타액은 물처럼 보이지만, 결코 물이 아닙니다. 타액의 약 99 %는 물이며, 나머지 1 %가 다음과 같은 역할을 합니다: 산으로부터 구강을 보호하는 전해질, 체액을 미끄럽게 만드는 뮤신, 세균 증식을 억제하는 리소자임과 면역글로불린 A, 그리고 음식을 삼키기 전에 전분을 분해하기 시작하는 α-아밀라아제 등이 그 역할을 담당합니다. 이 액체에는 입 안 점막에서 탈락된 편평 상피세포, 엄청난 수의 세균, 음식물 찌꺼기, 점액 가닥 등 고체 물질들이 부유해 있습니다. 현미경 아래에 이 타액 한 방울을 올려두는 것은 학생들에게 체액이 투명한 액체가 아니라 세포의 현탁액임을 보여주는 가장 빠른 방법 중 하나이며, 동시에 광학 현미경의 핵심적인 문제, 즉 살아있는 세포는 투명하기 때문에 단순히 확대하는 것만으로는 충분하지 않다는 점을 소개하는 좋은 기회이기도 합니다. 세포에 대비를 부여해야 합니다. 이 실험에서는 동일한 타액 표본으로 두 개의 슬라이드를 준비할 것입니다. 하나는 무처리 슬라이드이고, 다른 하나는 루골 요오드 한 방울을 첨가한 슬라이드이며, 두 슬라이드 모두 40배, 100배, 400배의 동일한 세 가지 대물렌즈를 통해 관찰할 것입니다. 이 실습의 핵심은 배율 자체보다는 동일한 배율에서 두 슬라이드를 비교하는 데 있습니다. 염색하지 않은 슬라이드는 염색 없이 얼마나 적은 정보만 보이는지 보여주고, 염색된 슬라이드는 염색이 무엇을 드러내 주는지 보여줍니다.
교육 목표
복합 현미경의 조작
- 기기와 그 조명장치를 켜고, 아래에서 오는 투과광이 투명한 표본에 적합한 이유를 설명하세요.
- 40배율부터 상향 조정하여 대물렌즈를 올바른 순서로 바꾸고, 각 변경 후에는 거동조 1조동 나사로 초점을 다시 맞추십시오.
배율과 해상도의 이해
- 대물렌즈 배율과 10배 접안렌즈의 곱으로 전체 배율을 계산하고, 대물렌즈에 새겨진 두 숫자를 배율과 개구수로 읽어라.
- 가장 높은 배율이 항상 시작하기에 가장 올바른 배율이 아닌 이유는, 렌즈의 분해능을 넘어선 확대는 아무것도 더해주지 않기 때문입니다.
습식 마운트 준비
- 슬라이드 글라스 위에 방울을 떨어뜨리고, 공기가 갇히지 않도록 커버슬립을 덮은 뒤, 여분의 액체를 닦아내어 커버슬립이 평평하게 놓이도록 하세요.
- 염색의 효과가 염색약 덕분임을 증명할 수 있도록, 단 한 가지만 다르고 나머지는 모두 일치하는 한 쌍의 슬라이드를 준비하세요.
조영제 사용
- 두 번째 슬라이드에 루골 요오드를 추가하고, 이전에 보이지 않던 어떤 것이 가시화되는지 서술하시오.
- 염색약은 어떤 구조에서는 빛을 더 많이 흡수하고 다른 구조에서는 적게 흡수하는 방식으로 작용하며, 그 과정에서 세포를 죽이게 됩니다.
시료에 무엇이 있는지 확인
- 편평상피세포는 크기와 모양을 통해 인식하고, 점액 가닥, 잔해, 박테리아와 구별합니다.
- 생물에 속하는 것과 그렇지 않은 것을 구분하고, 이 해상도에서는 식별할 수 없는 작은 물체가 무엇인지 솔직하게 밝혀라.
관찰 기록 및 보고
- 각 배율마다 이미지를 저장하고 슬라이드와 사용된 대물렌즈를 표시하십시오.
- 배율, 관찰된 대상, 그리고 해상(식별)할 수 없었던 것을 기술하는 설명.
프로토콜
당신 앞에는 4개의 대물렌즈가 있는 광학 현미경이 있습니다. 사용의 편의를 위해 특정 기능은 비활성화되어 있으며, 더 발전된 실험실에서 사용됩니다.
