029 – Osservazione della saliva

La saliva sembra acqua, ma non lo è affatto. Circa il 99 % è costituito da acqua, mentre il restante 1 % svolge la funzione vera e propria: elettroliti che proteggono la bocca dall’acidità, mucine che rendono il fluido scivoloso, lisozima e immunoglobulina A che limitano la proliferazione batterica, e α-amilasi, che inizia a digerire l’amido prima ancora che il cibo venga ingerito. In sospensione in quel fluido c’è una popolazione di materiale solido: cellule squamose piatte desquamate dal rivestimento della bocca, batteri in numero enorme, residui di cibo e filamenti di muco. Osservarne una goccia al microscopio è uno dei modi più rapidi per mostrare a uno studente che un fluido corporeo è una sospensione di cellule piuttosto che un liquido trasparente, ed è anche una buona introduzione al problema centrale della microscopia ottica: le cellule viventi sono trasparenti, quindi ingrandirle non è sufficiente. È necessario conferire loro contrasto. In questo laboratorio preparerete due vetrini dallo stesso campione di saliva, uno semplice e uno con l’aggiunta di una goccia di iodio di Lugol, ed esaminerete entrambi attraverso gli stessi tre obiettivi, 40×, 100× e 400×. Il confronto tra i due vetrini allo stesso ingrandimento, piuttosto che l’ingrandimento in sé, è il punto centrale dell’esercizio: il vetrino non colorato mostra quanto poco sia visibile senza una colorazione, mentre quello colorato mostra ciò che la colorazione rivela.

Obiettivi Educativi

Funzionamento di un microscopio composto

• Accendere lo strumento e il suo illuminatore, e spiegare perché la luce trasmessa dal basso è adatta a un campione trasparente.
• Cambia gli obiettivi nell'ordine corretto, da 40× in su, e ritempera la messa a fuoco con la vite macrometriche dopo ogni cambio.

Comprensione dell'ingrandimento e della risoluzione

• Calcola l'ingrandimento totale come il prodotto dell'obiettivo e dell'oculare da 10× e leggi i due numeri incisi su un obiettivo come ingrandimento e apertura numerica.
• Spiega perché l'obiettivo con il massimo ingrandimento non è sempre quello giusto con cui iniziare, e perché un ingrandimento che supera il potere risolutivo della lente non aggiunge nulla.

Preparazione di un preparato a fresco

• Metti una goccia su un vetrino, abbassa un coprioggetto senza intrappolare aria e tampona l'eccesso in modo che il coprioggetto risulti piatto.
• Prepara una coppia di vetrini abbinati che differiscano per un solo aspetto, in modo che l'effetto della colorazione possa essere attribuito alla colorazione stessa.

Uso di un mezzo di contrasto

• Aggiungi iodio di Lugol al secondo vetrino e descrivi cosa diventa visibile che non era visibile prima.
• Una colorazione agisce assorbendo la luce in alcune strutture più che in altre, uccidendo le cellule durante il processo.

Identificazione del contenuto del campione

• Riconoscere le cellule epiteliali squamose in base alle loro dimensioni e forma, e distinguerle da filamenti di muco, detriti e batteri.
• Separa ciò che appartiene a un organismo vivente da ciò che non vi appartiene, e sii onesto riguardo a quali piccoli oggetti non possono essere identificati a questa risoluzione.

Registrazione e segnalazione delle osservazioni

• Salvare un'immagine a ogni ingrandimento etichettandola con il vetrino e l'obiettivo utilizzato.
• Scrivi una descrizione che indichi l'ingrandimento, ciò che è stato visto e ciò che non è stato possibile risolvere.

Protocollo

Davanti a te c'è un microscopio ottico dotato di 4 obiettivi. Per facilitarne l'utilizzo, alcune funzioni sono state disattivate e vengono impiegate solo nei laboratori più avanzati.

Si noti che l'ingrandimento totale si calcola moltiplicando l'ingrandimento dell'obiettivo (ad esempio, 4x) per quello dell'oculare. Il microscopio utilizzato in questo laboratorio è dotato di un oculare con ingrandimento 10x. Ad esempio, un obiettivo con ingrandimento 4x darà luogo a un ingrandimento totale di 40x.

Preparazione

1. Accendere il microscopio premendo l'interruttore sulla parte anteriore del dispositivo. Si accenderà l'illuminatore, in modo che la luce trasmessa passi attraverso il campione dal basso, ideale per campioni trasparenti.
2. Posizionare due vetrini puliti sulla zona di lavoro.

