024 – Obserwacja komórek zwierzęcych

Złożony mikroskop świetlny jest przyrządem, który umożliwił rozwój biologii komórki, a komórki wyściełające od wewnątrz ludzki policzek stanowią klasyczny pierwszy preparat. Nabłonek policzka to tkanka wielowarstwowa płaska: jego najbardziej zewnętrznie położone komórki są stale złuszczane, dzięki czemu próbkę można pobrać bez jakiegokolwiek nacinania, barwienia czy skrawania. Cytolodzy nadal używają dokładnie tego materiału do przesiewowych badań w kierunku raka jamy ustnej oraz wymazów z policzka w testach genetycznych, co czyni go prawdziwym okazem diagnostycznym, a nie tylko pomocniczym materiałem dydaktycznym.

Żywe komórki zwierzęce są prawie niewidoczne w mikroskopie świetlnym z prostego powodu fizycznego: składają się głównie z wody, a ich współczynnik załamania światła prawie nie różni się od wody, w której się znajdują, dlatego absorbują i załamują bardzo mało przechodzącego światła. To, co mikroskopista widzi w takich warunkach, to słaby zarys i niewiele więcej. Barwnik rozwiązuje ten problem, wiążąc się selektywnie z jednymi strukturami, a z innymi nie, co przekształca różnicę w chemii w różnicę kolorów, którą oko może odczytać. Płyn Lugola – jod rozpuszczony w jodku potasu – jest standardowym wyborem do tego przygotowania: zabarwia cytoplazmę na bladożółto-brązowy kolor i wyróżnia jądro komórkowe jako wyraźnie ciemniejszy element, robiąc to natychmiast i bez ogrzewania.

W tym laboratorium przygotujesz tę samą próbkę dwukrotnie i porównasz je ze sobą. Pierwsze szkiełek to zwykły preparat przyżyciowy w kropli wody; na drugie, przed nałożeniem szkiełka nakrywkowego, nanosi się kroplę płynu Lugola. Włączysz oświetlacze światła przechodzącego, zaczynając od najmniejszego powiększenia i przechodząc kolejno przez 40×, 100× oraz 400×, ustawiając ostrość za pomocą śruby zgrubnej tylko przy małym powiększeniu, a następnie śruby dokładnej, oraz zapiszesz obraz na każdym etapie. Porównanie obu preparatów jest celem tego ćwiczenia: pokazuje ono, co daje barwienie i dlaczego niemal żadna mikroskopia tkanki zwierzęcej nie odbywa się bez jego użycia.

Cele edukacyjne

Zapoznanie się ze środowiskiem laboratoryjnym

• Przed rozpoczęciem zlokalizuj mikroskop i jego włącznik zasilania, trzy obiektywy, pokrętła zgrubnego i dokładnego ostrości, stolik, szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe, kroplomierze oraz bibułę wchłaniającą.

Działanie złożonego mikroskopu świetlnego

• Skonfiguruj oświetlenie przechodnie (jasnego pola) od dołu i wyjaśnij, dlaczego jest ono odpowiednie dla cienkiego, przezroczystego preparatu i byłoby bezużyteczne w przypadku nieprzezroczystego.
• Zmień obiektywy w porządku rosnącym — najpierw 4×, potem 10×, a następnie 40× — i oblicz całkowite powiększenie, jakie daje każdy z nich z okularem 10×.
• Używaj obróbki zgrubnej tylko przy najmniejszym powiększeniu, a dokładnej przy większych, i wyjaśnij, co stałoby się z preparatem i obiektywem, gdyby pokrętła zgrubnego użyto przy powiększeniu 400×.

Przygotowanie preparatu mokrego

• Nanieś jedną kroplę zawiesiny komórek na czyste szkiełko podstawowe, opuść na nią szkiełko nakrywkowe, nie dopuszczając do uwięzienia pęcherzyków powietrza, i odsącz nadmiar płynu, aby szkiełko nakrywkowe spoczywało płasko na preparacie.
• Wyjaśnij, dlaczego próbnika musi być cienka i zalana płynem, aby światło mogło przez nią przejść.

