복합 광학 현미경은 세포 생물학을 가능하게 만든 도구이며, 인간의 볼 안쪽을 덮고 있는 세포는 고전적인 첫 번째 표본이다. 협부 상피는 중층 편평 조직으로, 가장 바깥쪽 세포들은 지속적으로 탈락하므로 조직을 절단하거나 염색하거나 절편으로 만들지 않고도 시료를 채집할 수 있다. 세포학자들은 구강암 스크리닝과 유전자 검사를 위한 구강 상피세포 면봉 검사에 여전히 정확히 이 물질을 사용하고 있으며, 이는 교육용 편의를 넘어 실제 진단용 표본이 되게 한다.
살아있는 동물 세포가 광학 현미경에서 거의 보이지 않는 데는 단순한 물리적 이유가 있다. 세포는 대부분 물로 이루어져 있고, 굴절률이 자기가 담겨 있는 물과 거의 차이가 나지 않기 때문에, 투과된 빛을 거의 흡수하거나 꺾지 못하기 때문이다. 그러한 조건에서 현미경 관찰자가 보는 것은 희미한 외곽선과 그 외의 거의 아무것도 없다. 염색약은 일부 구조에는 선택적으로 결합하고 다른 구조에는 결합하지 않음으로써 이 문제를 해결하며, 화학적 차이를 눈이 읽을 수 있는 색상의 차이로 변환한다. 요오드화 칼륨에 요오드를 녹인 루골 용액은 이러한 준비를 위한 표준적인 선택이다. 이는 세포질을 연한 황갈색으로 물들이고 핵을 뚜렷하게 더 어두운 물체로 부각시키며, 가열하지 않고 즉각적으로 그렇게 작용한다.
이번 실험에서는 동일한 표본을 두 번 준비하여 두 표본을 비교하게 됩니다. 첫 번째 슬라이드는 물을 이용한 일반 습식 마운트이고, 두 번째 슬라이드는 커버글라스를 덮기 전에 루골 용액 한 방울을 떨어뜨립니다. 투과 조명기를 켜고 가장 낮은 배율에서 시작하여 40배, 100배, 400배로 높여가며 관찰합니다. 저배율에서는 거대 나사 조절 나사로만 초점을 맞추고 그 이후에는 미세 나사 조절 나사로 초점을 맞추며, 각 단계마다 이미지를 저장합니다. 두 슬라이드의 비교가 이번 실습의 핵심으로, 염색이 어떤 역할을 하는지, 그리고 왜 동물 조직 현미경 검사에서 염색을 거의 필수적으로 수행하는지를 보여줍니다.
교육 목표
실험실 환경 익숙해지기
- 현미경과 전원 스위치, 세 개의 대물렌즈, 조동 및 미동 조절 나사, 재물대, 슬라이드 글라스, 커버 글라스, 스포이트, 흡수지를 시작하기 전에 찾아두세요.
복합 광학 현미경의 작동
- 아래에서 투과(명시야) 조명을 설정하고, 이것이 얇고 투명한 표본에는 적합한 반면 불투명한 표본에는 쓸모없는 이유를 설명하시오.
- 대물렌즈를 4×, 10×, 40× 순서로 오름차순으로 바꾸고, 10× 접안렌즈를 사용할 때 각각의 총 배율을 계산하세요.
- 가장 낮은 배율에서만 거동 조절 나사를 사용하고, 더 높은 배율에서는 미세 조절 나사를 사용하십시오. 그리고 400× 배율에서 거동 조절 나사를 사용할 경우 슬라이드와 대물렌즈에 어떤 일이 발생할지 설명하십시오.
습식 마운트 준비
- 깨끗한 슬라이드 글라스 위에 세포 현탁액 한 방울을 떨어뜨리고, 기포가 생기지 않도록 커버 글라스를 그 위에 덮은 다음, 여분의 액체를 닦아내어 커버 글라스가 시료에 완전히 밀착되도록 합니다.
- 표본이 얇아야 하고 액체에 잠겨 있어야 빛이 통과할 수 있는 이유는, 두껍거나 불투명한 표본은 빛을 차단하거나 산란시켜 시야를 가리게 되며, 액체(보통 굴절률을 맞추기 위한 매개체)는 빛이 공기와 유리 표면을 통과할 때 발생하는 빛의 굴절과 반사를 줄여주어 빛이 표본을 왜곡 없이 통과하고 선명한 상을 맺도록 돕기 때문입니다.