Preparazione della prima slide
1. Posizionare una goccia di saliva sul primo vetrino.
2. Coprire il vetrino con un coprivetrino.
3. Tamponare delicatamente l'eccesso di saliva con carta assorbente.
Preparazione del secondo cursore
1. Mettere una goccia di saliva sul secondo vetrino.
2. Posiziona una goccia di Lugol sullo stesso vetrino.
3. Coprire il vetrino con un coprioggetto.
4. Tamponare delicatamente l'eccesso di Lugol con carta assorbente.

Osservazioni

Osservazione del primo vetrino (solo saliva)
1. Posizionare il primo vetrino sul piatto del microscopio.
2. Fare clic sul pulsante « Microscopio « sulla tavoletta per visualizzare l'immagine del microscopio.
È possibile salvare un'immagine della vista osservata cliccando il pulsante « Salva immagine «, situato nell'area in basso a sinistra della sezione « Microscopio «.
3. Regola l'ingrandimento toccando gli obiettivi del microscopio. Inizia l'osservazione con un ingrandimento 40x (obiettivo rosso – etichettato Plan 4/0.10).
4. Messa a fuoco con le manopole di regolazione grossolana situate a sinistra e a destra del microscopio.
5. Aumentare gradualmente l'ingrandimento da 40x a 100x (obiettivo giallo – contrassegnato con la dicitura Plan 10/0,25), quindi a 400x (obiettivo blu – contrassegnato con la dicitura Plan 40/0,65), regolando la messa a fuoco secondo necessità.
Nota: un ingrandimento di 1000x (obiettivo per immersione in olio – etichettato Plan 100/1.25) richiede l'uso di olio tra l'obiettivo e il vetrino coprioggetto. Pertanto, non utilizziamo questo obiettivo in questo laboratorio.

Osservazione del secondo vetrino (saliva e Lugol)
1. Sostituire la prima lastra con la seconda, contenente la saliva e la soluzione di Lugol.
2. Iniziando a ingrandimento 100X (obiettivo giallo – etichettato Plan 10/0.25), si noti la presenza di nuclei cellulari, che dovrebbero apparire colorati di marrone dal Lugol.
* Non dimenticare di registrare le osservazioni importanti!

Spegni il microscopio
1. Spegnere il microscopio premendo l'interruttore sulla parte anteriore del dispositivo.

Domande di osservazione
1. Cosa noti nello striscio di saliva non colorato (senza Lugol)?
2. Qual è lo scopo del Lugol nell'esperimento?
3. Quale parte della cellula diventa più visibile dopo l'aggiunta di Lugol e perché?
4. Perché devi sempre iniziare l'osservazione a basso ingrandimento (40x) prima di passare a 100x o 400x?
5. Sulla base delle tue osservazioni, quali strutture nella saliva appartengono a un essere vivente (cellule umane) e quali sono elementi non viventi (muco, detriti, ecc.)?
6. Per ciascun ingrandimento, confronta ciò che vedi nei tuoi preparati di saliva con un'immagine di riferimento pubblicata dell'epitelio della guancia (vedi l'immagine di riferimento fornita con questa esperienza di laboratorio). Questo protocollo non prevede la preparazione di uno striscio buccale, quindi il confronto viene fatto rispetto al riferimento anziché rispetto a un vetrino preparato da te.

Immagine di riferimento — epitelio della guancia. Questo laboratorio prepara solo vetrini di saliva; non esegue uno striscio buccale. Alla domanda 6 si risponde facendo riferimento a una microfotografia di riferimento pubblicata di cellule epiteliali buccali, che il docente fornisce insieme al laboratorio. Cosa farnotare: le cellule buccali si presentano come cellule poligonali grandi, piatte e integre, spesso in foglietti, ciascuna con un nucleo rotondo chiaramente visibile e uno sfondo pulito. La saliva, al contrario, contiene cellule che sono già state desquamate — sparse, piegate o rotte, mescolate a filamenti di muco, batteri e detriti alimentari. Le cellule sono dello stesso tipo; ciò che differisce è la loro condizione e ciò che le circonda.

Risultati Previsti

I risultati si trovano in questo documento (PDF)

Entrambi i vetrini contengono la stessa saliva. Ciò che cambia tra di loro è il contrasto, e ciò che cambia tra gli obiettivi è quanto piccolo possa essere un dettaglio separato dal suo vicino. La prima tabella fornisce, per ciascun obiettivo nella simulazione, i numeri incisi su di esso e ciò che ci si può aspettare di vedere su ciascuno dei due vetrini.

La seconda tabella elenca ciò che si trova effettivamente nel campione, con le dimensioni di ciascun oggetto, in modo che uno studente possa decidere solo dai numeri quale obiettivo è necessario per vederlo.

