024 – Observarea celulelor animale

Microscopul optic compus este instrumentul care a făcut posibilă biologia celulară, iar celulele care căptușesc interiorul obrazului uman reprezintă clasicul primul specimen. Epiteliul bucal este un țesut scuamos stratificat: celulele sale exterioare sunt eliminate continuu, astfel încât o probă poate fi recoltată fără a tăia, colora sau secționa nimic. Citologii folosesc în continuare exact acest material pentru screeningul cancerului oral și pentru frotiurile bucale în testele genetice, ceea ce îl face un specimen de diagnostic real, mai degrabă decât o comoditate didactică.

Celulele animale vii sunt aproape invizibile la un microscop optic dintr-un motiv fizic simplu: sunt alcătuite în mare parte din apă, iar indicele lor de refracție abia diferă de cel al apei în care se află, așa că absorb și refractă foarte puțin din lumina transmisă. Ceea ce vede un microscopist în aceste condiții este un contur slab și puțin altceva. Un colorant rezolvă problema legându-se selectiv de unele structuri și nu de altele, transformând o diferență de chimie într-o diferență de culoare pe care ochiul o poate citi. Soluția Lugol — iod dizolvat în iodură de potasiu — este alegerea standard pentru această preparare: colorează citoplasma într-un galben-maroniu pal și evidențiază nucleul ca pe un corp în mod distinct mai întunecat, și face acest lucru instantaneu și fără încălzire.

În acest laborator veți pregăti aceeași probă de două ori și le veți compara pe cele două. Prima lamă este o preparare umedă simplă în apă; a doua primește o picătură de soluție Lugol înainte de a se așeza lameleța. Veți porni iluminatorul cu lumină transmisă, veți începe de la cea mai mică mărire și veți avansa prin 40×, 100× și 400×, focalizând cu șurubul macrometric doar la mărire mică și cu cel micrometric în continuare, și veți salva câte o imagine la fiecare pas. Comparația dintre cele două lame reprezintă scopul exercițiului: arată ce face o colorație și de aproape nicio microscopie a țesutului animal nu se face fără ea.

Obiective educaționale

Familiarizarea cu mediul de laborator

• Localizați microscopul și comutatorul său de alimentare, cele trei obiective, butoanele de focalizare macrometrică și micrometrică, măsuța, lamele, lamelele acoperitoare, pipetele și hârtia absorbantă înainte de a începe.

Funcționarea unui microscop optic compus

• Configurați iluminarea prin transmisie (câmp luminos) de dedus și explicați de ce este potrivită pentru o probă subțire, transparentă și ar fi inutilă pentru una opacă.
• Schimbați obiectivele în ordine crescătoare — 4×, apoi 10×, apoi 40× — și calculați mărirea totală pe care o oferă fiecare cu un ocular de 10×.
• Folosiți focalizarea macroscopică doar la cea mai mică mărire și focalizarea microscopică la cele mai mari, și explicați ce s-ar întâmpla cu lama și obiectivul dacă butonul macro s-ar folosi la 400×.

Pregătirea unei preparate native

• Depuneți o singură picătură de suspensie celulară pe o lamă curată, coborâți o lamelă de sticlă deasupra acesteia fără a prinde bule de aer și tamponați excesul de lichid, astfel încât lamela să stea plat pe specimen.
• Explicați de ce specimenul trebuie să fie subțire și inundat cu lichid pentru ca lumina să treacă prin el.

Utilizarea unui colorant biologic

• Adăugați soluție Lugol la o lamă duplicat și specificați ce structuri face vizibile și pe care nu le face vizibile.
• Comparați direct preparatele colorate și necolorate și explicați diferența în termeni de contrast, nu de mărire.

Observare și înregistrare

• Salvați o imagine la microscop la fiecare mărire pentru ambele lame, și adnotați membrana celulară, citoplasma și nucleul pe imaginea colorată la mărire de 400×.
• Estimați dimensiunea unei celule și a nucleului acesteia pornind de la câmpul vizual cunoscut, în loc să ghiciți.

Protocol

Pregătire

1. Porniți microscopul apăsând butonul de pe partea frontală a aparatului. Veți porni iluminatorul, astfel încât lumina transmisă să treacă prin eșantion de dedesubt, ceea ce este ideal pentru probe transparente.
2. Așezați două lame curate pe suprafața de lucru.

Pregătirea primului slide

1. Folosește pipeta pentru a plasa cu grijă 1 picătură de epiteliu bucal pe prima lamă.
2. Acoperiți lamela cu o lameliță de protecție.
3. Ștergeți ușor excesul de apă cu un șervețel absorbant.