생물학적 염색약 사용
- 복제 슬라이드에 루골 용액을 추가하고 그것이 보이게 하는 구조와 그렇지 않은 구조를 명시하시오.
- 염색한 표본과 염색하지 않은 표본을 직접 비교하고, 배율이 아닌 대비(contrast)의 관점에서 그 차이를 설명하시오.
관찰 및 기록
- 두 개의 슬라이드 모두 각 배율마다 현미경 이미지를 저장하고, 400배 염색된 시야에서 세포막, 세포질, 핵을 주석으로 표시하세요.
- 추측하는 대신 알려진 시야(FOV)를 바탕으로 세포와 그 핵의 크기를 추정하십시오.
프로토콜
준비
- 장치 전면에 있는 스위치를 눌러 현미경을 켜십시오. 조명기를 켜면 전송된 빛이 아래에서 시료를 통과하므로 투명한 표본에 이상적입니다.
- 작업대에 깨끗한 슬라이드 두 장을 놓으십시오.
첫 번째 슬라이드 준비
- 스포이트를 사용하여 첫 번째 슬라이드 위에 구강 상피 세포를 부드럽게 한 방울 떨어뜨립니다.
- 슬라이드에 커버슬립을 덮으세요.
- 흡수지으로 물기를 조심스럽게 닦아내시오.
두 번째 슬라이드 준비
- 두 번째 슬라이드에 1방울의 구강 점막 상피세포를 약병을 사용하여 부드럽게 떨어뜨리세요.
- 두 번째 슬라이드에 루골 용액 한 방울을 떨어뜨리시오.
- 슬라이드를 커버슬립으로 덮으십시오.
- 흡수지으로 물기를 조심스럽게 닦아내시오.
첫 번째 슬라이드 관찰
- 현미경 경통에 슬라이드를 올려놓으세요.
- 태블릿에서 «현미경» 버튼을 클릭하여 현미경 이미지를 봅니다.
- «현미경« 섹션의 왼쪽 하단에 있는 «이미지 저장« 버튼을 클릭하면 관찰된 현미경 시야의 이미지를 저장할 수 있습니다.
현미경 조정
- 현미경 대물렌즈를 터치하여 배율을 조절합니다. 40배 배율(빨간색 대물렌즈 – Plan 4/0.10 라벨)로 관찰을 시작하십시오.
- 현미경 좌우에 있는 거동 조절 나사를 사용하여 초점을 맞추십시오. 이 배율에서는 거동 조절 나사만 사용하십시오.
- 배율을 40배에서 100배(노란색 대물렌즈 – Plan 10/0.25 각인)로, 이어서 400배(파란색 대물렌즈 – Plan 40/0.65 각인)로 서서히 높이고, 그때마다 미세조정 나사로만 초점을 다시 맞추십시오. 이 배율들에서는 거친조정 나사를 사용하면 대물렌즈가 슬라이드에 부딪힐 수 있습니다.
참고: 1000배 배율(유백색 대물렌즈 – Plan 100/1.25로 표시됨)을 사용하려면 대물렌즈와 커버슬립 사이에 오일을 사용해야 합니다. 따라서 이 실험실에서는 이 대물렌즈를 사용하지 않습니다.
두 번째 슬라이드 관찰
- 첫 번째 슬라이드를 세포와 루골이 포함된 두 번째 슬라이드로 교체하십시오.
- 400배 배율(파란색 대물렌즈 – Plan 40/0.65라고 표기된 것)로 관찰하여 세포핵을 확인하십시오. 세포핵은 루골 용액에 의해 노란색으로 물들여져 보일 것입니다.
- 관찰 기록: 중요한 관찰 결과를 기록하십시오.
현미경 끄기
- 장치 전면의 스위치를 눌러 현미경을 끄십시오.
예상 결과
예상되는 현미경 시야의 기준 이미지 세트를 다음에서 확인할 수 있습니다. 이 문서 (PDF).