I due numeri sull'obiettivo e cosa compra ciascuno. L'ingrandimento totale è il prodotto delle due lenti nel percorso: M = M_obiettivo × M_oculare, quindi l'obiettivo 4× con l'oculare 10× del microscopio dà 40×, e l'obiettivo 40× dà 400×. Tuttavia, il solo ingrandimento rende semplicemente l'immagine più grande; la possibilità di distinguere due punti vicini è determinata dal secondo numero, l'apertura numerica. Il criterio di Abbe stabilisce che la minima separazione risolvibile è d = λ / (2 NA). Prendendo λ = 550 nm, nel mezzo dello spettro visibile, l'obiettivo con NA 0,10 dà d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, cioè circa 2,8 µm; l'obiettivo con NA 0,25 dà circa 1,1 µm; e l'obiettivo con NA 0,65 dà circa 0,42 µm. Una cellula epiteliale di 60 µm viene risolta senza problemi da tutti e tre, così come il suo nucleo di 10 µm, ma un batterio di 1 µm è al di là delle capacità del primo, al limite per il secondo e appena alla portata del terzo. Aumentare l'ingrandimento dell'oculare ingrandirebbe l'immagine senza aggiungere dettagli — ingrandimento vuoto — ed è per questo che l'obiettivo a immersione in olio, la cui apertura numerica di 1,25 risolve realmente dettagli più fini, è l'unica via per osservare correttamente i batteri.

Perché inizi a bassa potenza. Il campo visivo si riduce in proporzione all'ingrandimento dell'obiettivo: con un numero di campo pari a 18, il diametro visibile è all'incirca 18 / M_obiettivo, che danno circa 4,5 mm a 40×, 1,8 mm a 100× e 0,45 mm a 400×. A 400× si sta guardando a meno di mezzo millimetro di un vetrino largo 20 mm, quindi se si inizia da lì si guarderà quasi certamente del liquido vuoto. La profondità di campo si riduce con l'apertura numerica allo stesso tempo, quindi anche l'obiettivo più potente è più difficile da mettere a fuoco. Trovare il campione a 40×, centrarlo e solo allora passare agli obiettivi superiori non è una formalità; è l'unico modo efficiente di lavorare.

Cosa fa realmente lo iodio di Lugol. La soluzione di Lugol è iodio sciolto in ioduro di potassio come ione triioduro. È nota soprattutto come reagente per l'amido — il triioduro intrappolato all'interno dell'elica dell'amilosio produce il caratteristico colore blu-nero — ed è per questo che i residui di cibo sul vetrino possono colorarsi intensamente. Sulle cellule stesse agisce come colorante di contrasto generale anziché specifico: lo iodio si lega al glicogeno e alle proteine e, poiché il nucleo è la concentrazione più densa di macromolecole nella cellula, assorbe più colorante rispetto al sottile citoplasma circostante e appare come un corpo marrone decisamente più scuro. Questo è l'intero meccanismo, e vale la pena chiarire agli studenti che non è coinvolta alcuna specificità chimica: un preparato di cellule della mucosa buccale in un laboratorio scolastico viene più spesso colorato con blu di metilene, che si lega agli acidi nucleici e conferisce un nucleo blu più pulito. Il prezzo da pagare per uno qualsiasi di questi coloranti è lo stesso: uccidono la cellula, quindi nulla di ciò che si vede sul secondo vetrino è vivo.

Riepilogo del compito per intervallo di voti

Classe 9-10

• Concentrazione: usare correttamente il microscopio e vedere di persona a cosa serve una colorazione.
• Attività: prepara entrambi i vetrini e osserva ciascuno a 40×, 100× e 400×; salva ed etichetta un'immagine a ogni ingrandimento; disegna ciò che è visibile su ciascun vetrino a 400× fianco a fianco; nomina le strutture identificate e indica quali oggetti non è stato possibile identificare; spiega in una sola frase perché il secondo vetrino è più facile da leggere; e fornisci la regola per l'ordine in cui vengono usati gli obiettivi.

Undicesimo anno

• Concentrazione: il lato quantitativo della microscopia: ingrandimento, apertura numerica e campo visivo.
• Attività: calcola l'ingrandimento totale di ciascun obiettivo con l'oculare da 10×; usa d = λ / (2 NA) con λ = 550 nm per calcolare la risoluzione di tutti e quattro gli obiettivi, compreso quello a immersione in olio; stima il diametro di una cellula epiteliale confrontandolo con il campo visivo; stabilisci da questi numeri quali oggetti nella Tabella 2 ciascun obiettivo può e non può risolvere; e spiega a cosa si lega il Lugol e perché il nucleo ne assorbe di più rispetto al citoplasma.

