024 – Beobachtung von tierischen Zellen

Das lichtmikroskopische Verbundmikroskop ist das Instrument, das die Zellbiologie ermöglicht hat, und die Zellen, die das Innere der menschlichen Wange auskleiden, sind das klassische erste Präparat. Das bukkale Epithel ist ein geschichtetes Plattenepithel: seine äußersten Zellen werden kontinuierlich abgestoßen, sodass eine Probe entnommen werden kann, ohne etwas zu schneiden, zu färben oder zu mikrotomieren. Zytologen verwenden genau dieses Material nach wie vor für das Mundkrebs-Screening und für Wangenabstriche bei Gentests, was es zu einem echten diagnostischen Präparat und nicht nur zu einer didaktischen Hilfsgröße macht.

Lebende tierische Zellen sind in einem Lichtmikroskop aus einem einfachen physikalischen Grund nahezu unsichtbar: Sie bestehen größtenteils aus Wasser, und ihr Brechungsindex unterscheidet sich kaum von dem Wasser, in dem sie sich befinden, sodass sie das durchfallende Licht kaum absorbieren und brechen. Was ein Mikroskopist unter diesen Bedingungen sieht, ist ein schwacher Umriss und sonst fast nichts. Ein Farbstoff löst dieses Problem, indem er sich selektiv an einige Strukturen und an andere nicht bindet und so einen chemischen Unterschied in einen Farbunterschied umwandelt, den das Auge erkennen kann. Lugolsche Lösung – Iod in Kaliumiodid gelöst – ist die Standardwahl für diese Präparation: Sie färbt das Zytoplasma hell gelb-braun und hebt den Zellkern als deutlich dunkleren Körper hervor, und das geschieht sofort und ohne Erhitzen.

In diesem Labor werden Sie dasselbe Präparat zweimal anfertigen und die beiden vergleichen. Das erste Objektträgerpräparat ist ein einfacher Nativpräparat in Wasser; das zweite erhält einen Tropfen Lugolscher Lösung, bevor das Deckglas aufgelegt wird. Sie schalten die Durchlichtbeleuchtung ein, beginnen mit der niedrigsten Vergrößerung und arbeiten sich über 40×, 100× und 400× hoch, wobei Sie bei kleiner Vergrößerung nur mit dem Grobtrieb und danach mit dem Feintrieb fokussieren, und speichern bei jedem Schritt ein Bild ab. Der Vergleich zwischen den beiden Objektträgern ist der Sinn der Übung: Er zeigt, was eine Färbung bewirkt und warum fast keine Mikroskopie von tierischem Gewebe ohne eine solche durchgeführt wird.

Bildungsziele

Einarbeitung in die Laborumgebung

• Suchen Sie das Mikroskop und seinen Netzschalter, die drei Objektive, den Grob- und Feinfokussknauf, den Objekttisch, die Objektträger, die Deckgläschen, die Pipetten und das Saugpapier, bevor Sie beginnen.

Bedienung eines Lichtmikroskops

• Stellen Sie eine Durchlichtbeleuchtung (Hellfeld) von unten ein und erklären Sie, warum sie für eine dünne, transparente Probe geeignet und für eine undurchsichtige unbrauchbar ist.
• Wechseln Sie die Objektive in aufsteigender Reihenfolge – 4×, dann 10×, dann 40× – und berechnen Sie die jeweilige Gesamtvergrößerung mit einem 10× Okular.
• Verwenden Sie den Grobtrieb nur bei der niedrigsten Vergrößerung und den Feintrieb bei höheren, und erklären Sie, was mit dem Objektträger und dem Objektiv passieren würde, wenn der Grobtrieb bei 400-facher Vergrößerung verwendet würde.

Herstellung eines Nativpräparats

• Geben Sie einen einzelnen Tropfen Zellsuspension auf einen sauberen Objektträger, legen Sie ein Deckglas darauf, ohne Luftblasen einzuschließen, und tupfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab, sodass das Deckglas flach auf der Probe aufliegt.
• Erklären Sie, warum die Probe dünn und mit Flüssigkeit benetzt sein muss, damit Licht durch sie hindurchtreten kann.