| 목표 | 총 배율 | 염색하지 않은 슬라이드 (물) | 루골 염색 슬라이드 |
|---|---|---|---|
| 플랜 4 / 0.10 (빨간색) | 40× | 밝고 거의 비어 있는 시야. 세포들은 희미한 무색의 반점으로만 나타나며 잔해나 기포와 구별하기 어렵습니다. | 들판 전체에 연한 황갈색 워시가 퍼져 있고, 세포들은 이제 약간 더 어두운 반점들로 눈에 보인다. |
| 플랜 10 / 0.25 (노란색) | 100× | 개별 세포는 편평하고 불규칙하며 대략 다각형인 윤곽으로 식별할 수 있게 됩니다. 명확한 내부 구조는 보이지 않습니다. | 세포 외곽선이 뚜렷하고 각각은 작고 어두운 중앙체, 즉 핵을 지니고 있습니다. |
| 요금제 40 / 0.65 (파란색) | 400× | 막 윤곽과 희미하게 과립상인 세포질; 핵은 추정할 수는 있으나 확신을 가지고 단언할 수는 없다. | 막, 과립형의 황갈색 세포질, 그리고 주변보다 눈에 띄게 더 어두운, 명확하게 정의된 핵. 이것이 기록하고 주석을 달아야 할 시야이다. |
세포의 생김새와 그 이유
구강 상피세포는 편평상피세포, 즉 납작하고 판 모양이며, 조직의 표면에서 떨어져 나와 슬라이드 위에 느슨하게 지지대 없이 놓여 있습니다. 동물 세포는 세포벽이 없고 유연한 세포막만 가지고 있기 때문에 형태를 고정해 주는 것이 없어 세포가 퍼지고 불규칙한 둥근 다각형 윤곽을 띠며, 종종 가장자리가 겹치거나 접힙니다. 각각은 동물 세포 기준으로는 큰 세포로, 전형적으로 지름이 50~70 µm이지만 두께는 불과 수 마이크로미터에 불과하며, 중앙 근처에 대략 8~10 µm 크기의 둥근 단일 핵이 자리 잡고 있습니다. 실험 025의 식물 세포와 대조해 보는 것은 분명히 가치가 있습니다. 식물 세포는 셀룰로오스 벽이 모양을 결정하기 때문에 직사각형이며 단단한 격자 속에 촘촘히 맞물려 있습니다.
배율, 해상도 및 시야
전체 배율은 대물렌즈와 접안렌즈의 곱입니다. 표준 10배율 접안렌즈의 경우, M = M대상 × M눈 결과적으로 4 × 10 = 40배, 10 × 10 = 100배, 40 × 10 = 400배가 됩니다. 하지만 배율은 확대할 뿐이며, 구별할 수 있는 가장 미세한 세부 사항을 결정하는 것은 대물렌즈의 배율 뒤에 표시된 개구수입니다. 아베의 기준에 따라 d = λ / (2 × NA)이며, 파장이 550 nm인 녹색광을 기준으로 할 때, 0.10 대물렌즈는 d = 550 nm ÷ (2 × 0.10) = 2.8 µm, 0.25 대물렌즈는 1.1 µm, 그리고 0.65 대물렌즈는 550 nm ÷ (2 × 0.65) = 0.42 µm를 해상합니다. 따라서 너비가 8 µm인 핵은 이론적으로 40배에서도 해상될 수 있습니다. 염색되지 않은 슬라이드에서 그것이 보이지 않게 하는 것은 해상도가 아니라 대비입니다.
대물렌즈의 배율이 높아질수록 시야는 그에 반비례하여 좁아집니다. 시야수가 18 mm인 접안렌즈의 경우, 가시 직경은 적색 대물렌즈에서 18 ÷ 4 = 4.5 mm, 황색 대물렌즈에서 1.8 mm, 그리고 청색 대물렌즈에서는 18 ÷ 40 = 0.45 mm, 즉 450 µm가 됩니다. 이는 눈금자(그라티큘) 없이도 세포의 크기를 측정할 수 있는 직접적인 방법을 제공합니다. 즉, 약 450 µm 너비의 400배율 시야에 세포들이 끝과 끝이 닿도록 대략 7개 정도가 들어간다면 각 세포의 크기는 60 µm 정도가 됩니다. 또한 이것은 왜 저배율에서 먼저 표본의 중심을 맞추어야 하는지를 설명해 줍니다. 400배율에서는 저배율 시야 면적의 약 400분의 1만 여전히 시야에 남아 있기 때문입니다.
심도는 시야의 폭보다 훨씬 더 빠르게 얕아져서, 40배율에서의 수십 마이크로미터에서 400배율에서는 1마이크로미터 미만으로 떨어진다. 그것이 바로 프로토콜에서 가장 낮은 배율에서만 거동 나사를 사용하도록 제한하는 이유이다. 400배율에서는 파란색 대물렌즈가 커버슬립 위 겨우 밀리미터의 몇 분의 일 정도 거리에 위치하게 되며, 거동 나사를 조작하면 유리와 유리가 부딪혀 슬라이드가 깨지고 대물렌즈 앞부분이 손상되기 때문이다.