12ª classe / Livello universitario

• Concentrazione: il contrasto come vera limitazione della microscopia ottica e la progettazione di un preparato.
• Attività: Un campione cellulare non colorato è quasi invisibile in campo chiaro perché possiede un indice di rifrazione simile a quello del mezzo circostante e l'assorbimento della luce è minimo. Poiché la maggior parte delle cellule biologiche è trasparente, esse agiscono come "oggetti di fase", ritardando la fase delle onde luminose che le attraversano senza alterarne significativamente l'ampiezza (intensità), il che impedisce la formazione di un contrasto visibile in campo chiaro. Il contrasto di fase risolve questo problema convertendo i ritardi di fase (invisibili all'occhio umano) in differenze di ampiezza (luminosità), sfruttando un anello di fase e un diaframma anulare per interferire la luce deviata dalla cellula con quella non deviata. Il contrasto a interferenza differenziale (DIC o Nomarski) utilizza un prisma di Wollaston per dividere la luce in due fasci polarizzati ortogonalmente che attraversano punti leggermente diversi del campione; l'interferenza risultante crea un'immagine tridimensionale basata sui gradienti del cammino ottico, senza necessità di colorazione. L'olio d'immersione aumenta l'apertura numerica ($AN$) elevando l'indice di rifrazione ($n$) tra il coprioggetto e la lente frontale dell'obiettivo, riducendo la rifrazione della luce e permettendo a un maggior numero di raggi ad alto angolo (provenienti da dettagli fini) di entrare nell'obiettivo anziché essere dispersi. La formula dell'apertura numerica è $AN = n \sin(\theta)$, dove $\theta$ è il semialfa dell'angolo di apertura. L'olio (con $n \approx 1,515$, simile al vetro) supera il limite dell'aria ($n = 1$), consentendo valori di $AN$ superiori a 1 (spesso fino a 1,4). La risoluzione ($d$) è definita dal criterio di Abbe come $d = \frac{\lambda}{2 AN}$ (o dalla formula di Rayleigh $d = \frac{0,61\lambda}{AN}$). Passando, ad esempio, dall'aria ($AN \approx 0,95$) all'olio ($AN = 1,25$ con luce verde di $\lambda = 550\text{ nm}$), la risoluzione passa da circa $289\text{ nm}$ a $220\text{ nm$, migliorando la capacità di distinguere dettagli più vicini. L'ingrandimento vuoto si verifica quando si aumenta l'ingrandimento dell'immagine (ad esempio utilizzando oculari molto potenti o obiettivi digitali) oltre il limite di risoluzione del sistema ottico, ingrandendo i pixel o la sfocatura senza rivelare nuovi dettagli strutturali. Un genuino aumento del potere risolutivo, invece, richiede l'aumento dell'apertura numerica ($AN$) per separare fisicamente due punti vicini che prima apparivano come un unico punctum. Per un campione di saliva (prevalentemente batteri), la scelta del colorante dipende dall'obiettivo: il blu di metilene è un ottimo colorante semplice che evidenzia la morfologia generale (forma e disposizione) dei batteri colorando uniformemente il citoplasma grazie alla sua natura basica che si lega agli acidi nucleici carichi negativamente. Lo iodio di Lugol (soluzione di I2-KI) evidenzia strutture intracellulari come granuli di amido o glicogeno, ma è meno efficace per la morfologia batterica generale e serve soprattutto come mordente nella colorazione di Gram. La colorazione di Gram differenzia i batteri in base alla struttura della parete cellulare (Gram-positivi in viola/blu e Gram-negativi in rosa/rosso), consentendo di distinguere le principali categorie batteriche presenti nella flora orale. Per formulare un'affermazione difendibile sull'abbondanza batterica nella saliva, il campione deve essere preparato diluendo una quantità misurata di saliva fresca e omogeneizzata. Il conteggio deve essere eseguito utilizzando una camera di conta cellulare standardizzata (come l'emocitometro di Petroff-Hauser per i batteri) al microscopio in condizioni di campo scuro o a contrasto di fase, oppure mediante semina su piastra (per determinare le unità formanti colonie, UFC). Affinché la stima sia statisticamente difendibile, è necessario analizzare un numero sufficiente di quadrati grigliati per soddisfare i requisiti di Poisson, calcolare la deviazione standard ed eseguire repliche tecniche e biologiche indipendenti.

Materiale essenziale di laboratorio

Strumenti

• Microscopio composto con illuminatore e quattro obiettivi: Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65 e Plan 100/1,25 a immersione in olio (non usato), con oculare 10×
• Vetrini per microscopio (2)
• Vetrini coprioggetto (2)
• Pinzette
• Contagocce
• Becher (50 mL)
• Carta assorbente, per tamponare il liquido in eccesso

Prodotti

• Saliva umana in sospensione
• Soluzione di iodio di Lugol 2 %