024 – Observación de células animales

El microscopio óptico compuesto es el instrumento que hizo posible la biología celular, y las células que revisten el interior de la mejilla humana son la primera muestra clásica. El epitelio bucal es un tejido plano estratificado: sus células más externas se desprenden continuamente, por lo que se puede recolectar una muestra sin cortar, teñir ni hacer cortes histológicos de nada. Los citólogos todavía utilizan exactamente este material para la detección del cáncer oral y para los hisopados bucales en pruebas genéticas, lo que lo convierte en una muestra diagnóstica real en lugar de una simple conveniencia didáctica.

Las células animales vivas son casi invisibles en un microscopio óptico por una simple razón física: son principalmente agua y su índice de refracción es apenas diferente del agua en la que se encuentran, por lo que absorben y desvían muy poca luz transmitida. Lo que un microscopista ve en esas condiciones es un contorno tenue y poco más. Un colorante resuelve el problema al unirse selectivamente a algunas estructuras y no a otras, convirtiendo una diferencia de química en una diferencia de color que el ojo puede leer. La solución de Lugol —yodo disuelto en yoduro de potasio— es la opción estándar para esta preparación: tiñe el citoplasma de un color pardo amarillento pálido y destaca el núcleo como un cuerpo claramente más oscuro, y lo hace al instante y sin calentar.

En este laboratorio preparará la misma muestra dos veces y comparará ambas. La primera laminilla es una preparación húmeda simple en agua; la segunda recibe una gota de solución de Lugol antes de colocar el cubreobjetos. Encenderá el iluminador transmitido, comenzará con el aumento más bajo y avanzará a través de 40×, 100× y 400×, enfocando con el tornillo macrométrico solo en el poder bajo y con el micrométrico de ahí en adelante, y guardará una imagen en cada paso. La comparación entre las dos laminillas es el objetivo del ejercicio: muestra lo que hace una tinción y por qué casi no se realiza microscopía de tejido animal sin una.

Metas educativas

Familiarización con el entorno de laboratorio

• Localice el microscopio y su interruptor de encendido, los tres objetivos, los tornillos macrométrico y micrométrico, la platina, las laminillas portaobjetos, los cubreobjetos, los goteros y el papel absorbente antes de empezar.

Funcionamiento de un microscopio compuesto de luz

• Configure la iluminación transmitida (de campo claro) desde abajo y explique por qué es adecuada para una muestra delgada y transparente, y por qué no serviría para una opaca.
• Cambie los objetivos en orden ascendente — 4×, luego 10× y después 40× — y calcule la magnificación total que proporciona cada uno con un ocular de 10×.
• Use el enfoque grueso únicamente con el aumento más bajo y el enfoque fino con los aumentos más altos, y explique qué le sucedería a la placa portaobjetos y al objetivo si se usara la perilla de enfoque grueso a 400×.

Preparación de un montaje húmedo

• Deposite una sola gota de suspensión celular en un portaobjetos limpio, coloque encima un cubreobjetos sin que se formen burbujas de aire y absorba el exceso de líquido para que el cubreobjetos quede plano sobre la muestra.
• Explique por qué el espécimen debe ser delgado y estar inundado de líquido para que la luz pueda atravesarlo.

Uso de un colorante biológico

• Agregue solución de Lugol a una placa portaobjetos duplicada e indique qué estructuras hace visibles y cuáles no.
• Compare directamente las preparaciones teñidas y sin teñir, y explique la diferencia en términos de contraste en lugar de magnificación.

Observación y registro

• Guarde una imagen del microscopio a cada aumento para ambas laminillas, y anote la membrana celular, el citoplasma y el núcleo en la vista teñida a 400×.
• Estime el tamaño de una célula y de su núcleo a partir del campo de visión conocido en lugar de adivinar.

Protocolo

Preparación

1. Encienda el microscopio presionando el interruptor en la parte frontal del dispositivo. Encenderá el iluminador para que la luz transmitida atraviese la muestra desde abajo, lo cual es ideal para especímenes transparentes.
2. Coloque dos portaobjetos limpios en su área de trabajo.

Preparación de la primera diapositiva

1. Usa el gotero para colocar suavemente 1 gota de epitelio bucal en el primer portaobjetos.
2. Cubre el portaobjetos con un cubreobjetos.
3. Seque con cuidado el exceso de agua con papel absorbente.

