Speichel sieht aus wie Wasser, ist aber alles andere als das. Etwa 99 % davon besteht aus Wasser, und die restlichen 1 % leisten die eigentliche Arbeit: Elektrolyte, die den Mund vor Säure schützen, Mucine, die die Flüssigkeit gleitfähig machen, Lysozym und Immunglobulin A, die das Bakterienwachstum hemmen, sowie α-Amylase, die bereits vor dem Schlucken mit der Verdauung von Stärke beginnt. In dieser Flüssigkeit schweben zahlreiche feste Bestandteile – flache Plattenepithelzellen, die sich aus der Mundschleimhaut abgelöst haben, Bakterien in enormer Zahl, Speisereste und Schleimfäden. Ein Tropfen davon unter dem Mikroskop ist eine der schnellsten Möglichkeiten, einem Schüler zu zeigen, dass eine Körperflüssigkeit eher eine Suspension von Zellen als eine klare Flüssigkeit ist, und es ist zudem eine gute Einführung in das zentrale Problem der Lichtmikroskopie: Lebende Zellen sind transparent, daher reicht es nicht aus, sie lediglich zu vergrößern. Man muss ihnen Kontrast verleihen. In diesem Labor werden Sie zwei Objektträger aus derselben Speichelprobe präparieren, einen ungefärbten und einen, dem ein Tropfen Lugol-Jod hinzugefügt wurde, und beide durch dieselben drei Objektive mit 40-facher, 100-facher und 400-facher Vergrößerung untersuchen. Der Vergleich der beiden Objektträger bei gleicher Vergrößerung – und nicht die Vergrößerung an sich – ist der Kern dieser Übung: Der unbefärbte Objektträger zeigt, wie wenig ohne Färbung sichtbar ist, und der gefärbte Objektträger zeigt, was die Färbung sichtbar macht.
Bildungsziele
Bedienung eines Lichtmikroskops
- Schalten Sie das Instrument und dessen Beleuchtung ein und erklären Sie, warum Durchlicht von unten für ein transparentes Präparat geeignet ist.
- Wechseln Sie die Objektive in der richtigen Reihenfolge ab 40× aufwärts und stellen Sie nach jedem Wechsel mit dem Grobtrieb neu scharf.
Verständnis von Vergrößerung und Auflösung
- Berechnen Sie die Gesamtvergrößerung als Produkt aus dem Objektiv und dem 10-fach-Okular, und lesen Sie die beiden auf einem Objektiv eingravierten Zahlen als Vergrößerung und numerische Apertur ab.
- Erklären Sie, warum das höchste Objektiv nicht immer das richtige für den Start ist und warum eine Vergrößerung über das Auflösungsvermögen der Linse hinaus keinen Mehrwert bietet.
Herstellung eines Nativpräparats
- Geben Sie einen Tropfen auf einen Objektträger, senken Sie ein Deckgläschen ab, ohne Luft einzuschließen, und tupfen Sie den Überschuss ab, sodass das Deckgläschen flach aufliegt.
- Bereiten Sie ein Paar zusammengepasster Objektträger vor, die sich nur in einer Hinsicht voneinander unterscheiden, damit die Wirkung der Färbung der Färbung zugeschrieben werden kann.
Verwendung eines Kontrastmittels
- Geben Sie Lugolsche Lösung auf den zweiten Objektträger und beschreiben Sie, was nun sichtbar wird, was zuvor nicht sichtbar war.
- Ein Farbstoff wirkt, indem er in bestimmten Strukturen Licht stärker absorbiert als in anderen, und tötet dabei die Zellen ab.
Identifizierung des Inhalts der Probe
- Plattenepithelzellen anhand ihrer Größe und Form erkennen und von Schleimsträngen, Trümmern und Bakterien unterscheiden.
- Trenne, was zu einem lebenden Organismus gehört, von dem, was nicht dazu gehört, und sei ehrlich darüber, welche der kleinen Objekte bei dieser Auflösung nicht identifiziert werden können.
Aufnahme und Berichterstattung von Beobachtungen
- Speichern Sie ein Bild bei jeder Vergrößerung und beschriften Sie es mit dem Objektträger und dem verwendeten Objektiv.
- Schreiben Sie eine Beschreibung, die die Vergrößerung, das Gesehene und das, was nicht aufgelöst werden konnte, angibt.