Verwendung eines biologischen Färbemittels

• Geben Sie Lugols Lösung auf einen zweiten Objektträger und geben Sie an, welche Strukturen dadurch sichtbar werden und welche nicht.
• Vergleichen Sie die gefärbten und ungefärbten Präparate direkt und erklären Sie den Unterschied hinsichtlich des Kontrasts anstelle der Vergrößerung.

Beobachtung und Aufzeichnung

• Speichern Sie bei beiden Objektträgern ein Mikroskopiebild für jede Vergrößerung und annotieren Sie die Zellmembran, das Zytoplasma sowie den Zellkern in der 400× gefärbten Ansicht.
• Schätzen Sie die Größe einer Zelle und ihres Zellkerns anhand des bekannten Sichtfelds ab, anstatt zu raten.

Protokoll

Vorbereitung

1. Schalten Sie das Mikroskop ein, indem Sie den Schalter an der Vorderseite des Geräts betätigen. Sie schalten den Auflichtein, sodass das durchscheinende Licht von unten durch die Probe fällt, was ideal für transparente Präparate ist.
2. Legen Sie zwei saubere Objektträger auf Ihre Arbeitsfläche.

Vorbereitung der ersten Folie

1. Verwenden Sie die Pipette, um vorsichtig 1 Tropfen Wangenschleimhaut auf das erste Objektträger zu geben.
2. Bedecken Sie den Objektträger mit einem Deckgläschen.
3. Tupfen Sie überschüssiges Wasser vorsichtig mit saugfähigem Papier ab.

Vorbereitung der zweiten Folie

1. Verwenden Sie die Pipette, um vorsichtig 1 Tropfen Mundschleimhaut auf das zweite Objektträger zu geben.
2. Geben Sie einen Tropfen Lugol auf das zweite Deckglas.
3. Bedecken Sie den Objektträger mit einem Deckgläschen.
4. Tupfen Sie überschüssiges Wasser vorsichtig mit saugfähigem Papier ab.

Beobachtung der ersten Folie

1. Legen Sie das Präparat auf den Objektträgertisch des Mikroskops.
2. Klicken Sie auf dem Tablet auf die Schaltfläche «Mikroskop», um das Mikroskopbild anzuzeigen.
3. Sie können ein Bild der beobachteten Mikroskopansicht speichern, indem Sie auf die Schaltfläche «Bild speichern« im linken unteren Bereich des Abschnitts «Mikroskop« klicken.

Mikroskopeinstellung

1. Verstellen Sie die Vergrößerung durch Berühren der Mikroskopobjektive. Beginnen Sie die Beobachtung mit einer Vergrößerung von 40 x (rotes Objektiv – Beschriftung Plan 4/0,10).
2. Stellen Sie die Schärfe mit den Grobverstellknöpfen links und rechts am Mikroskop ein. Verwenden Sie bei dieser Vergrößerung ausschließlich die Grobverstellknöpfe.
3. Erhöhen Sie die Vergrößerung schrittweise von 40-fach auf 100-fach (gelbes Objektiv – mit der Bezeichnung „Plan 10/0,25“) und anschließend auf 400-fach (blaues Objektiv – mit der Bezeichnung „Plan 40/0,65“), wobei Sie jedes Mal ausschließlich mit dem Feineinstellknopf nachfokussieren. Bei diesen Vergrößerungen kann der Grobverstellknopf das Objektiv gegen den Objektträger drücken.

Hinweis: Eine Vergrößerung von 1000x (Objektiv weiß – beschriftet mit Plan 100/1.25) erfordert die Verwendung von Öl zwischen Objektiv und Deckglas. Dieses Objektiv wird daher in diesem Labor nicht verwendet.

Beobachtung der zweiten Folie

1. Ersetzen Sie die erste Folie durch die zweite Folie mit den Zellen und Lugol.
2. Beobachten Sie bei einer Vergrößerung von 400x (blaue Objektivlinse – Plan 40/0,65) eine Zellkern, der durch den Lugol-Test gelb gefärbt sein sollte.
3. Beobachtungen aufzeichnen: Wichtige Beobachtungen dokumentieren oder festhalten.

Mikroskop ausschalten

1. Schalten Sie das Mikroskop aus, indem Sie den Schalter an der Vorderseite des Geräts betätigen.

Erwartete Ergebnisse

Ein Satz von Referenzbildern der erwarteten Mikroskopansichten ist verfügbar in dieses Dokument (PDF).