Pregătirea celui de-al doilea diapozitiv

1. Folosiți picurătorul pentru a plasa ușor 1 picătură de epiteliu bucal pe al doilea lamă.
2. Pune o picătură de Lugol pe obiectul al doilea.
3. Acoperiți lamela cu un capac.
4. Ștergeți ușor excesul de apă cu un șervețel absorbant.

Observarea primului diapozitiv

1. Așezați lama pe platina microscopului.
2. Apăsați butonul «Microscop» de pe tabletă pentru a vizualiza imaginea microscopului.
3. Puteți salva o imagine a vederii microscopice observate făcând clic pe butonul « Salvare imagine « aflat în zona din stânga jos a secțiunii « Microscop «.

Ajustarea microscopului

1. Reglați mărirea atingând obiectivele microscopului. Începeți observația la o mărire de 40x (obiectiv roșu – marcat Plan 4/0.10).
2. Reglați focalizarea cu ajutorul butoanelor de reglare grosieră situate în partea stângă și dreaptă a microscopului. Utilizați butoanele de reglare grosieră numai la această mărire.
3. Măriți treptat mărirea de la 40x la 100x (obiectiv galben – marcat Plan 10/0,25), apoi la 400x (obiectiv albastru – marcat Plan 40/0,65), refocalizând de fiecare dată numai cu ajutorul butonului de reglare fină. La aceste măriri, butonul de reglare grosieră poate împinge obiectivul în lamelă.

Notă: O mărire de 1000x (obiectiv alb – etichetat Plan 100/1.25) necesită utilizarea uleiului între obiectiv și lamela de protecție. Prin urmare, nu folosim acest obiectiv în acest laborator.

Observația celui de-al doilea diapozitiv

1. Înlocuiți primul diapozitiv cu al doilea diapozitiv care conține celulele și Lugol.
2. Observați la o mărire de 400x (obiectiv albastru – etichetat Plan 40/0.65) pentru a identifica un nucleu celular, care ar trebui să apară colorat în galben de către iodul Lugol.
3. Înregistrarea observațiilor: Documentați sau înregistrați observațiile importante.

Oprirea microscopului

1. Opriți microscopul apăsând comutatorul din fața aparatului.

Rezultate anticipate

Un set de imagini de referință cu aspectele așteptate la microscop este disponibil în acest document (PDF).

Cum arată celulele și de ce

Celulele epiteliale bucale sunt scumoase — aplatizate și asemănătoare unor plăci — și, fiind descuamate de pe suprafața țesutului, ele se află libere și nesusținute pe lamă. O celulă animală nu are perete celular, ci doar o membrană plasmatică flexibilă, așa că nimic nu o menține într-o geometrie fixă: celulele se întind, capătă contururi neregulate, rotunjite-poligonale și adesea se suprapun sau se pliază la margini. Fiecare este o celulă mare după standardele animale, având de obicei o dimensiune de 50–70 µm în diametru, dar o grosime de doar câțiva micrometri, cu un singur nucleu rotund de aproximativ 8–10 µm situat aproape în centru. Contrastul cu celulele vegetale din laboratorul 025 merită subliniat în mod explicit: acelea sunt dreptunghiulare, înghesuite margine la margine într-o rețea rigidă, deoarece un perete de celuloză le dictează forma.

Mărire, rezoluție și câmp vizual

Magnificarea totală este produsul dintre obiectiv și ocular. Cu ocularul standard de 10×, M = M_obiect × M_ochi oferă 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× și 40 × 10 = 400×. Mărirea, totuși, doar mărește; ceea ce stabilește cel mai fin detaliu care poate fi separat este deschiderea numerică tipărită după puterea obiectivului. Conform criteriului lui Abbe, d = λ / (2 × NA); luând lumină verde la λ = 550 nm, obiectivul de 0,10 separă d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, cel de 0,25 — 1,1 µm, iar cel de 0,65 — 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Prin urmare, un nucleu cu lățimea de 8 µm poate fi, în principiu, separat chiar și la 40× — contrastul, nu rezoluția, este cel care îl menține invizibil pe lama necolorată.

Câmpul vizual se micșorează proporțional cu creșterea puterii obiectivului: pentru un ocular cu un număr de câmp de 18 mm, diametrul vizibil este 18 ÷ 4 = 4,5 mm la obiectivul roșu, 1,8 mm la cel galben și 18 ÷ 40 = 0,45 mm — adică 450 µm — la cel albastru. Aceasta oferă o modalitate directă de a dimensiona o celulă fără un reticul: un câmp de 400× lat de aproximativ 450 µm acoperit de aproximativ șapte celule de la o margine la alta plasează fiecare celulă în jur de 60 µm. De asemenea, explică de ce specimenul trebuie centrat mai întâi la putere mică, deoarece la 400× doar aproximativ o a patru-suta parte din aria de putere mică mai este în câmpul vizual.