Protokoll
Vor Ihnen steht ein optisches Mikroskop mit 4 Objektiven. Um die Bedienung zu erleichtern, sind bestimmte Funktionen deaktiviert und werden in fortschrittlicheren Laboren verwendet.
Bitte beachten Sie, dass die Gesamtvergrößerung durch Multiplikation der Vergrößerung des Objektivs (z. B. 4x) mit der des Okulars berechnet wird. Das in diesem Labor verwendete Mikroskop hat ein Okular mit 10-facher Vergrößerung. Beispielsweise führt ein Objektiv mit 4-facher Vergrößerung zu einer Gesamtvergrößerung von 40x.
Vorbereitung
1. Schalten Sie das Mikroskop ein, indem Sie den Schalter an der Vorderseite des Geräts betätigen. Sie schalten den Auflicht ein, sodass das durchfallende Licht von unten durch die Probe fällt, was ideal für transparente Präparate ist.
2. Legen Sie zwei saubere Objektträger auf Ihren Arbeitsbereich.
Vorbereitung der ersten Folie
1. Geben Sie einen Tropfen Speichel auf das erste Objektträger.
2. Decken Sie den Objektträger mit einem Deckgläschen ab.
3. Tupfen Sie den überschüssigen Speichel vorsichtig mit saugfähigem Papier ab.
Vorbereitung der zweiten Folie
1. Geben Sie einen Tropfen Speichel auf das zweite Objektträger.
2. Geben Sie einen Tropfen Lugol auf dasselbe Glasplättchen.
3. Decken Sie den Objektträger mit einem Deckglas ab.
4. Tupfe überschüssiges Lugol vorsichtig mit saugfähigem Papier ab.
Beobachtungen
Beobachtung der ersten Objektträger (nur Speichel)
1. Legen Sie das erste Präparatsobjekt auf den Objektträger des Mikroskops.
2. Klicken Sie auf dem Tablet auf die Schaltfläche «Mikroskop«, um das Mikroskopbild anzuzeigen.
Sie können ein Bild der beobachteten Ansicht speichern, indem Sie auf die Schaltfläche «Bild speichern« klicken, die sich im unteren linken Bereich des Abschnitts «Mikroskop« befindet.
3. Passen Sie die Vergrößerung durch Berühren der Mikroskopobjektive an. Beginnen Sie die Beobachtung mit einer 40-fachen Vergrößerung (rotes Objektiv – beschriftet mit Plan 4/0.10).
4. Verfeinern Sie den Fokus mit den Grobeinstellungsknöpfen, die sich links und rechts am Mikroskop befinden.
5. Erhöhen Sie allmählich die Vergrößerung von 40x auf 100x (gelbes Objektiv – bezeichnet Plan 10/0,25), dann auf 400x (blaues Objektiv – bezeichnet Plan 40/0,65) und stellen Sie dabei jeweils den Fokus ein.
Hinweis: Eine Vergrößerung von 1000x (Objektiv weiß – beschriftet mit Plan 100/1.25) erfordert die Verwendung von Öl zwischen Objektiv und Deckglas. Dieses Objektiv wird daher in diesem Labor nicht verwendet.
Beobachtung der zweiten Objektträger (Speichel und Lugol)
1. Ersetze die erste Folie durch die zweite Folie mit dem Speichel und dem Lugol.
2. Beginnen Sie mit einer 100-fachen Vergrößerung (gelbes Objektiv – bezeichnet Plan 10/0,25) und stellen Sie das Vorhandensein von Zellkernen fest, die durch das Lugol-Reagenz braun gefärbt sein sollten.
* Vergessen Sie nicht, die wichtigen Beobachtungen zu notieren!
Mikroskop ausschalten
1. Schalten Sie das Mikroskop aus, indem Sie den Schalter an der Vorderseite des Geräts drücken.
Beobachtungsfragen
1. Was fällt Ihnen im ungefärbten Speichelpräparat (ohne Lugol) auf?
2. Was ist der Zweck von Lugol in dem Experiment?
3. Welcher Teil der Zelle wird nach Zugabe von Lugol sichtbarer und warum?
4. Warum müssen Sie immer mit geringer Vergrößerung (40x) beginnen, bevor Sie zu 100x oder 400x wechseln?
5. Basierend auf Ihren Beobachtungen, welche Strukturen im Speichel gehören zu einem Lebewesen (menschliche Zellen) und welche sind nicht-lebende Elemente (Schleim, Ablagerungen usw.)?
