Sliny vypadají jako voda, ale ve skutečnosti jí vůbec nejsou. Zhruba 99 % tvoří voda a zbývající 1 % plní svou funkci: elektrolyty, které chrání ústa před kyselinami, muciny, díky nimž je tekutina kluzká, lysozym a imunoglobulin A, které omezují růst bakterií, a α-amyláza, která začíná štěpit škrob ještě předtím, než je potrava spolknuta. V této tekutině je suspendována směs pevných částic — ploché dlaždicové buňky odloupnuté ze sliznice úst, obrovské množství bakterií, zbytky potravy a pramínky hlenu. Kapka této tekutiny pod mikroskopem je jedním z nejrychlejších způsobů, jak studentům ukázat, že tělesná tekutina je spíše suspenzí buněk než čirou kapalinou, a je to také dobrý úvod do ústředního problému světelné mikroskopie: živé buňky jsou průhledné, takže jejich zvětšení nestačí. Je třeba jim dodat kontrast. V této laboratoři připravíte ze stejného vzorku slin dva sklíčka, jedno čisté a jedno s přidanou kapkou Lugolova roztoku, a obě prozkoumáte pomocí stejných tří objektivů: 40×, 100× a 400×. Smyslem tohoto cvičení je spíše srovnání obou preparátů při stejném zvětšení než samotné zvětšení: preparát bez barviva ukazuje, jak málo je bez barviva vidět, a preparát s barvivem ukazuje, co barvivo odhaluje.
Vzdělávací cíle
Práce se složeným mikroskopem
- Zapněte přístroj a jeho osvětlení a vysvětlete, proč je pro průhledný vzorek vhodné procházející světlo zdola.
- Změňte objektivy ve správném pořadí od 40× směrem nahoru a po každé změně provedení doostření pomocí hrubého posuvu.
Pochopení zvětšení a rozlišení
- Vypočítejte celkové zvětšení jako součin objektivu a 10× okuláru a přečtěte dvě čísla vyrytá na objektivu jako zvětšení a numerickou aperturu.
- Vysvětlete, proč nejvyšší zvětšení není vždy tím správným výchozím bodem a proč zvětšení nad rozlišovací schopnost čočky nepřináší nic nového.
Příprava vlhkého preparátu
- Dejte kapku na podložní sklíčko, položte krycí sklíčko tak, abyste uvnitř nezachytili vzduch, a odstraňte přebytečnou tekutinu, aby krycí sklíčko leželo rovně.
- Připravte dvojici shodných preparátů, které se liší pouze v jednom ohledu, aby vliv barviva mohl být přičten právě tomuto barvivu.
Použití kontrastní látky
- Přidejte Lugolův roztok na druhé sklíčko a popište, co se stane viditelným, co nebylo vidět předtím.
- Barvivo funguje tak, že v některých strukturách absorbuje světlo více než v jiných, a tím procesem buňky usmrcuje.
Určení toho, co je ve vzorku
- Rozpoznejte dlaždicové buňky podle jejich velikosti a tvaru a odlište je od hlenových vláken, detritu a bakterií.
- Oddělte to, co patří živému organismu, od toho, co nepatří, a buďte upřímní ohledně toho, které z malých objektů nelze při tomto rozlišení identifikovat.
Záznam a hlášení pozorování
- Uložte snímek při každém zvětšení a označte jej použitým sklíčkem a objektivem.
- Napište popis uvádějící zvětšení, co bylo vidět a co nebylo možné rozlišit.
Protokol
Před vámi je optický mikroskop se 4 objektivy. Pro usnadnění používání jsou některé funkce zakázány a používají se v pokročilejších laboratořích.
Mějte na paměti, že celkové zvětšení se vypočítá vynásobením zvětšení objektivu (například 4x) zvětšením okuláru. Mikroskop použitý v této laboratoři má okulár se zvětšením 10x. Například objektiv se zvětšením 4x bude mít celkové zvětšení 40x.
Příprava
1. Zapněte mikroskop stisknutím vypínače na přední straně zařízení. Zapnete tím osvětlovač, takže procházející světlo projde vzorkem zespodu, což je ideální pro transparentní preparáty.
2. Položte na pracovní plochu dva čisté mikroskopické sklíčka.
Příprava první snímku
1. Položte kapku slin na první sklíčko.
2. Přikryjte sklíčko krycím sklíčkem.
3. Přebytečné sliny opatrně odsajte savým papírem.
Příprava druhého snímku
1. Položte kapku slin na druhé sklíčko.
2. Na stejné sklíčko naneste kapku Lugolova roztoku.
3. Pokryjte preparát krycím sklíčkem.
4. Přebytečný Lugol opatrně odsajte savým papírem.
Pozorování
Pozorování prvního preparátu (pouze sliny)
1. Vložte první preparát na stolek mikroskopu.
2. Klikněte na tlačítko «Mikroskop« na tabletu pro zobrazení obrazu z mikroskopu.
Obrázek pozorovaného pohledu můžete uložit kliknutím na tlačítko « Save image «, které se nachází v levé dolní části sekce « Microscope «.