Profunzimea câmpului scade even mai repede decât lățimea câmpului, de la zeci de micrometri la 40× până la mult sub un micrometru la 400×. De aceea, protocolul restricționează butonul macrometric la cea mai mică mărire: la 400×, obiectivul albastru se află la o fracțiune de milimetru deasupra lamelei acoperitoare, iar o mișcare macrometrică împinge sticla în sticlă, spărgând lama și deteriorând lentila frontală.

De ce funcționează pata

Soluția Lugol este iod molecular menținut în soluție de iodură de potasiu sub formă de ion triiodură: I₂ + I⁻ → I₃⁻. Iodul absoarbe puternic în domeniul vizibil și se leagă ușor de proteine și de acizi nucleici, astfel încât se acumulează acolo unde celula este cea mai densă în macromolecule. Nucleul, plin de ADN și histone, absoarbe mult mai mult iod per unitate de volum decât citoplasma apoasă din jur și, prin urmare, pare vizibil mai întunecat. Mecanismul este o afinitate chimică, nu o mărire, ceea ce reprezintă cea mai transferabilă idee din laborator: pentru a vedea o structură, trebuie mai întâi să găsești ceva care se leagă de ea și nu de mediul înconjurător.

Rezumatul temei pe intervale de note

Clasele a IX-a și a X-a

• Focus — operarea în siguranță a microscopului și descrierea a ceea ce se vede, folosind vocabularul instrumentului și al celulei: obiectiv, ocular, măsuță, șurub macrometric și micrometric, preparat umed, lamelă acoperitoare, colorant, membrană, citoplasmă, nucleu.
• Activități — pregătiți ambele lamele, observați-o pe fiecare la 40×, 100× și 400× și salvați cele șase imagini. Desenați vederea colorată la 400× și etichetați membrana, citoplasma și nucleul. Răspundeți la întrebările ghidate: ce puteți vedea pe lamela colorată care nu se poate vedea pe cea necolorată și ce adaugă, așadar, colorantul? De ce obiectivele sunt schimbate de la cel mai mic la cel mai mare și niciodată invers?

Clasa a XI-a

• Focus — cuantificarea observației și conectarea structurii celulare cu funcția celulară.
• Activități — calculați mărirea totală a fiecărui obiectiv cu un ocular de 10×; utilizați câmpul vizual (18 mm ÷ puterea obiectivului) pentru a estima diametrul unei celule și al nucleului acesteia în micrometri și comparați rezultatele cu valorile acceptate de 50–70 µm și 8–10 µm; explicați forma neregulată a acestor celule prin absența unui perete celular și contrastați-o cu celulele vegetale din laboratorul 025; și identificați structurile care trebuie să fie prezente în celulă, dar care nu pot fi văzute, explicând de ce în fiecare caz.

Clasa a XII-a / Nivel universitar

• Focus — optica care stabilește limitele instrumentului și chimia care stabilește limitele colorantului.
• Activități — calculează limita de rezoluție Abbe $d = \lambda / (2 \times \text{NA})$ pentru toate cele trei obiective și menționează ce structuri celulare ar putea rezolva în principiu fiecare dintre ele; distinge rezoluția de contrast și folosește această distincție pentru a explica de ce un nucleu de 8 µm rămâne invizibil pe preparatul în apă, deși fiecare obiectiv îl poate rezolva; explică chimia soluției Lugol (formarea triiodurii și motivul pentru care iodul se concentrează în nucleu) și propune un colorant care ar marca în schimb un alt organel, justificând alegerea; estimează adâncimea de câmp la fiecare mărire și corelează-o cu restricția focalizării grobiere; și concepe un control care ar distinge un nucleu autentic de o bulă de aer prinsă sau o particulă de resturi.

Esențiale de laborator

Instrumente

• Microscop optic compus cu iluminator pentru lumină transmisă și trei obiective (Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65) cu ocular de 10× — total 40×, 100× și 400×
• 2 lame de microscop
• 2 lamele acoperitoare
• Picurători
• Pensetă (pentru manipularea lamelelor de acoperire)
• Pahar de laborator (50 ml)
• Hârtie absorbantă

Produse

• Celule epiteliale bucale umane în suspensie (1 picătură pe lamă)
• Soluția lui Lugol 2% (1 picătură, numai pe a doua lamă)