Użycie barwnika biologicznego

• Dodaj płyn Lugola do drugiego szkiełka i określ, które struktury czyni on widocznymi, a których nie.
• Porównaj bezpośrednio preparat barwiony i niebarwiony i wyjaśnij różnicę za pomocą kontrastu zamiast powiększenia.

Obserwacja i rejestracja

• Zapisz obraz mikroskopowy przy każdym powiększeniu dla obu preparatów i oznacz błonę komórkową, cytoplazmę oraz jądro komórkowe na obrazie wybarwionym w powiększeniu 400×.
• Oszacuj wielkość komórki i jej jądra komórkowego na podstawie znanego pola widzenia, zamiast zgadywać.

Protokół

Przygotowanie

1. Włącz mikroskop, naciskając przełącznik z przodu urządzenia. Włączysz w ten sposób iluminator, przez co światło przechodzące od dołu przez preparat, co jest idealne dla przezroczystych okazów.
2. Połóż dwa czyste szkiełka na swoim stanowisku pracy.

Przygotowanie pierwszego slajdu

1. Użyj pipety, aby delikatnie umieścić 1 kroplę nabłonka policzkowego na pierwszym szkiełku.
2. Przykryj szkiełko nakrywkowe.
3. Delikatnie osusz nadmiar wody papierem chłonnym.

Przygotowanie drugiej zjeżdżalni

1. Użyj pipety, aby delikatnie umieścić 1 kroplę nabłonka policzkowego na drugiej szkiełku.
2. Nałóż kroplę płynu Lugola na drugi preparat mikroskopowy.
3. Przykryj preparat szkiełkiem nakrywkowym.
4. Delikatnie osusz nadmiar wody papierem chłonnym.

Obserwacja pierwszego slajdu

1. Umieść preparat na stoliku mikroskopu.
2. Kliknij przycisk «Mikroskop» na tablecie, aby wyświetlić obraz z mikroskopu.
3. Obraz obserwowanego widoku mikroskopowego można zapisać, klikając przycisk « Zapisz obraz «, znajdujący się w lewym dolnym rogu sekcji « Mikroskop «.

Regulacja mikroskopu

1. Dostosuj powiększenie, dotykając obiektywów mikroskopu. Rozpocznij obserwację z powiększeniem 40x (czerwony obiektyw – oznaczony Plan 4/0.10).
2. Dostokuj ostrość za pomocą pokręteł zgrubnego ogniskowania znajdujących się po lewej i prawej stronie mikroskopu. Przy tym powiększeniu używaj wyłącznie pokręteł zgrubnych.
3. Stopniowo zwiększaj powiększenie z 40x do 100x (żółty obiektyw – oznaczony jako Plan 10/0.25), a następnie do 400x (niebieski obiektyw – oznaczony jako Plan 40/0.65), za każdym razem ostawiając obraz wyłącznie za pomocą pokrętła mikro. Przy tych powiększeniach pokrętło makro może spowodować uderzenie obiektywu w preparat.

Uwaga: Powiększenie 1000x (obiektyw biały – oznaczony jako Plan 100/1,25) wymaga zastosowania oleju między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym. Z tego powodu nie używamy tego obiektywu w naszym laboratorium.

Obserwacja drugiej zjeżdżalni

1. Zastąp pierwszy slajd drugim slajdem zawierającym komórki i Lugola.
2. Obserwuj pod powiększeniem 400x (obiektyw niebieski – oznaczony Plan 40/0,65) w celu zidentyfikowania jądra komórkowego, które powinno być zabarwione na żółto przez płyn Lugola.
3. Rejestrowanie obserwacji: Dokumentuj lub zapisuj ważne obserwacje.

Wyłączanie mikroskopu

1. Wyłącz mikroskop, naciskając przełącznik z przodu urządzenia.

Przewidywane wyniki

Zestaw obrazów referencyjnych oczekiwanych widoków mikroskopowych jest dostępny w ten dokument (PDF).