총 확대 배율은 대물렌즈 배율(예: 4배)과 접안렌즈 배율을 곱하여 계산된다는 점에 유의하십시오. 본 실험실에서 사용되는 현미경은 10배율의 접안렌즈를 가지고 있습니다. 예를 들어, 4배율의 대물렌즈는 40배의 총 확대 배율을 갖게 됩니다.
준비
1. 기기 전면에 있는 스위치를 눌러 현미경을 켭니다. 조명기가 켜져 투과광이 아래에서부터 샘플을 통과하게 되는데, 이는 투명한 표본에 이상적입니다.
2. 작업 공간에 깨끗한 슬라이드 두 개를 놓으세요.
첫 번째 슬라이드 준비
1. 첫 번째 슬라이드에 침 한 방울을 떨어뜨립니다.
2. 커버슬립으로 슬라이드를 덮습니다.
3. 흡수성이 있는 종이로 침을 조심스럽게 닦아내십시오.
두 번째 슬라이드 준비
1. 슬라이드 2에 침 한 방울을 떨어뜨립니다.
2. 같은 슬라이드 위에 루골 용액 한 방울을 떨어뜨립니다.
3. 슬라이드를 커버글라스로 덮으세요.
4. 룩골 용액의 여분을 흡수지 등으로 조심스럽게 닦아냅니다.
관찰
침만 있는 첫 번째 슬라이드 관찰
현미경 무대에 첫 번째 슬라이드를 놓으세요.
2. 태블릿에서 «현미경« 버튼을 클릭하여 현미경 이미지를 봅니다.
«현미경« 섹션의 왼쪽 하단에 있는 «이미지 저장« 버튼을 클릭하면 관찰된 뷰의 이미지를 저장할 수 있습니다.
3. 현미경 대물렌즈를 터치하여 배율을 조절하십시오. 40배 배율(빨간색 대물렌즈 – Plan 4/0.10 라벨)로 관찰을 시작하십시오.
4. 현미경의 좌우에 있는 거친 초점 조절 손잡이를 사용하여 초점을 정밀하게 맞춥니다.
5. 40배부터 100배(노란색 대물렌즈 – Plan 10/0.25 라벨 부착)로, 그리고 400배(파란색 대물렌즈 – Plan 40/0.65 라벨 부착)까지 점차 배율을 높이며 초점을 조절합니다.
참고: 1000배 배율(유백색 대물렌즈 – Plan 100/1.25로 표시됨)을 사용하려면 대물렌즈와 커버슬립 사이에 오일을 사용해야 합니다. 따라서 이 실험실에서는 이 대물렌즈를 사용하지 않습니다.
침과 루골
1. 첫 번째 슬라이드를 침과 루골 용액이 담긴 두 번째 슬라이드로 교체하세요.
2. 100배 확대(노란색 대물렌즈 - Plan 10/0.25 라벨)에서 시작하여, 루골 용액에 의해 갈색으로 착색되어야 하는 세포 핵의 존재를 확인합니다.
중요한 관찰 내용을 기록하는 것을 잊지 마세요!
현미경을 끄세요
1. 기기 전면에 있는 스위치를 눌러 현미경을 끕니다.
관찰 질문
1. 염색하지 않은 침 슬라이드(루골 용액 없이)에서 무엇이 보이나요?
2. 실험에서 루골액의 목적은 무엇인가요?
3. 루골 용액을 첨가한 후 세포의 어느 부분이 더 잘 보이게 되며, 그 이유는 무엇입니까?
4. 100x 또는 400x로 옮기기 전에 항상 낮은 배율(40x)로 관찰을 시작해야 하는 이유는 무엇인가요?
5. 관찰한 내용을 바탕으로 침에서 살아있는 유기체(인간 세포)에 속하는 구조물과 살아있지 않은 요소(점액, 잔해 등)는 무엇입니까?
6. 각 배율별로, 타액 슬라이드에서 관찰한 내용과 출판된 구강 상피세포 표준 참고 이미지(이 실험과 함께 제공된 참고 이미지 참조)를 비교하십시오. 이 프로토콜은 볼 점막 도말 표본을 제작하지 않으므로, 직접 만든 슬라이드가 아닌 참고 이미지와 비교를 수행합니다.