3. Zvětšení se nastavuje otáčením revolverového držáku objektivů. Pozorování začněte při zvětšení 40x (červený objektiv – označený Plan 4/0.10).
4. Zaostřete hrubým ostřením pomocí knoflíků umístěných vlevo a vpravo mikroskopu.
5. Postupně zvyšujte zvětšení ze 40x na 100x (žlutý objektiv – označen Plan 10/0.25), poté na 400x (modrý objektiv – označen Plan 40/0.65) a podle potřeby zaostřujte.
Poznámka: Zvětšení 1000× (objektiv na bílém podstavci – označený Plan 100/1,25) vyžaduje použití oleje mezi objektivem a krycím sklíčkem. Proto tento objektiv v této laboratoři nepoužíváme.
Pozorování druhého preparátu (slina a Lugolovo barvivo)
1. Nahraďte první snímek druhým snímkem obsahujícím sliny a Lugolův roztok.
2. Začněte se zvětšením 100X (žlutý objektiv s označením Plan 10/0,25), všimněte si přítomnosti buněčných jader, která by měla mít po obarvení Lugolovým roztokem hnědou barvu.
Nezapomeňte si poznamenat důležitá pozorování!
Vypnout mikroskop
1. Vypněte mikroskop stisknutím vypínače na přední straně přístroje.
Pozorovací otázky
1. Co si všimnete na neobarveném preparátu slin (bez Lugolova roztoku)?
2. Jaký je účel Lugolova roztoku v experimentu?
3. Která část buňky je po přidání Lugolova roztoku viditelnější a proč?
4. Proč musíte vždy začít pozorování při nízkém zvětšení (40x) před přechodem na 100x nebo 400x?
5. Na základě vašich pozorování, které struktury ve slinách patří živému organismu (lidské buňky) a které jsou neživé prvky (hlen, zbytky atd.)?
6. U každého zvětšení porovnejte to, co vidíte na sklíčkách se slinami, s publikovaným referenčním obrázkem epitelu sliznice tváře (viz referenční obrázek dodaný k tomuto laboratornímu cvičení). V rámci tohoto postupu se neprovádí stěr ze sliznice tváře, proto se srovnání provádí s referenčním obrázkem, nikoli se sklíčkem, které jste si sami připravili.
Referenční obrázek – epitel tváře. Tato laboratoř připravuje pouze slinné preparáty; stěr z tváře neprovádí. Na otázku 6 se odpovídá na základě publikované referenční mikrofotografie epiteliálních buněk z tváře, kterou učitel poskytuje spolu s laboratoří. Na co v ní upozornit: buňki z tváře se objevují jako velké, ploché, neporušené polygonální buňky, často v ploškách, každá s jedním zřetelně viditelným kulatým jádrem a čistým pozadím. Sliny naproti tomu obsahují buňky, které již byly vyloučeny – roztroušené, přeložené nebo rozbité, smíchané s hlenovými vlákny, bakteriemi a zbytky potravy. Buňky jsou stejného typu; liší se pouze svým stavem a tím, co je obklopuje.
Předvídané výsledky
Výsledky naleznete v tomto dokumentu (PDF)
Oba preparáty nesou stejné sliny. To, co se mezi nimi mění, je kontrast, a to, co se mění mezi objektivy, je, jak malý detail lze oddělit od sousedního. První tabulka uvádí pro každý objektiv v simulaci čísla na něm vyrytá a to, co lze očekávat, že ukáže na každém ze dvou preparátů.