Jak wyglądają komórki i dlaczego

Komórki nabłonka policzka są płaskonabłonkowe – spłaszczone i płytkowate – a złuszczone z powierzchni tkanki leżą luźno i bez oparcia na szkiełku. Komórka zwierzęca nie ma ściany komórkowej, a jedynie elastyczną błonę plazmatyczną, więc nic nie utrzymuje jej w stałej geometrii: komórki rozprzestrzeniają się, przyjmują nieregularne, zaokrąglono-wielokątne zarysy i często nakładają się na siebie lub zwijają na brzegach. Każda z nich jest dużą komórką jak na standardy zwierzęce, zazwyczaj o wymiarach 50–70 µm w poprzek, ale o grubości zaledwie kilku mikrometrów, z pojedynczym okrągłym jądrem o średnicy około 8–10 µm znajdującym się w pobliżu środka. Warto wyraźnie zaznaczyć kontrast z komórkami roślinnymi z laboratorium 025: są one prostokątne, ułożone ściśle obok siebie w sztywnej siatce, ponieważ o ich kształcie decyduje ściana celulozowa.

Powiększenie, rozdzielczość i pole widzenia

Całkowite powiększenie jest iloczynem obiektywu i okularu. Przy standardowym okularze 10×, M = M_obj. × M_oko daje 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× oraz 40 × 10 = 400×. Powiększenie jednakże jedynie powiększa; to, co wyznacza najdrobniejszy szczegół, jaki w ogóle można rozróżnić, to aperture numeryczna nadrukowana za krotnością obiektywu. Zgodnie z kryterium Abbe, d = λ / (2 × NA); biorąc zielone światło o λ = 550 nm, obiektyw 0,10 rozróżnia d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, obiektyw 0,25 – 1,1 µm, a obiektyw 0,65 – 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Jądro komórkowe o szerokości 8 µm jest więc w zasadzie rozróżnialne nawet przy powiększeniu 40× – to kontrast, a nie zdolność rozdzielcza, sprawia, że pozostaje ono niewidoczne na niebarwionym preparacie.

Pole widzenia maleje proporcjonalnie do wzrostu mocy obiektywu: dla okularu o liczbie pola 18 mm widoczna średnica wynosi 18 ÷ 4 = 4,5 mm przy obiektywie czerwonym, 1,8 mm przy żółtym oraz 18 ÷ 40 = 0,45 mm — czyli 450 µm — przy niebieskim. Daje to bezpośredni sposób na określenie rozmiaru komórki bez użycia siatki pomiarowej: pole o powiększeniu 400× szerokie na około 450 µm, zajęte przez z grubsza siedem stykających się brzegami komórek, daje wielkość każdej z nich bliską 60 µm. Wyjaśnia to również, dlaczego preparat należy najpierw wycentrować przy małym powiększeniu, ponieważ przy powiększeniu 400× w polu widzenia pozostaje tylko około jedna czterysetna powierzchni z małego powiększenia.

Głębia ostrości spada jeszcze szybciej niż szerokość pola widzenia – od dziesiątek mikrometrów przy powiększeniu 40× do znacznie poniżej jednego mikrometra przy 400×. Z tego powodu protokół ogranicza użycie śruby zgrubnego ruchu do najniższego powiększenia: przy 400× niebieski obiektyw znajduje się ułamek milimetra nad szkiełkiem nakrywkowym, a ruch zgrubny powoduje zderzenie szkła ze szkłem, co prowadzi do pęknięcia preparatu i uszkodzenia przedniej soczewki.

Dlaczego bejca działa

Płyn Lugola to jod cząsteczkowy utrzymywany w roztworze przez jodek potasu w postaci jonu trójjodkowego: I₂ + I^– → Ja₃^–. Jod silnie pochłania światło w zakresie widzialnym i łatwo wiąże się z białkami oraz kwasami nukleinowymi, dzięki czemu gromadzi się wszędzie tam, gdzie komórka jest najgęstsza pod względem makrocząsteczek. Jądro komórkowe, wypełnione DNA i histonami, pochłania znacznie więcej jodu na jednostkę objętości niż otaczająca je wodnista cytoplazma, przez co wydaje się wyraźnie ciemniejsze. Mechanizm ten opiera się na powinnowactwie chemicznym, a nie na powiększeniu, co stanowi najbardziej uniwersalną ideę w laboratorium: aby zobaczyć strukturę, trzeba najpierw znaleźć coś, co wiąże się z nią, a nie z jej otoczeniem.