참조 이미지 — 볼 상피. 본 실습은 타액 슬라이드만 준비하며, 뺨 도말 검체는 채취하지 않습니다. 6번 문항은 교사가 실습 자료와 함께 제공하는 출판된 뺨 상피세포의 참고 현미경 사진을 바탕으로 답변합니다. 이 사진에서 지적해야 할 점은 다음과 같습니다: 뺨 세포는 크고 평평하며 온전한 다각형 모양의 세포로, 대개 시트에 둘러싸여 나타나며, 각각 하나의 명확하게 보이는 둥근 핵과 깨끗한 배경을 가지고 있습니다. 반면, 타액에는 이미 탈락된 세포들이 포함되어 있어 흩어져 있거나 접히거나 깨져 있으며, 점액 가닥, 박테리아 및 음식물 찌꺼기와 섞여 있습니다. 세포는 동일한 유형이지만, 차이가 나는 것은 그들의 상태와 주변 환경입니다.
예상 결과
두 슬라이드 모두 동일한 타액을 담고 있습니다. 슬라이드 간에 달라지는 것은 대비이며, 대물렌즈 간에 달라지는 것은 얼마나 작은 세부 사항이 이웃한 세부 사항과 구별될 수 있는가 하는 점입니다. 첫 번째 표는 시뮬레이션의 각 대물렌즈에 대해 그 위에 새겨진 숫자와 두 슬라이드 각각에서 무엇을 보여줄 것으로 기대할 수 있는지 나타냅니다.
| 목표 | 총 배율 | 가장 작은 디테일까지 해결됨 | 시야 | 맨 타액 슬라이드 | 타액 + 루골액 슬라이드 |
|---|---|---|---|---|---|
| 플랜 4 / 0.10 (빨간색) | 40× | 약 2.8 µm | 약 4.5mm | 창백하고 거의 텅 빈 들판. 흩어져 있는 회색 반점들과 갇힌 공기 방울들의 어두운 원형 윤곽선이 가장 눈에 띄는 물체들이며, 세포는 거의 감지되지 않는다. | 들판은 아이오딘의 황갈색 띠를 띠고 더 짙은 물질 덩어리들은 더 어두운 얼룩으로 눈에 띄게 된다. |
| 플랜 10 / 0.25 (노란색) | 100× | 약 1.1 µm | 약 1.8mm | 편평세포의 희미하고 불규칙한 외곽선과 회색빛의 과립형 잔해들; 여전히 매우 낮은 대비 | 노란-초록색 배경에 세포 윤곽이 뚜렷이 나타나고 핵은 작은 갈색 점들로 보입니다. 이것이 바로 염색의 효과가 처음으로 나타나는 배율입니다. |
| 요금제 40 / 0.65 (파란색) | 400× | 약 0.42 µm | 약 0.45 mm | 하나 혹은 두 개의 세포가 굵고 연한 회색 윤곽을 띠며 시야의 대부분을 채우고 있고, 그 주변은 과립状(상) 물질로 둘러싸여 있으며, 핵은 구별하기 어려움 | 염색된 단일 세포가 시야를 가득 채우고 있다: 뚜렷한 과립성과 함께 갈색-녹색의 세포질, 그리고 명확하게 더 어두운 둥근 핵이 보인다. |
| Plan 100 / 1.25 오일 | 1000× | 약 0.22 µm | 약 0.18 mm | 이 실험실에서는 사용되지 않음: 대물렌즈와 커버슬립 사이에 이수유(immersion oil)가 필요하지만 시뮬레이션에서는 비활성화되어 있습니다. | 사용되지 않음 |
두 번째 표에는 각 객체의 크기와 함께 샘플에 실제로 들어 있는 내용이 나열되어 있어, 학생이 숫자만 보고도 그것을 보는 데 어떤 대물렌즈가 필요한지 판단할 수 있습니다.