Preparación de la segunda diapositiva

1. Use el gotero para colocar suavemente 1 gota de epitelio bucal en el segundo portaobjetos.
2. Coloca una gota de Lugol en el segundo portaobjetos.
3. Cubre la laminilla con un cubreobjetos.
4. Seque con cuidado el exceso de agua con papel absorbente.

Observación de la primera diapositiva

1. Coloca la laminilla en la platina del microscopio.
2. Haga clic en el botón «Microscopio» de la tableta para ver la imagen del microscopio.
3. Puede guardar una imagen de la vista observada del microscopio haciendo clic en el botón «Guardar imagen« ubicado en la esquina inferior izquierda de la sección «Microscopio«.

Ajuste del microscopio

1. Ajuste el aumento tocando los objetivos del microscopio. Comience la observación con un aumento de 40x (objetivo rojo, etiquetado como Plan 4/0.10).
2. Ajuste el enfoque con las perillas de enfoque macro ubicado a la izquierda y a la derecha del microscopio. Use las perillas macro únicamente a este aumento.
3. Aumente gradualmente el aumento de 40x a 100x (objetivo amarillo, marcado como Plan 10/0.25) y luego a 400x (objetivo azul, marcado como Plan 40/0.65), reenfocando cada vez únicamente con el tornillo micrométrico. A estos aumentos, el tornillo macrométrico puede hacer que el objetivo choque contra la laminilla.

Nota: Un aumento de 1000x (objetivo blanco – etiquetado como Plan 100/1.25) requiere el uso de aceite entre el objetivo y el cubreobjetos. Por lo tanto, no utilizamos este objetivo en este laboratorio.

Observación de la segunda diapositiva

1. Reemplace la primera diapositiva con la segunda diapositiva que contiene las células y el Lugol.
2. Observe con un aumento de 400x (objetivo azul, etiquetado como Plan 40/0.65) para identificar el núcleo celular, el cual debe verse teñido de amarillo por el lugol.
3. Registro de observaciones: Documente o registre las observaciones importantes.

Apagando el microscopio

1. Apague el microscopio presionando el interruptor en la parte frontal del dispositivo.

Resultados esperados

Un conjunto de imágenes de referencia de las vistas esperadas del microscopio está disponible en este documento (PDF).

Cómo se ven las células y por qué

Las células epiteliales bucales son escamosas —aplanadas y en forma de placa— y, al haberse desprendido de la superficie del tejido, se encuentran sueltas y sin soporte en el portaobjetos. Una célula animal no tiene pared celular, solo una membrana plasmática flexible, por lo que nada la mantiene en una geometría fija: las células se extienden, adquieren contornos poligonales redondeados e irregulares, y a menudo se superponen o se pliegan en los bordes. Cada una es una célula grande para los estándares animales, típicamente de 50 a 70 µm de ancho pero de solo unas pocas micrómetras de espesor, con un único núcleo redondo de aproximadamente 8 a 10 µm ubicado cerca del centro. Vale la pena señalar explícitamente el contraste con las células vegetales del laboratorio 025: estas son rectangulares, empaquetadas borde con borde en una cuadrícula rígida, porque una pared de celulosa dicta su forma.

Amplificación, resolución y campo de visión

El aumento total es el producto del objetivo y el ocular. Con el ocular estándar de 10×, M = M_objeto × M_ojo da 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× y 40 × 10 = 400×. La magnificación, sin embargo, solo agranda; lo que determina el detalle más fino que se puede separar en absoluto es la apertura numérica impresa después de la potencia del objetivo. Según el criterio de Abbe, d = λ / (2 × AN); tomando luz verde a λ = 550 nm, el objetivo de 0,10 resuelve d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, el de 0,25 resuelve 1,1 µm, y el de 0,65 resuelve 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Por lo tanto, un núcleo de 8 µm de ancho es en principio resoluble incluso a 40×; es el contraste, no la resolución, lo que lo mantiene invisible en la laminilla sin teñir.

El campo de visión se reduce en proporción al aumento de la potencia del objetivo: para un ocular con un número de campo de 18 mm, el diámetro visible es de 18 ÷ 4 = 4.5 mm con el objetivo rojo, 1.8 mm con el amarillo y 18 ÷ 40 = 0.45 mm —es decir, 450 µm— con el azul. Esto ofrece una manera directa de medir una célula sin una retícula: un campo de 400× de unas 450 µm de ancho abarcado por aproximadamente siete células de borde a borde sitúa a cada célula cerca de las 60 µm. También explica por qué la muestra debe centrarse primero con baja potencia, ya que a 400× solo alrededor de una cuatrocientas ava parte del área de baja potencia sigue estando a la vista.

