024 – Observación de células animales

El microscopio óptico compuesto es el instrumento que hizo posible la biología celular, y las células que recubren el interior de la mejilla humana son la primera muestra clásica. El epitelio bucal es un tejido plano estratificado: sus células más externas se desprenden continuamente, por lo que se puede recolectar una muestra sin cortar, teñir ni hacer cortes histológicos de nada. Los citólogos todavía utilizan exactamente este material para la detección del cáncer oral y para los hisopados bucales en pruebas genéticas, lo que lo convierte en una muestra diagnóstica real en lugar de una simple conveniencia didáctica.

Las células animales vivas son casi invisibles en un microscopio óptico por una simple razón física: son mayoritariamente agua y su índice de refracción apenas difiere del agua en la que se encuentran, por lo que absorben y desvían muy poca luz transmitida. Lo que un microscopista ve en esas condiciones es un contorno tenue y poco más. Un colorante resuelve el problema al unirse selectivamente a unas estructuras y no a otras, convirtiendo una diferencia de química en una diferencia de color que el ojo puede leer. La solución de Lugol —yodo disuelto en yoduro de potasio— es la opción estándar para esta preparación: tiñe el citoplasma de un color amarillo-marrón pálido y destaca el núcleo como un cuerpo claramente más oscuro, y lo hace al instante y sin calentar.

En este laboratorio preparará la misma muestra dos veces y comparará ambas. La primera preparación es un montaje húmedo simple en agua; la segunda recibe una gota de solución de Lugol antes de colocar el cubreobjetos. Encenderá el iluminador de campo claro, comenzará con el aumento más bajo y avanzará a través de 40×, 100× y 400×, enfocando con el tornillo macrométrico solo en el objetivo de menor aumento y con el micrométrico de ahí en adelante, y guardará una imagen en cada paso. La comparación entre las dos preparaciones es el objetivo del ejercicio: muestra lo que hace una tinción y por qué casi no se realiza microscopía de tejido animal sin ella.

Objetivos Educativos

Familiarización con el entorno del laboratorio

• Localice el microscopio y su interruptor de encendido, los tres objetivos, los mandos de enfoque macrométrico y micrométrico, la platina, los portaobjetos, los cubreobjetos, los goteros y el papel absorbente antes de comenzar.

Funcionamiento de un microscopio compuesto de luz

• Configure la iluminación transmitida (de campo claro) desde abajo y explique por qué es adecuada para una muestra delgada y transparente y sería inútil para una opaca.
• Cambie los objetivos en orden ascendente (4×, luego 10× y después 40×) y calcule la magnificación total que proporciona cada uno con un ocular de 10×.
• Utilice el enfoque macroscópico únicamente con el aumento más bajo y el enfoque microscópico con los más altos, y explique qué le sucedería a la preparación y al objetivo si se utilizara el botón macroscópico a 400×.

Preparación de un montaje húmedo

• Deposita una sola gota de suspensión celular en un portaobjetos limpio, coloca un cubreobjetos sobre ella sin atrapar burbujas de aire y absorbe el exceso de líquido para que el cubreobjetos quede plano sobre la muestra.
• Explique por qué el espécimen debe ser delgado y estar inundado de líquido para que la luz pueda pasar a través de él.

Uso de un colorante biológico

• Añade solución de Lugol a una placa duplicada e indica qué estructuras hace visibles y cuáles no.
• Compare directamente las preparaciones teñidas y sin teñir, y explique la diferencia en términos de contraste en lugar de magnificación.

Observación y registro

• Guarde una imagen de microscopio a cada aumento para ambas placas y anote la membrana celular, el citoplasma y el núcleo en la vista teñida a 400×.
• Estime el tamaño de una célula y de su núcleo a partir del campo de visión conocido en lugar de adivinar.

Protocolo

Preparación

1. Enciende el microscopio pulsando el interruptor en la parte frontal del dispositivo. Encenderás el iluminador, de modo que la luz transmitida pase a través de la muestra desde abajo, lo que es ideal para especímenes transparentes.
2. Coloque dos portaobjetos limpios sobre su área de trabajo.

Preparación de la primera diapositiva

1. Use el gotero para colocar suavemente 1 gota de epitelio bucal en el primer portaobjetos.
2. Cubre la portaobjetos con un cubreobjetos.
3. Seque suavemente el exceso de agua con papel absorbente.