얼룩이 효과가 있는 이유
루골 용액은 삼요오드화 이온 형태로 요오드화 칼륨에 의해 용액 상태로 유지되는 분자 상태의 요오드입니다: I2 + 나− → 나3−. 요오드는 가시광선 영역에서 흡수가 강하고 단백질 및 핵산과 쉽게 결합하므로, 세포 내에서 거대분자가 가장 밀집된 곳에 축적됩니다. DNA와 히스톤으로 가득 찬 핵은 주변의 수분 많은 세포질보다 단위 부피당 훨씬 더 많은 요오드를 흡수하므로 현저히 어둡게 나타납니다. 이 메커니즘은 배율이 아니라 화학적 친화력에 의한 것으로, 실험실에서 가장 널리 적용할 수 있는 단 하나의 아이디어입니다. 즉, 어떤 구조를 보려면 먼저 그 주변부가 아니라 그 구조에 결합하는 무언가를 찾아야 한다는 것입니다.
학년별 과제 요약
9~10학년
- 집중 — 현미경을 안전하게 조작하고, 기구와 세포의 용어(대물렌즈, 접안렌즈, 재물대, 거친조절나사와 미세조절나사, 습윤 마운트, 커버슬립, 염색약, 세포막, 세포질, 핵)를 사용하여 관찰한 내용을 설명하기.
- 활동 —두 슬라이드를 모두 준비하고, 각각을 40배, 100배, 400배로 관찰한 다음, 6장의 이미지를 저장합니다. 400배율의 염색된 시야를 그리고 세포막, 세포질, 그리고 핵을 레이블링 하세요. 유도 질문에 답하세요: 염색된 슬라이드에서 볼 수 있지만 염색되지 않은 슬라이드에서는 볼 수 없는 것은 무엇이며, 따라서 염색은 어떤 추가 정보를 제공하는가? 대물렌즈를 왜 가장 낮은 배율에서 가장 높은 배율 순으로 바꾸고 그 반대로는 절대 하지 않는가?
11학년
- 집중 — 관찰을 수치화하고 세포 구조를 세포 기능에 연결하는 것.
- 활동 — 10배 안렌즈를 사용하여 각 대물렌즈의 총 배율을 계산하고, 시야(18 mm ÷ 대물렌즈 배율)를 이용하여 세포와 그 핵의 지름을 마이크로미터 단위로 추정하며, 그 결과를 공인된 50–70 µm 및 8–10 µm와 비교하고; 세포벽이 없기 때문에 나타나는 이러한 세포의 불규칙한 모양을 설명하며, 실험 025의 식물 세포와 대조하고; 세포 내에 반드시 존재해야 하지만 관찰할 수 없는 구조들을 식별하고 각각의 경우 그 이유를 설명하시오.
12학년 / 대학교 수준
- 집중 — 기기의 한계를 정하는 광학과 염색의 한계를 정하는 화학.
- 활동 — 세 가지 대물렌즈 모두에 대해 아베 분해능 한계 $d = \\lambda / (2 \\times \\text{NA})$를 계산하고, 각각이 원칙적으로 어떤 세포 구조를 분해할 수 있는지 명시하시오. 분해능과 대조(contrast)를 구별하고, 그 구별을 이용하여 모든 대물렌즈가 분해할 수 있음에도 불구하고 8 µm 핵이 물 마운트에서 보이지 않는 이유를 설명하시오. 루골 용액의 화학 작용(삼요오드화물 형성 및 요오드가 핵에 농축되는 이유)을 설명하고, 대신 다른 소기관을 염색할 염색약을 제안하며 그 선택을 정당화하시오. 각 배율에서의 심도를 추정하고 이를 미세조절(coarse-focus) 제한과 관련시키며, 진정한 핵을 갇힌 기포나 파편 입자와 구별할 수 있는 대조군(control)을 설계하시오.
실험실 필수품
악기
- 투과 조명기와 세 개의 대물렌즈(플랜 4/0.10, 플랜 10/0.25, 플랜 40/0.65), 10× 접안렌즈를 갖춘 복합 광학 현미경 — 총 배율 40×, 100×, 400×
- 현미경 슬라이드 2개
- 커버글라스 2개
- 스포이트
- 커버슬립용 핀셋
- 비커 (50 mL)
- 흡수지
제품
- 현탁액 상태의 인간 구강 상피세포 (슬라이드당 1방울)
- 루골 용액 2% (1방울, 두 번째 슬라이드에만)