6. Vergleichen Sie für jede Vergrößerung das, was Sie in Ihren Speichelpräparaten sehen, mit einem veröffentlichten Referenzbild von Wangenepithel (siehe das diesem Praktikum beigefügte Referenzbild). Bei diesem Protokoll wird kein Wangenabstrich angefertigt, sodass der Vergleich anhand der Referenz und nicht anhand eines selbst angefertigten Präparats erfolgt.
Referenzbild – Wappenepithel. In diesem Labor werden nur Speichelpräparate hergestellt; es wird kein Wangenabstrich entnommen. Frage 6 wird anhand einer vom Lehrer zusammen mit dem Labor bereitgestellten, veröffentlichten Referenzmikrofotografie von Wangenepithelzellen beantwortet. Worauf darin hinzuweisen ist: Wangenzellen erscheinen als große, flache, intakte polygonale Zellen, oft in Verbänden, von denen jede einen deutlich sichtbaren runden Zellkern und einen sauberen Hintergrund aufweist. Speichel hingegen enthält Zellen, die bereits abgestoßen wurden – verstreut, gefaltet oder beschädigt, vermischt mit Schleimfäden, Bakterien und Nahrungsresten. Es handelt sich um denselben Zelltyp; was sich unterscheidet, ist ihr Zustand und ihre Umgebung.
Erwartete Ergebnisse
Die Ergebnisse finden Sie in diesem Dokument (PDF).
Beide Objektträger enthalten denselben Speichel. Was sich zwischen ihnen ändert, ist der Kontrast, und was sich zwischen den Objektiven idern ändert, ist, wie klein ein Detail von seinem Nachbarn getrennt werden kann. Die erste Tabelle zeigt für jedes Objektiv in der Simulation die darauf eingravierten Zahlen und was von ihm auf jedem der beiden Objektträger zu erwarten ist.
| Ziel | Gesamtvergrößerung | Kleinstes Detail geklärt | Sichtfeld | Unzentrifugierter Speichelträger | Speichel-Lugol-Präparat |
|---|---|---|---|---|---|
| Plan 4 / 0.10 (rot) | 40× | ca. 2,8 µm | etwa 4,5 mm | Ein blasses, fast leeres Feld. Verstreute graue Pünktchen und die dunklen kreisförmigen Umrisse eingeschlossener Luftblasen sind die auffälligsten Objekte; Zellen sind kaum erkennbar. | Das Feld nimmt den gelb-braunen Farbstich des Iods an und die dichteren Materialklumpen werden als dunklere Flecken sichtbar. |
| Plan 10 / 0,25 (gelb) | 100× | etwa 1,1 µm | ca. 1,8 mm | Schwache, unregelmäßige Umrisse flacher Zellen und grauer, granulärer Detritus; nach wie vor sehr geringer Kontrast | Zellkonturen heben sich von einem gelb-grünen Hintergrund ab und die Kerne erscheinen als kleine braune Punkte – dies ist die Vergrößerung, bei der sich die Färbung erstmals auszahlt |
| Plan 40 / 0,65 (blau) | 400× | etwa 0,42 µm | etwa 0,45 mm | Eine oder zwei Zellen nehmen einen großen Teil des Feldes als blassgraue Umrisse ein, umgeben von granularer Substanz; Kerne sind schwer zu erkennen | Eine einzelne gefärbte Zelle füllt das Sichtfeld: braungrünes Zytoplasma mit sichtbarer Granularität und ein deutlich dunklerer, abgerundeter Kern |
| Plan 100 / 1.25 Öl | 1000× | etwa 0,22 µm | etwa 0,18 mm | In diesem Labor nicht verwendet: Das Objektiv erfordert Immersionsöl zwischen der Linse und dem Deckgläschen und ist in der Simulation deaktiviert. | Nicht verwendet |
Die zweite Tabelle führt auf, was sich tatsächlich in der Probe befindet, sowie die Größe jedes Objekts, damit ein Schüler allein anhand der Zahlen entscheiden kann, welches Objektiv erforderlich ist, um es zu sehen.