La profundidad de campo disminuye aún más rápido que el ancho de campo, desde decenas de micrómetros a 40× hasta mucho menos de un micrómetro a 400×. Es por eso que el protocolo restringe el tornillo macrométrico a la menor magnificación: a 400× el objetivo azul se encuentra a una fracción de milímetro por encima del cubreobjetos, y un movimiento grueso impulsa vidrio contra vidrio, agrietando la laminilla y dañando la lente frontal.

Por qué funciona la mancha

La solución de Lugol es yodo molecular mantenido en solución mediante yoduro de potasio como ion triyoduro: I₂ + Yo⁻ → I₃⁻. El yodo absorbe fuertemente en el visible y se une fácilmente a las proteínas y a los ácidos nucleicos, por lo que se acumula donde la célula es más densa en macromoléculas. El núcleo, repleto de ADN e histona, absorbe mucho más yodo por unidad de volumen que el citoplasma acuoso que lo rodea y, por lo tanto, aparece notablemente más oscuro. El mecanismo es afinidad química, no aumento, que es la idea más transferible en el laboratorio: para ver una estructura primero hay que encontrar algo que se una a ella y no a su entorno.

Resumen de tareas por rango de calificaciones

Grado 9-10

• Enfoque — operar el microscopio de forma segura y describir lo que se ve, utilizando el vocabulario del instrumento y de la célula: objetivo, ocular, platina, tornillo macrométrico y micrométrico, preparación húmeda, cubreobjetos, colorante, membrana, citoplasma, núcleo.
• Actividades — prepare ambas laminillas, observe cada una a 40×, 100× y 400×, y guarde las seis imágenes. Dibuje la vista teñida a 400× y señale la membrana, el citoplasma y el núcleo. Responda las preguntas guiadas: ¿qué se puede ver en la laminilla teñida que no se puede ver en la sin teñir, y qué aporta entonces la tinción? ¿Por qué los objetivos se cambian del más bajo al más alto y nunca al revés?

Undécimo grado

• Enfoque — cuantificar la observación y conectar la estructura celular con la función celular.
• Actividades — calcule la magnificación total de cada objetivo con un ocular de 10×; use el campo de visión (18 mm ÷ potencia del objetivo) para estimar el diámetro de una célula y de su núcleo en micrómetros, y compare los resultados con los aceptados de 50–70 µm y 8–10 µm; explique la forma irregular de estas células por la ausencia de una pared celular, y contrástela con las células vegetales del laboratorio 025; e identifique las estructuras que deben estar presentes en la célula pero que no se pueden ver, diciendo el porqué en cada caso.

12.º grado / Nivel universitario

• Enfoque — la óptica que fija los límites del instrumento, y la química que fija los límites de la tinción.
• Actividades — calcula el límite de resolución de Abbe $d = \lambda / (2 \times \text{NA})$ para los tres objetivos y menciona qué estructuras celulares podría en principio resolver cada uno; distingue resolución de contraste y utiliza esa distinción para explicar por qué un núcleo de 8 µm permanece invisible en la preparación húmeda en agua a pesar de que cada objetivo puede resolverlo; explica la química de la solución de Lugol (formación de triyoduro y por qué el yodo se concentra en el núcleo) y propone una tinción que en su lugar marque un orgánulo diferente, justificando la elección; estima la profundidad de campo en cada aumento y relaciónala con la restricción del enfoque macrométrico; y diseña un control que distinga un núcleo genuino de una burbuja de aire atrapada o una partícula de residuo.

Elementos esenciales para el laboratorio

Instrumentos

• Microscopio óptico compuesto con iluminador transmitido y tres objetivos (Plan 4/0.10, Plan 10/0.25, Plan 40/0.65) con un ocular de 10× — 40×, 100× y 400× en total
• 2 portaobjetos de microscopio
• 2 cubreobjetos
• Goteros
• Pinzas (para manipular cubreobjetos)
• Vaso de precipitados (50 mL)
• Papel absorbente

Productos

• Células de epitelio bucal humano en suspensión (1 gota por portaobjetos)
• Solución de Lugol 2% (1 gota, solo en el segundo portaobjetos)