Wie die Zellen aussehen und warum

Die Epithelzellen der Mundschleimhaut sind Plattenepithelzellen – abgeflacht und plattenförmig – und liegen, nachdem sie sich von der Gewebeoberfläche abgelöst haben, lose und ohne Halt auf dem Objektträger. Eine tierische Zelle hat keine Zellwand, sondern nur eine flexible Plasmamembran, sodass nichts sie in einer festen Form hält: Die Zellen breiten sich aus, nehmen unregelmäßige, rund-polygonale Umrisse an und überlappen sich oft oder falten sich an den Rändern. Jede einzelne ist nach tierischen Maßstäben eine große Zelle, typischerweise 50–70 µm im Durchmesser, aber nur wenige Mikrometer dick, mit einem einzigen runden Zellkern von etwa 8–10 µm, der nahe der Mitte sitzt. Der Kontrast zu den Pflanzenzellen aus Labor 025 ist ausdrücklich hervorzuheben: Diese sind rechteckig und liegen Kante an Kante in einem starren Raster, da eine Zellulosewand ihre Form vorgibt.

Vergrößerung, Auflösung und Sichtfeld

Die Gesamtvergrößerung ergibt sich aus dem Produkt von Objektiv und Okular. Bei Verwendung des Standardokulars 10× gilt: M = M_obj × M_Auge ergibt 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× und 40 × 10 = 400×. Die Vergrößerung bewirkt jedoch lediglich eine Vergrößerung; ausschlaggebend für das feinste Detail, das überhaupt noch aufgelöst werden kann, ist die numerische Apertur, die hinter der Vergrößerungsstärke des Objektivs angegeben ist. Nach dem Abbe-Kriterium gilt: d = λ / (2 × NA); bei grünem Licht mit λ = 550 nm löst das 0,10-Objektiv d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm auf, das 0,25-Objektiv 1,1 µm und das 0,65-Objektiv 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Ein 8 µm breiter Zellkern ist daher prinzipiell sogar bei 40-facher Vergrößerung auflösbar – es ist der Kontrast, nicht die Auflösung, der ihn auf dem ungefärbten Objektträger unsichtbar macht.

Das Sichtfeld verkleinert sich proportional zur Zunahme der Objektivstärke: Bei einem Okular mit einer Feldzahl von 18 mm beträgt der sichtbare Durchmesser beim roten Objektiv 18 ÷ 4 = 4,5 mm, 1,8 mm beim gelben Objektiv und 18 ÷ 40 = 0,45 mm – also 450 µm – beim blauen Objektiv. Dies bietet eine direkte Möglichkeit, die Größe einer Zelle ohne Fadenkreuz zu bestimmen: Ein 400×-Sichtfeld mit einer Breite von etwa 450 µm, das von etwa sieben Zellen von Rand zu Rand überspannt wird, ergibt für jede Zelle eine Größe von etwa 60 µm. Dies erklärt auch, warum die Probe zunächst bei geringer Vergrößerung zentriert werden muss, da bei 400× nur noch etwa ein Vierhundertstel des Bereichs bei geringer Vergrößerung im Sichtfeld liegt.

Die Schärfentiefe nimmt noch schneller ab als die Bildbreite – von einigen zehn Mikrometern bei 40-facher Vergrößerung auf deutlich unter einen Mikrometer bei 400-facher Vergrößerung. Aus diesem Grund beschränkt das Protokoll die Grobverstellung auf die niedrigste Vergrößerung: Bei 400-facher Vergrößerung befindet sich das blaue Objektiv nur einen Bruchteil eines Millimeters über dem Deckglas, und eine Grobverstellung führt dazu, dass Glas auf Glas trifft, wodurch der Objektträger zerbricht und die Frontlinse beschädigt wird.

Warum der Farbstoff wirkt

Die Lugol-Lösung besteht aus molekularem Jod, das durch Kaliumjodid in Form des Triodid-Ions in Lösung gehalten wird: I₂ + I⁻ → I₃⁻. Jod absorbiert stark im sichtbaren Licht und bindet sich leicht an Proteine und Nukleinsäuren, sodass es sich dort anreichert, wo die Zelle die höchste Dichte an Makromolekülen aufweist. Der Zellkern, der mit DNA und Histonen gefüllt ist, nimmt pro Volumeneinheit weitaus mehr Jod auf als das ihn umgebende wässrige Zytoplasma und erscheint daher deutlich dunkler. Der Mechanismus beruht auf chemischer Affinität und nicht auf Vergrößerung – dies ist der wichtigste Grundsatz, der sich im Labor am besten übertragen lässt: Um eine Struktur zu erkennen, muss man zunächst etwas finden, das an sie bindet und nicht an ihre Umgebung.