Podsumowanie zadania według zakresu ocen

Klasy 9–10

• Skupienie — bezpieczna obsługa mikroskopu i opisywanie tego, co widać, z użyciem terminologii dotyczącej przyrządu i komórki: obiektyw, okular, stolik, śruba z zgrubnym i dokładnym nastawieniem, preparat przyżyciowy, nakrywka, barwnik, błona, cytoplazma, jądro.
• Aktywności — przygotuj oba preparaty, obejrzyj każdy z nich w powiększeniu 40×, 100× i 400× oraz zapisz sześć obrazów. Narysuj barwiony obraz w powiększeniu 400× i oznacz błonę, cytoplazmę oraz jądro komórkowe. Odpowiedz na pytania pomocnicze: co widać na preparacie barwionym, czego nie widać na niebarwionym, i co w związku z tym wnosi barwienie? Dlaczego obiektywy zmienia się od najmniejszego do największego, a nigdy odwrotnie?

Klasa 11

• Skupienie — kwantyfikowanie obserwacji i powiązanie struktury komórki z jej funkcją.
• Aktywności — oblicz całkowite powiększenie każdego obiektywu z okularem 10×; użyj pola widzenia (18 mm ÷ moc obiektywu), aby oszacować średnicę komórki i jej jądra w mikrometrach, oraz porównaj wyniki z przyjętymi wartościami 50–70 µm i 8–10 µm; wyjaśnij nieregularny kształt tych komórek brakiem ściany komórkowej i przeciwstaw go komórkom roślinnym z laboratorium 025; oraz zidentyfikuj struktury, które muszą być obecne w komórce, ale nie są widoczne, podając w każdym przypadku powód.

Klasa 12 / Poziom akademicki

• Skupienie — optyka, która wyznacza ograniczenia instrumentu, oraz chemia, która wyznacza ograniczenia barwnika.
• Aktywności — oblicz granicę rozdzielczości Abbego d = λ / (2 × NA) dla wszystkich trzech obiektywów i podaj, jakie struktury komórkowe każdy z nich mógłby w zasadzie rozdzielić; odróżnij rozdzielczość od kontrastu i użyj tego rozróżnienia, aby wyjaśnić, dlaczego 8 µm jądro komórkowe pozostaje niewidoczne w preparacie wodnym, mimo że każdy obiektyw jest w stanie je rozdzielić; wyjaśnij chemię płynu Lugola (tworzenie trójjodków i dlaczego jod gromadzi się w jądrze) oraz zaproponuj barwnik, który zamiast tego wyznakowałby inne organellum, uzasadniając swój wybór; oszacuj głębię ostrości przy każdym powiększeniu i powiąż ją z ograniczeniem dotyczącym śruby zgrubnej; zaprojektuj kontrolę (próbę kontrolną), która pozwoli odróżnić prawdziwe jądro komórkowe od uwięzionego pęcherzyka powietrza lub cząstki detrytusu.

Podstawowe wyposażenie laboratorium

Instrumenty

• Złożony mikroskop świetlny z oświetlaczem światła przechodzącego i trzema obiektywami (Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65) oraz okularem 10× — powiększenie całkowite 40×, 100× i 400×
• 2 szkiełka mikroskopowe
• 2 nakrywki
• Kroplomierze
• Pęseta (do przenoszenia szkiełek nakrywkowych)
• Zlewka (50 mL)
• Papier chłonny

Produkty

• Komórki nabłonka policzka człowieka w zawiesinie (1 kropla na szkiełko podstawowe)
• Roztwór Lugola 2% (1 kropla, tylko na drugim szkiełku)