétales du laboratoire 025 : celles-ci sont rectangulaires, serrées bord à bord dans une grille rigide, car leur forme est dictée par une paroi de cellulose.

Grossissement, résolution et champ de vision

Le grossissement total est le produit du grossissement de l'objectif par celui de l'oculaire. Avec l'oculaire standard 10×, M = M_obj × M_œil on obtient 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× et 40 × 10 = 400×. Le grossissement, cependant, ne fait qu’agrandir ; ce qui détermine le plus petit détail pouvant être distingué, c’est l’ouverture numérique indiquée après la puissance de l’objectif. Selon le critère d’Abbe, d = λ / (2 × NA) ; en prenant une lumière verte de λ = 550 nm, l’objectif de 0,10 résout d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, l’objectif de 0,25 à 1,1 µm, et l’objectif de 0,65 à 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Un noyau de 8 µm de large est donc en principe résolvable même à un grossissement de 40× — c’est le contraste, et non la résolution, qui le rend invisible sur la lame non colorée.

Le champ de vision diminue proportionnellement à l'augmentation de la puissance de l'objectif : pour un oculaire de nombre de champ de 18 mm, le diamètre visible est de 18 ÷ 4 = 4,5 mm avec l'objectif rouge, de 1,8 mm avec le jaune et de 18 ÷ 40 = 0,45 mm — c'est-à-dire 450 µm — avec le bleu. Cela offre un moyen direct de mesurer la taille d'une cellule sans réticule : un champ de 400× d'environ 450 µm de large traversé par environ sept cellules côte à côte situe chaque cellule autour de 60 µm. Cela explique également pourquoi l'échantillon doit d'abord être centré à faible grossissement, car à 400×, seule environ un quatre-centième de la surface à faible grossissement reste visible.

La profondeur de champ diminue encore plus rapidement que la largeur de champ, passant de quelques dizaines de micromètres à un grossissement de 40× à bien moins d’un micromètre à un grossissement de 400×. C’est pourquoi le protocole limite le réglage grossier au grossissement le plus faible : à 400×, l’objectif bleu se trouve à une fraction de millimètre au-dessus de la lamelle, et un mouvement grossier provoque un choc entre les deux surfaces en verre, ce qui fissure la lame et endommage la lentille avant.

Pourquoi la tache fonctionne

La solution de Lugol est constituée d'iode moléculaire maintenu en solution par l'iodure de potassium sous forme d'ion triiodure : I₂ + I⁻ → Je₃⁻. L'iode absorbe fortement dans le visible et se lie facilement aux protéines et aux acides nucléiques, de sorte qu'il s'accumule là où la cellule est la plus dense en macromolécules. Le noyau, rempli d'ADN et d'histones, absorbe beaucoup plus d'iode par unité de volume que le cytoplasme aqueux qui l'environne et apparaît donc nettement plus sombre. Le mécanisme relève de l'affinité chimique et non du grossissement, ce qui constitue l'idée la plus universelle en laboratoire : pour voir une structure, il faut d'abord trouver quelque chose qui s'y fixe et non à son environnement.

Résumé du devoir par tranche d'âge

Classe de 3e à la 2de

• Concentre-toi — utiliser le microscope en toute sécurité et décrire ce que l'on observe, en employant le vocabulaire propre à l'instrument et à la cellule : objectif, oculaire, platine, mise au point grossière et fine, préparation humide, lamelle, colorant, membrane, cytoplasme, noyau.
• Activités — préparer les deux lames, observer chacune à 40×, 100× et 400×, et enregistrer les six images. Dessiner la vue colorée à 400× et étiqueter la membrane, le cytoplasme et le noyau. Répondre aux questions guidées : que peut-on voir sur la lame colorée qu'on ne peut pas voir sur la lame non colorée, et qu'est-ce que la coloration apporte par conséquent ? Pourquoi change-t-on les objectifs du plus faible au plus fort et jamais dans l'autre sens ?

11e année

• Concentre-toi — quantifier les observations et établir un lien entre la structure cellulaire et la fonction cellulaire.
• Activités — calculer le grossissement total de chaque objectif avec un oculaire 10× ; utiliser le champ de vision (18 mm ÷ puissance de l’objectif) pour estimer le diamètre d’une cellule et de son noyau en micromètres, puis comparer les résultats aux valeurs admises de 50 à 70 µm et de 8 à 10 µm ; expliquer la forme irrégulière de ces cellules par l’absence de paroi cellulaire, et la comparer à celle des cellules végétales du laboratoire 025 ; et identifier les structures qui doivent être présentes dans la cellule mais qui ne sont pas visibles, en expliquant pourquoi dans chaque cas.

12e année / Niveau universitaire

• Concentre-toi — l'optique, qui détermine les limites de l'instrument, et la chimie, qui détermine les limites du colorant.
• Activités — calculez la limite de résolution d'Abbe $d = \lambda / (2 \times \text{NA})$ pour les trois objectifs et indiquez quelles structures cellulaires chacun pourrait en principe résoudre ; distinguez la résolution du contraste et utilisez cette distinction pour expliquer pourquoi un noyau de 8 µm reste invisible dans la préparation humide dans l'eau bien que chaque objectif puisse le résoudre ; expliquez la chimie de la solution de Lugol (formation de triiodure et pourquoi l'iode se concentre dans le noyau) et proposez un colorant qui marquerait à la place un organite différent, en justifiant ce choix ; estimez la profondeur de champ à chaque grossissement et reliez-la à la restriction de la mise au point grossière ; et concevez un témoin qui permettrait de distinguer un véritable noyau d'une bulle d'air piégée ou d'une particule de débris.

Essentiels de laboratoire

Instruments

• Microscope optique composé équipé d'un éclairage par transmission et de trois objectifs (Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65) avec un oculaire 10× — grossissements totaux : 40×, 100× et 400×
• 2 lames de microscope
• 2 lamelles
• Gouttes
• Pince à épiler (pour manipuler les lamelles)
• Bécher (50 mL)
• Papier absorbant

Produits

• Cellules de l'épithélium buccal humain en suspension (1 goutte par lame)
• Solution de Lugol 2% (1 goutte, sur la deuxième lame uniquement)