Zusammenfassung der Aufgaben nach Klassenstufen

9. bis 10. Klasse

• Fokus — den sicheren Umgang mit dem Mikroskop und die Beschreibung des Gesehenen unter Verwendung der Fachbegriffe für das Gerät und die Zelle: Objektiv, Okular, Objekttisch, Grob- und Feinfokussierung, Nasspräparat, Deckgläschen, Färbung, Membran, Zytoplasma, Zellkern.
• Aktivitäten — Bereiten Sie beide Objektträger vor, betrachten Sie jeden bei 40-facher, 100-facher und 400-facher Vergrößerung und speichern Sie die sechs Bilder. Zeichnen Sie die gefärbte Ansicht bei 400-facher Vergrößerung nach und beschriften Sie die Membran, das Zytoplasma und den Zellkern. Beantworten Sie die Leitfragen: Was können Sie auf dem gefärbten Objektträger erkennen, das auf dem ungefärbten nicht zu sehen ist, und welchen Mehrwert bietet die Färbung somit? Warum werden die Objektive vom kleinsten zum größten Vergrößerungsfaktor gewechselt und niemals umgekehrt?

11. Klasse

• Fokus — die Beobachtung zu quantifizieren und einen Zusammenhang zwischen Zellstruktur und Zellfunktion herzustellen.
• Aktivitäten — Berechnen Sie die Gesamtvergrößerung jedes Objektivs bei Verwendung eines 10×-Okulars; nutze das Sichtfeld (18 mm ÷ Objektivstärke), um den Durchmesser einer Zelle und ihres Zellkerns in Mikrometern zu schätzen, und vergleiche die Ergebnisse mit den anerkannten Werten von 50–70 µm bzw. 8–10 µm; erkläre die unregelmäßige Form dieser Zellen durch das Fehlen einer Zellwand und stelle sie den Pflanzenzellen aus Laborübung 025 gegenüber; und identifiziere die Strukturen, die in der Zelle vorhanden sein müssen, aber nicht sichtbar sind, und begründe dies jeweils.

12. Klasse / College-Niveau

• Fokus — die Optik, die die Grenzen des Geräts bestimmt, und die Chemie, die die Grenzen des Farbstoffs bestimmt.
• Aktivitäten — Berechnen Sie die Abbe-Auflösungsgrenze d = λ / (2 × NA) für alle drei Objektive und geben Sie an, welche Zellstrukturen jedes davon prinzipiell auflösen könnte; unterscheiden Sie zwischen Auflösung und Kontrast und nutzen Sie diese Unterscheidung, um zu erklären, warum ein 8 µm großer Zellkern auf dem Wassergel-Objektträger unsichtbar bleibt, obwohl jedes Objektiv ihn auflösen kann; Erläutern Sie die chemischen Grundlagen der Lugol-Lösung (Bildung von Triiodid und warum sich Jod im Zellkern anreichert) und schlagen Sie einen Farbstoff vor, der stattdessen eine andere Organelle markieren würde, wobei Sie die Wahl begründen; schätzen Sie die Schärfentiefe bei jeder Vergrößerung und setzen Sie diese in Beziehung zur Einschränkung durch die Grobfokussierung; und entwerfen Sie ein Kontrollverfahren, mit dem sich ein echter Zellkern von einer eingeschlossenen Luftblase oder einem Partikel unterscheiden lässt.

Labor-Grundausstattung

Instrumente

• Durchlicht-Mikroskop mit Durchlichtbeleuchtung und drei Objektiven (Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65) mit einem 10× Okular – 40×, 100× und 400× gesamt
• 2 Mikroskopie-Objektträger
• 2 Deckgläser
• Tropfer
• Pinzette (zum Handhaben von Deckgläschen)
• Becherglas (50 mL)
• Saugpapier

Produkte

• Menschliche buccale Epithelzellen in Suspension (1 Tropfen pro Objektträger)
• Lugol-Lösung 2% (1 Tropfen, nur auf dem zweiten Objektträger)