| 낙하물 안에 무엇이 들어 있나요? | 일반적인 크기 | 얼룩 없는 | 루골 이후 |
|---|---|---|---|
| 구강 점막에서 탈락된 편평상피세포 | 폭이 50~70 µm이고 매우 얇고 평평함 | 세포가 주변 물만큼이나 투명해서 놓치기 쉬운, 희미하고 불규칙한 외곽선 | 경계가 뚜렷한 다각형 세포로, 세포질은 갈색-노란색에서 올리브색을 띠고 있다 |
| 그 세포의 핵 | 8~12 µm | 세포질과 거의 구별되지 않는다 | 이 슬라이드에서 가장 눈에 띄는 특징은 중앙 부근에 있는 작고 뚜렷하게 더 짙은 갈색의 몸체입니다. |
| 점액 가닥 | 불규칙한 모양이며, 길이는 수십에서 수백 µm | 매우 희미하고 가늘며, 대개 주름질 때만 보이는 | 색이 입혀져 있어 추적하기가 훨씬 쉬우며, 이물질 덩어리를 한데 뭉치게 하는 경향이 있다 |
| 박테리아 | 구균은 약 1 µm, 간균은 길이 1~3 µm, 폭 약 0.5 µm | 40배 확대 시에는 보이지 않으며, 400배 확대 시에는 기껏해야 움직이는 점들로만 보인다 | 400배 확대 시, 분해능 한계점 또는 그 너머에 나타나는 작고 어두운 점들 — 원칙적으로는 개수를 셀 수 있으나, 개별적으로 식별할 수는 없음 |
| 음식물 찌꺼기 및 알갱이 | 몇 µm 위쪽 | 회색의 과립형 물질로, 평평한 슬라이드 위에서 가장 눈에 띄는 것 | 요오드는 녹말 시약이므로 녹말이 존재하는 곳에 강하게 염색됩니다. |
| 커버슬립 아래의 기포 | 수십에서 수백 µm | 선명하고, 매우 어두우며, 완벽한 원형의 윤곽 — 구조물이 아니라 인공물이다 | 변함없이; 얼룩은 거룩을 더럽히지 않으며, 이는 거품을 식별하는 유용한 방법이다 |
목표치에 있는 두 개의 숫자와 각각이 무엇을 구매하는지. 전체 배율은 경로 상에 있는 두 렌즈의 곱입니다: M = M목적 × M접안렌즈, 따라서 현미경의 10배 접안렌즈와 4배 대물렌즈를 조합하면 40배가 되고, 40배 대물렌즈를 사용하면 400배가 됩니다. 하지만 배율만으로는 단순히 이미지가 커질 뿐이며, 서로 가까운 두 지점을 여전히 구별할 수 있는지는 두 번째 수치인 수차수(NA)에 의해 결정됩니다. 아베의 기준에 따르면, 분해 가능한 최소 간격은 d = λ / (2 NA)로 주어집니다. 가시광선 영역의 중간 파장인 λ = 550 nm를 가정할 때, 0.10 대물렌즈를 사용하면 d = 550 / (2 × 0.10) = 2750 nm, 즉 약 2.8 µm가 됩니다. 0.25 대물렌즈는 약 1.1 µm, 0.65 대물렌즈는 약 0.42 µm를 나타냅니다. 60 µm 크기의 상피 세포는 세 가지 대물렌즈 모두에서 충분히 분해할 수 있으며, 10 µm 크기의 세포핵 역시 세 가지 대물렌즈 모두에서 분해할 수 있지만, 1 µm 크기의 박테리아는 첫 번째 대물렌즈로는 분해할 수 없고, 두 번째 대물렌즈로는 간신히 분해 가능하며, 세 번째 대물렌즈에서는 겨우 분해할 수 있는 수준이다. 접안렌즈의 배율을 더 높이면 세부 정보를 추가하지 않고 단지 이미지를 확대할 뿐입니다(‘빈 배율’). 그렇기 때문에 개구수(NA)가 1.25로 실제로 더 미세한 세부 정보를 분해할 수 있는 오일 침지 대물렌즈만이 세균을 제대로 관찰할 수 있는 유일한 방법입니다.
출력을 낮은 전력에서 시작하는 이유. 시야는 대물렌즈 배율에 비례하여 좁아집니다. 시야수가 18일 경우, 가시 직경은 대략 18 / M입니다.목적, 40배율에서는 약 4.5 mm, 100배율에서는 1.8 mm, 400배율에서는 0.45 mm가 됩니다. 400배율에서는 폭 20 mm인 슬라이드의 0.5 mm도 채 되지 않는 부분을 관찰하게 되므로, 이 배율에서 시작하면 거의 틀림없이 빈 액체만 보게 될 것입니다. 또한 NA가 높아질수록 피사계 심도가 얕아지므로, 고배율 대물렌즈는 초점을 맞추기도 더 어렵습니다. 40배율에서 표본을 찾아 중앙에 맞춘 다음, 그 후에야 배율 높은 대물렌즈로 전환하는 것은 단순한 형식적 절차가 아니라, 작업을 수행하는 유일한 효율적인 방법입니다.