| Was ist in dem Drop | Typische Größe | Unbefleckt | Nach Lugol |
|---|---|---|---|
| Aus der Mundschleimhaut abgeschilferte Plattenepithelzelle | 50 bis 70 µm im Durchmesser, sehr dünn und flach | Eine schwache, unregelmäßige Umrisslinie, die leicht zu übersehen ist, da die Zelle fast so transparent ist wie das Wasser um sie herum | Eine klar begrenzte polygonale Zelle, das Zytoplasma braungelb bis olivfarben getönt |
| Zellkern dieser Zelle | 8 bis 12 µm | Kaum vom Zytoplasma zu unterscheiden | Das offensichtlichste Merkmal des Präparats: ein kompakter, deutlich dunkler brauner Körper nahe der Mitte |
| Schleimstränge | Unregelmäßig, Dutzende bis Hunderte von µm lang | Sehr schwach, schleierhaft, oft nur dort sichtbar, wo sie Falten werfen | Getönt und viel leichter zu verfolgen; sie neigen dazu, Schmutzklumpen zusammenzuhalten |
| Bakterien | Kokken ca. 1 µm, Stäbchen 1 bis 3 µm lang und ca. 0,5 µm breit | Unsichtbar bei 40-facher Vergrößerung, bestenfalls sich bewegende Pünktchen bei 400-facher Vergrößerung | Kleine dunkle Punkte bei 400-facher Vergrößerung, an oder jenseits der Auflösungsgrenze — prinzipiell zählbar, nicht identifizierbar |
| Speisereste und Granulat | Einige µm nach oben | Graues granulares Material, das am besten sichtbare Ding auf dem einfachen Objektträger | Stark gefärbt, wo Stärke vorhanden ist, da Iod ein Stärkenachweismittel ist |
| Luftblasen unter dem Deckglas | Zehntel bis Hunderte von µm | Scharfe, sehr dunkle, perfekt kreisförmige Umrisse – ein Artefakt, keine Struktur | Unverändert; ein Fleck befleckt keine Blase, was eine nützliche Methode ist, um eine zu identifizieren. |
Die beiden Zahlen auf dem Ziel und was die jeweilige kauft. Gesamtvergrößerung ist das Produkt der beiden Linsen im Strahlengang: M = MZiel × MOkular, sodass das 4-fache Objektiv mit dem 10-fachen Okular des Mikroskops 40-fache und das 40-fache Objektiv 400-fache Vergrößerung ergibt. Die Vergrößerung allein macht das Bild jedoch nur größer; ob zwei benachbarte Punkte unterscheidbar bleiben, wird durch die zweite Zahl, die numerische Apertur, bestimmt. Das Abbe-Kriterium gibt den kleinsten auflösbaren Abstand als d = λ / (2 NA) an. Wenn man λ = 550 nm annimmt, in der Mitte des sichtbaren Bereichs, ergibt das Objektiv mit 0,10 d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, das sind etwa 2,8 µm; das Objektiv mit 0,25 ergibt etwa 1,1 µm und das mit 0,65 etwa 0,42 µm. Eine 60 µm große Epithelzelle wird von allen drei problemlos aufgelöst, ihr 10 µm großer Zellkern ebenfalls von allen drei, aber ein 1 µm großes Bakterium liegt außerhalb der Reichweite des ersten, ist grenzwertig beim zweiten und gerade noch innerhalb des dritten. Eine Erhöhung der Okularvergrößerung würde das Bild vergrößern, ohne Details hinzuzufügen – leere Vergrößerung –, weshalb das Ölimmersionsobjektiv, dessen NA von 1,25 tatsächlich feinere Details auflöst, der einzige Weg ist, Bakterien richtig zu sehen.
Warum Sie mit geringer Leistung starten. Das Sehfeld schrumpft proportional zur Objektivvergrößerung: Bei einer Sehzahl von 18 beträgt der sichtbare Durchmesser etwa 18 / MZiel, was bei 40× etwa 4,5 mm, bei 100× 1,8 mm und bei 400× 0,45 mm ergibt. Bei 400× betrachten Sie weniger als einen halben Millimeter eines 20 mm breiten Objektträgers. Wenn Sie also dort beginnen, schauen Sie fast sicher auf leere Flüssigkeit. Die Schärfentiefe schrumpft gleichzeitig mit der NA, weshalb das stärkere Objektiv auch schwerer zu fokussieren ist. Das Präparat bei 40× zu finden, zu zentrieren und erst dann zu den höheren Objektiven zu wechseln, ist keine Formalität, sondern die einzige effiziente Arbeitsweise.