| Cíl | Celkové zvětšení | Nejmenší detail vyřešen | Zorné pole | Nátěr čistých slin | Slinové + Lugolovo sklíčko |
|---|---|---|---|---|---|
| Plán 4 / 0,10 (červená) | 40× | asi 2,8 µm | asi 4,5 mm | Bledé, téměř prázdné pole. Nejnápadnějšími objekty jsou rozptýlené šedé skvrny a tmavé kruhové obrysy zachycených vzduchových bublin; buňky jsou sotva rozeznatelné. | Pole nabývá žlutohnědého odstínu díky jodu a hustší shluky materiálu se jeví jako tmavší skvrny |
| Plán 10 / 0,25 (žlutá) | 100× | asi 1,1 µm | asi 1,8 mm | Slabé nepravidelné obrysy plochých buněk a šedá zrnitá drť; stále velmi nízký kontrast | Obrysy buněk vystupují na žlutozeleném pozadí a jádra se jeví jako malé hnědé tečky – to je zvětšení, při kterém se barvení poprvé vyplatí |
| Plán 40 / 0,65 (modrá) | 400× | asi 0,42 µm | asi 0,45 mm | Jedna nebo dvě buňky vyplňují velkou část pole jako bledě šedé obrysy, obklopené zrnitým materiálem; jádra jsou těžko rozeznatelná | Jediná obarvená buňka vyplňuje zorné pole: hnědozelená cytoplazma s viditelnou granulační strukturou a zřetelně tmavší, zaoblené jádro |
| Plán 100 / 1,25 olej | 1000× | asi 0,22 µm | asi 0,18 mm | V této laboratoři se nepoužívá: objektiv vyžaduje imerzní olej mezi čočkou a krycím sklíčkem a je v simulaci deaktivován | Nepoužito |
Druhá tabulka uvádí, co se skutečně nachází ve vzorku, spolu s velikostí každého objektu, takže student se může pouze na základě čísel rozhodnout, který objektiv je k jeho zobrazení potřeba.
| Co je v kapce | Typická velikost | Nezabarvený | Po Lugolovi |
|---|---|---|---|
| Dlaždicová epiteliální buňka odloupnutá z výstelky úst | 50 až 70 µm napříč, velmi tenké a ploché | Slabý nepravidelný obrys, který je snadné přehlédnout, protože buňka je téměř stejně průhledná jako voda kolem ní | Jasně ohraničená polygonální buňka, cytoplazma zbarvená hnědožlutě až olivově |
| Jádro této buňky | 8 až 12 µm | Sotva odlišitelný od cytoplazmy | Jediný nejvýraznější rys sklíčka: kompaktní, zřetelně tmavěji hnědé tělíčko poblíž středu |
| Hlenová vlákna | Nepravidelné, desítky až stovky µm dlouhé | Velmi slabé, tenké jako pavučinka, často viditelné pouze v místech, kde se tvoří vrásky | Zabarvené a mnohem snáze dohledatelné; mají tendenci držet shluky nečistot pohromadě. |
| Bakterie | Koky veliké asi 1 µm, tyčky 1 až 3 µm dlouhé a asi 0,5 µm široké | Neviditelné při 40násobném zvětšení, přinejlepším pohybující se tečky při 400násobném zvětšení | Malé tmavé tečky při 400× zvětšení, na nebo za hranicí rozlišovací schopnosti – v principu spočítatelné, neidentifikovatelné |
| Zbytky potravy a granule | Několik µm směrem nahoru | Šedý zrnitý materiál, nejvýraznější věc na čistém sklíčku | Silně zabarvené tam, kde je přítomen škrob, protože jód je činidlo na škrob |
| Vzduchové bubliny pod krycím sklíčkem | Desítky až stovky µm | Ostré, velmi tmavé, dokonale kruhové obrysy – artefakt, nikoliv struktura | Nezměněno; skvrna nešpiní bublinu, což je užitečný způsob, jak ji identifikovat |
Dva údaje na objektivu a co každý z nich kupuje. Celkové zvětšení je součinem obou čoček v dráze: M = Mcíl × Mokulár, takže 4× objektiv s 10× okulárem mikroskopu dává 40× zvětšení a 40× objektiv dává 400×. Samotné zvětšení však obraz pouze zvětší; to, zda zůstanou dva blízké body rozlišitelné, určuje druhé číslo, numerická apertura. Abbeovo kritérium udává nejmenší rozlišitelnou vzdálenost jako d = λ / (2 NA). Pokud vezmeme λ = 550 nm, což je uprostřed viditelného spektra, objektiv s NA 0,10 dává d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, tedy asi 2,8 µm; objektiv s NA 0,25 dává asi 1,1 µm a objektiv s NA 0,65 dává asi 0,42 µm. Epiteliální buňka o velikosti 60 µm je bez problémů rozlišitelná všemi třemi, její 10 µm jádro rovněž všemi třemi, ale 1 µm bakterie je nad možnosti prvního, na hranici rozlišitelnosti druhého a jen tak-tak v dosahu třetího. Zvyšování zvětšení okulárem by obraz zvětšilo bez přidání detailů – jde o prázdné zvětšení –, a proto je imerzní objektiv s olejem, jehož NA 1,25 skutečně rozlišuje jemnější detaily, jedinou cestou, jak bakterie řádně uvidět.