Preparación de la segunda diapositiva

1. Usa el gotero para colocar suavemente 1 gota de epitelio bucal en el segundo portaobjetos.
2. Pon una gota de Lugol en el segundo portaobjetos.
3. Cubre la diapositiva con el cubreobjetos.
4. Seque suavemente el exceso de agua con papel absorbente.

Observación de la primera diapositiva

1. Coloca la lámina en la platina del microscopio.
2. Haz clic en el botón «Microscopio» en la tableta para ver la imagen del microscopio.
3. Puede guardar una imagen de la vista observada del microscopio haciendo clic en el botón «Guardar imagen« ubicado en el área inferior izquierda de la sección «Microscopio«.

Ajuste del microscopio

1. Ajuste el aumento tocando los objetivos del microscopio. Comience la observación con un aumento de 40x (objetivo rojo - etiquetado Plan 4/0.10).
2. Ajuste el enfoque con los mandos de ajuste grueso situados a la izquierda y a la derecha del microscopio. Utilice los mandos de ajuste grueso únicamente con este aumento.
3. Aumente gradualmente el aumento de 40x a 100x (objetivo amarillo – etiquetado como Plan 10/0.25), luego a 400x (objetivo azul – etiquetado como Plan 40/0.65), reenfocando cada vez únicamente con el botón de enfoque fino. A estos aumentos, el botón macrométrico puede hacer que el objetivo golpee la placa portaobjetos.

Nota: Una magnificación de 1000x (objetivo de inmersión en aceite – etiquetado Plan 100/1.25) requiere el uso de aceite entre el objetivo y el cubreobjetos. Por lo tanto, no utilizamos este objetivo en este laboratorio.

Observación de la segunda diapositiva

1. Reemplace la primera diapositiva con la segunda diapositiva que contiene las células y Lugol.
2. Observe a un aumento de 400x (objetivo azul – marcado como Plan 40/0.65) para identificar el núcleo de una célula, el cual debería aparecer de color amarillo por el Lugol.
3. Registrando observaciones: Documenta o registra las observaciones importantes.

Apagar el microscopio

1. Apague el microscopio presionando el interruptor en la parte frontal del dispositivo.

Resultados esperados

En [...], se puede consultar un conjunto de imágenes de referencia con las vistas esperadas al microscopio. este documento (PDF).

Cómo son las células y por qué

Las células epiteliales bucales son escamosas —aplanadas y en forma de placa— y, al haberse desprendido de la superficie del tejido, se encuentran sueltas y sin soporte en el portaobjetos. Una célula animal no tiene pared celular, solo una membrana plasmática flexible, por lo que nada la mantiene en una geometría fija: las células se extienden, adquieren contornos poligonales redondeados e irregulares, y a menudo se superponen o se pliegan en los bordes. Cada una es una célula grande para los estándares animales, típicamente de 50 a 70 µm de ancho pero de solo unas pocas micrómetras de espesor, con un único núcleo redondo de aproximadamente 8 a 10 µm situado cerca del centro. Vale la pena establecer explícitamente el contraste con las células vegetales del laboratorio 025: estas son rectangulares, empaquetadas borde con borde en una cuadrícula rígida, porque una pared de celulosa dicta su forma.

Aumento, resolución y campo de visión

La ampliación total es el producto del objetivo y el ocular. Con el ocular estándar de 10×, M = M_objeto × M_ojo da 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× y 40 × 10 = 400×. Sin embargo, la magnificación solo agranda; lo que determina el detalle más fino que puede separarse es la apertura numérica impresa después de la potencia del objetivo. Según el criterio de Abbe, d = λ / (2 × AN); tomando luz verde a λ = 550 nm, el objetivo de 0,10 resuelve d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, el de 0,25 resuelve 1,1 µm y el de 0,65 resuelve 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Por lo tanto, un núcleo de 8 µm de ancho es en principio resoluble incluso a 40×; es el contraste, y no la resolución, lo que lo mantiene invisible en la preparación sin teñir.

El campo visual se reduce en proporción al aumento de la potencia del objetivo: para un ocular con un número de campo de 18 mm, el diámetro visible es 18 ÷ 4 = 4,5 mm en el objetivo rojo, 1,8 mm en el amarillo y 18 ÷ 40 = 0,45 mm —es decir, 450 µm— en el azul. Esto proporciona una manera directa de medir una célula sin necesidad de una retícula: un campo de 400× de aproximadamente 450 µm de ancho abarcado por unas siete células de borde a borde sitúa a cada célula cerca de las 60 µm. También explica por qué la muestra debe centrarse primero con poco aumento, ya que a 400× solo una cuatrocientas parte de la superficie de poco aumento sigue a la vista.