Was Lugolsche Lösung tatsächlich bewirkt. Lugolsche Lösung ist in Kaliumiodid gelöstes Iod als Triiodid-Ion. Sie ist vor allem als Stärkereagenz bekannt – in der Amylosehelix eingeschlossenes Triiodid ergibt das bekannte Blau-Schwarz –, und das ist der Grund, warum Speisereste auf dem Objektträger stark anfärben können. Auf den Zellen selbst wirkt sie eher als allgemeiner Kontrastfarbstoff denn als spezifischer: Iod bindet an Glyogen und Proteine, und da der Zellkern die dichteste Ansammlung von Makromolekülen in der Zelle ist, nimmt er mehr Farbstoff auf als das dünne umgebende Cytoplasma und erscheint als deutlich dunklerer brauner Körper. Das ist der gesamte Mechanismus, und es ist sinnvoll, den Schülern klarzumachen, dass keine chemische Spezifität im Spiel ist: Ein Mundschleimhautzellenpräparat in einem Schullabor wird häufiger mit Methylenblau gefärbt, das Nukleinsäuren bindet und einen klareren blauen Zellkern ergibt. Der Preis für jeden dieser Farbstoffe ist derselbe: Sie töten die Zelle ab, sodass auf dem zweiten Objektträger nichts mehr lebt.
Zusammenfassung der Aufgaben nach Klassenstufen
9. bis 10. Klasse
- Fokus das Mikroskop richtig zu bedienen und selbst zu sehen, wozu eine Färbung dient.
- Aktivitäten: Bereiten Sie beide Objektträger vor und betrachten Sie jeden bei 40-, 100- und 400-facher Vergrößerung; speichern und beschriften Sie ein Bild bei jeder Vergrößerung; zeichnen Sie, was auf jedem Objektträger bei 400-facher Vergrößerung zu sehen ist, nebeneinander; benennen Sie die identifizierten Strukturen und geben Sie an, welche Objekte nicht identifiziert werden konnten; erklären Sie in einem Satz, warum der zweite Objektträger leichter abzulesen ist; und nennen Sie die Regel für die Reihenfolge, in der die Objektive verwendet werden.
11. Klasse
- Fokus die quantitative Seite der Mikroskopie — Vergrößerung, numerische Apertur und Sehfeld.
- Aktivitäten: Berechnen Sie die Gesamtvergrößerung jedes Objektivs mit dem 10-fachen Okular; verwenden Sie $d = \lambda / (2 \text{ NA})$ mit $\lambda = 550\text{ nm}$, um die Auflösung aller vier Objektive, einschließlich des Ölimmersionsobjektivs, zu berechnen; schätzen Sie den Durchmesser einer Epithelzelle ab, indem Sie sie mit dem Sehfeld vergleichen; entscheiden Sie anhand dieser Zahlen, welche Objekte in Tabelle 2 die einzelnen Objektive auflösen können und welche nicht; und erklären Sie, woran Lugol bindet und warum der Zellkern mehr davon aufnimmt als das Zytoplasma.
12. Klasse / College-Niveau
- Fokus Kontrast als die eigentliche Begrenzung der Lichtmikroskopie und das Design einer Präparation.
- Aktivitäten: Erläutern Sie unter Berücksichtigung von Absorption und Brechungsindex, warum eine ungefärbte Zelle im Hellfeld nahezu unsichtbar ist, und beschreiben Sie, wie der Phasenkontrast oder der Differentialinterferenzkontrast das Bild ohne Färbung wiederherstellt; erläutern Sie die Rolle des Immersionsöls bei der Erhöhung der numerischen Apertur über 1 und berechnen Sie die dadurch gewonnene Auflösung; unterscheiden Sie zwischen einer scheinbaren Vergrößerung und einer tatsächlichen Steigerung des Auflösungsvermögens; begründen Sie die Wahl eines Färbemittels für dieses Präparat und vergleichen Sie Lugol mit Methylenblau sowie mit einer Gram-Färbung, wobei Sie angeben, was jeweils sichtbar würde; und legen Sie dar, wie die Probe präpariert und ausgezählt werden müsste, damit eine Aussage über die Bakterienhäufigkeit im Speichel vertretbar wäre.
Labor-Grundausstattung
Instrumente
- Durchlichtmikroskop mit Beleuchtung und vier Objektiven: Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65 und Plan 100/1,25 Öl (unbenutzt), mit einem 10× Okular
- Mikroskopie-Objektträger (2)
- Deckgläser (2)
- Pinzette
- Tropfer
- Becherglas (50 mL)
- Saugfähiges Papiertuch zum Abtupfen der überschüssigen Flüssigkeit
Produkte
- Menschlicher Speichel in Suspension
- Lugols Jodlösung 2 %