Proč začínáte na nízkém výkonu. Zorné pole se zmenšuje úměrně zvětšení objektivu: při číslu zorného pole 18 je viditelný průměr přibližně 18 / Mcíl, což dává asi 4,5 mm při 40×, 1,8 mm při 100× a 0,45 mm při 400×. Při zvětšení 400× se díváte na méně než půl milimetru podložního sklíčka, které je široké 20 mm, takže pokud začnete tam, budete se téměř jistě dívat do prázdné tekutiny. Hloubka ostrosti se současně zmenšuje s numerickou aperturou (NA), takže na vyšší objektiv se také obtížněji zaostřuje. Najít vzorek při zvětšení 40×, vycentrovat ho a teprve potom přecházet na silnější objektivy není žádná formalita; je to jediný efektivní způsob práce.
Co Lugolův roztok ve skutečnosti dělá. Lugolův roztok je jód rozpuštěný v jodidu draselném ve formě trijodidového iontu. Nejznámější je jako činidlo na škrob – trijodid zachycený uvnitř šroubovice amylozy vytváří známé modročerné zbarvení, a proto se zbytky potravy na sklíčku mohou silně zbarvit. Na samotné buňky působí spíše jako obecné kontrastní barvivo než specifické: jód se váže na glykogen a na bílkoviny, a protože jádro je nejhustší koncentrací makromolekul v buňce, přijímá více barviva než tenká okolní cytoplazma a je vidět jako zřetelně tmavší hnědé tělísko. To je celý mechanismus a stojí za to studentům ujasnit, že v tom není žádná chemická specifika: preparát buňky z vnitřní strany tváře v školní laboratoři se častěji barví modří metylenovou, která se váže na nukleové kyseliny a poskytuje čistší modré jádro. Cena za použití kteréhokoli z těchto barviv je stejná: buňku usmrtí, takže nic, co je vidět na druhém sklíčku, není živé.
Shrnutí úkolů podle věkové kategorie
9. až 10. ročník
- Zaměření správné ovládání mikroskopu a možnost vidět na vlastní oči, k čemu slouží barvení.
- Aktivity: připravte oba preparáty a každý si prohlédněte při zvětšení 40×, 100× a 400×; uložte a označte snímek při každém zvětšení; nakreslete to, co je vidět na každém preparátu při zvětšení 400×, vedle sebe; pojmenujte identifikované struktury a uveďte, které objekty nebylo možné identifikovat; jednou větou uveďte, proč je druhý preparát lépe čitelný; a uveďte pravidlo pro pořadí, v jakém se objektivy používají.
11. ročník
- Zaměření kvantitativní stránka mikroskopie — zvětšení, numerická apertura a zorné pole.
- Aktivity: vypočítejte celkové zvětšení každého objektivu s 10× okulárem; použijte vzorec d = λ / (2 NA) s λ = 550 nm k výpočtu rozlišení všech čtyř objektivu, včetně imerzního olejového; odhadněte průměr epiteliální buňky jeho porovnáním s orným polem; z těchto čísel rozhodněte, které objekty v tabulce 2 každý objekt dokáže a nedokáže rozlišit; a vysvětlete, na co se Lugolův roztok váže a proč ho jádro absorbuje více než cytoplazma.
12. ročník / Úroveň college
- Zaměření kontrast jako skutečné omezení světelné mikroskopie a návrh preparátu.
- Aktivity: vysvětlit, proč je neobarvená buňka při pozorování v jasném poli téměř neviditelná z hlediska absorpce a indexu lomu, a popsat, jak fázový kontrast nebo diferenciální interferenční kontrast umožňuje zviditelnit obraz bez použití barviva; vysvětlit úlohu imerzního oleje při zvýšení numerické apertury nad hodnotu 1 a vypočítat tím získané rozlišení; rozlišit zdánlivé zvětšení od skutečného zvýšení rozlišovací schopnosti; zdůvodnit volbu barviva pro tento vzorek a porovnat Lugolův roztok s methylenovou modří a s Gramovým barvením, přičemž uvést, co by každé z nich odhalilo; a nastínit, jak by musel být vzorek připraven a spočítán, aby bylo možné obhájit tvrzení o výskytu bakterií ve slinách.
Laboratorní potřeby
Nástroje
- Složený mikroskop s osvětlovačem a čtyřmi objektivy: Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65 a Plan 100/1,25 olejový (nepoužitý), s 10× okulárem
- Podložní sklíčka (2)
- Krycí sklíčka (2)
- Pinzeta
- Kapátka
- Kádinka (50 ml)
- Absorpční papírová utěrka k odsátí přebytečné tekutiny
Produkty
- Lidské sliny v suspenzi
- Lugolův jodový roztok 2 %