La profundidad de campo disminuye aún más rápido que la anchura del campo, pasando de decenas de micrómetros a 40× a bastante menos de un micrómetro a 400×. Es por eso que el protocolo restringe el uso del tornillo macrométrico a la menor magnificación: a 400× el objetivo azul se encuentra a una fracción de milímetro por encima del cubreobjetos, y un movimiento macrométrico empuja vidrio contra vidrio, rompiendo la preparación y dañando la lente frontal.

Por qué funciona la mancha

La solución de Lugol es yodo molecular mantenido en solución por yoduro de potasio como ion triyoduro: I₂ + I⁻ → Yo₃⁻. El yodo absorbe fuertemente en el visible y se une fácilmente a proteínas y ácidos nucleicos, por lo que se acumula donde la célula es más densa en macromoléculas. El núcleo, repleto de ADN e histonas, absorbe mucho más yodo por unidad de volumen que el citoplasma acuoso que lo rodea y, por lo tanto, aparece notablemente más oscuro. El mecanismo es la afinidad química, no la magnificación, que es la idea más transferible en el laboratorio: para ver una estructura primero hay que encontrar algo que se una a ella y no a su entorno.

Resumen de la asignación por rango de calificación

Grados 9–10

• Enfoque — operar el microscopio de forma segura y describir lo que se ve, utilizando el vocabulario del instrumento y de la célula: objetivo, ocular, platina, tornillo macrométrico y micrométrico, preparación húmeda, cubreobjetos, tinción, membrana, citoplasma, núcleo.
• Actividades — prepara ambas preparaciones, obsérvalas cada una a 40×, 100× y 400×, y guarda las seis imágenes. Dibuja la vista teñida a 400× y etiqueta la membrana, el citoplasma y el núcleo. Responde a las preguntas guiadas: ¿qué se puede ver en la preparación teñida que no se puede ver en la no teñida, y qué aporta por tanto la tinción? ¿Por qué se cambia de objetivos del más bajo al más alto y nunca al revés?

Undécimo grado

• Enfoque — cuantificar la observación y conectar la estructura celular con la función celular.
• Actividades — calcula la aumento total de cada objetivo con un ocular de 10×; utiliza el campo de visión (18 mm ÷ potencia del objetivo) para estimar el diámetro de una célula y de su núcleo en micrómetros, y compara los resultados con los valores aceptados de 50–70 µm y 8–10 µm; explica la forma irregular de estas células por la ausencia de una pared celular, y contrástala con las células vegetales del laboratorio 025; e identifica las estructuras que deben estar presentes en la célula pero que no se pueden ver, diciendo por qué en cada caso.

12.º curso / Nivel universitario

• Enfoque — la óptica que establece los límites del instrumento y la química que establece los límites de la tinción.
• Actividades — calcula el límite de resolución de Abbe d = λ / (2 × NA) para los tres objetivos e indica qué estructuras celulares podría en principio resolver; distingue resolución de contraste, y utiliza dicha distinción para explicar por qué un núcleo de 8 µm permanece invisible en la preparación húmeda a pesar de que cada objetivo puede resolverlo; explica la química de la solución de Lugol (formación de triyoduro y por qué el yodo se concentra en el núcleo) y proponga una tinción que en su lugar marque un orgánulo diferente, justificando la elección; estima la profundidad de campo a cada magnificación y relacionala con la restricción del enfoque macrométrico; y diseña un control que distinga un núcleo genuino de una burbuja de aire atrapada o una partícula de residuo.

Esenciales de laboratorio

Instrumentos

• Microscopio óptico compuesto con iluminador transmitido y tres objetivos (Plan 4/0.10, Plan 10/0.25, Plan 40/0.65) con un ocular de 10×; 40×, 100× y 400× en total
• 2 portaobjetos de microscopio
• 2 cubreobjetos
• Goteros
• Pinzas (para manipular cubreobjetos)
• Vaso de precipitados (50 mL)
• Papel absorbente

Productos

• Células del epitelio bucal humano en suspensión (1 gota por portaobjetos)
• Solución de Lugol 2% (1 gota, solo en el segundo portaobjetos)