루골 요오드가 실제로 하는 일. 루골 용액은 요오드가 요오드화칼륨에 삼요오드 이온 형태로 용해된 것입니다. 이 용액은 전분 시약으로 가장 잘 알려져 있는데, 아밀로스 나선 구조 내부에 갇힌 삼요오드 이온이 익숙한 청흑색을 띠게 하기 때문입니다. 바로 이 때문에 슬라이드 위의 음식물 찌꺼기가 강하게 염색될 수 있습니다. 세포 자체에 대해서는 이 용액은 특이적인 염색제라기보다는 일반적인 대비 염색제 역할을 합니다. 요오드는 글리코겐과 단백질에 결합하는데, 핵은 세포 내에서 고분자가 가장 고농도로 분포된 부위이기 때문에, 주변의 얇은 세포질보다 더 많은 염색제를 흡수하여 뚜렷하게 더 어두운 갈색의 구조로 나타납니다. 이것이 전체적인 작용 기전이며, 학생들에게 화학적 특이성이 관여하지 않는다는 점을 분명히 해둘 필요가 있습니다. 학교 실험실에서 준비하는 구강 세포 표본은 대개 메틸렌 블루로 염색되는데, 이 염색제는 핵산에 결합하여 더 선명한 파란색의 핵을 만들어 줍니다. 이러한 염색제들의 공통된 단점은 세포를 사멸시킨다는 점입니다. 따라서 두 번째 슬라이드에서 보이는 것은 모두 살아있는 것이 아닙니다.
학년별 과제 요약
9~10학년
- 집중 현미경을 올바르게 조작하고, 염색이 어떤 용도인지 직접 확인해 보는 것입니다.
- 활동 두 슬라이드를 모두 준비하고 각각 40배, 100배, 400배로 관찰하십시오. 각 배율에서 이미지를 저장하고 라벨을 붙이십시오. 400배로 관찰했을 때 각 슬라이드에서 보이는 내용을 나란히 그려보십시오. 확인된 구조물의 이름을 적고, 식별할 수 없었던 대상은 무엇인지 설명하십시오. 두 번째 슬라이드가 왜 더 보기 쉬운지 한 문장으로 설명하고, 대물렌즈 사용 순서에 대한 규칙을 제시하십시오.
11학년
- 집중 현미경 검사의 양적 측면 — 배율, 개구수, 시야.
- 활동 10배 접안렌즈를 사용하여 각 대물렌즈의 총 배율을 계산하고, $\lambda = 550\text{ nm}$일 때 $d = \lambda / (2\text{ NA})$ 공식을 사용하여 침유 렌즈를 포함한 네 가지 대물렌즈 모두의 해상도를 구하며, 시야와 비교하여 상피세포의 지름을 추정하고, 이러한 수치로부터 각 대물렌즈가 표 2의 어떤 물체를 해상할 수 있고 해상할 수 없는지 결정하며, 루골 용액이 무엇에 결합하며 왜 핵이 세포질보다 더 많이 흡수하는지 설명하시오.
12학년 / 대학교 수준
- 집중 광학 현미경의 진정한 한계인 명암 대비와 표본의 제작 방식.
- 활동 흡수와 굴절률을 바탕으로, 염색되지 않은 세포가 명시야에서 거의 보이지 않는 이유를 설명하고, 위상대조법이나 차동간섭대조법이 염색 없이 어떻게 이미지를 재현하는지 설명하시오; 수치 구경을 1 이상으로 높이는 데 있어 침지유의 역할을 설명하고, 그로 인해 얻어지는 분해능을 계산하시오; 단순한 배율 증가와 분해능의 실질적인 향상을 구별하시오; 이 표본에 대한 염색제 선택을 정당화하고, 루골 용액과 메틸렌 블루, 그람 염색법을 비교하며 각 염색법이 무엇을 드러내는지 설명하라; 또한 타액 내 세균 밀도에 대한 주장을 타당하게 뒷받침하기 위해 표본을 어떻게 준비하고 계수해야 하는지 제시하라.
실험실 필수품
악기
- 조명장치와 4개의 대물렌즈(Plan 4/0.10, Plan 10/0.25, Plan 40/0.65, Plan 100/1.25 오일용(미사용)), 그리고 10배율 접안렌즈가 장착된 복합 현미경
- 현미경 슬라이드 (2개)
- 커버글라스 (2)
- 핀셋
- 스포이트
- 비커 (50 mL)
- 여분의 액체를 닦아내기 위한 흡수성 페이퍼 타월
제품
- 모물질 상태의 사람 침
- 루골 요오드 용액 2 %