Ślina wygląda jak woda, ale wcale nią nie jest. Około 99 % jej składu stanowi woda, a pozostałe 1 % pełni kluczową rolę: elektrolity, które chronią jamę ustną przed działaniem kwasów, mucyny, które sprawiają, że płyn jest śliski, lizozym i immunoglobulina A, które ograniczają rozwój bakterii, oraz α-amylaza, która rozpoczyna trawienie skrobi jeszcze przed połknięciem pokarmu. W płynie tym zawieszona jest populacja cząstek stałych — płaskie komórki płaskonabłonkowe złuszczone z błony śluzowej jamy ustnej, ogromne ilości bakterii, resztki pokarmu oraz pasma śluzu. Kropla tego płynu pod mikroskopem to jeden z najszybszych sposobów, by pokazać studentowi, że płyn ustrojowy jest zawiesiną komórek, a nie przezroczystą cieczą, a także stanowi dobre wprowadzenie do głównego problemu mikroskopii świetlnej: żywe komórki są przezroczyste, więc samo ich powiększenie nie wystarczy. Trzeba zapewnić im kontrast. W tym laboratorium przygotujecie dwa preparaty z tej samej próbki śliny: jeden zwykły, a drugi z dodaną kroplą jodu Lugola, a następnie zbadacie oba przy użyciu tych samych trzech obiektywów o powiększeniu 40×, 100× i 400×. Celem ćwiczenia jest porównanie obu preparatów przy tym samym powiększeniu, a nie samo powiększenie: preparat bez barwnika pokazuje, jak niewiele widać bez barwienia, a preparat zabarwiony pokazuje, co ujawnia barwnik.
Cele edukacyjne
Działanie mikroskopu złożonego
- Włącz instrument oraz jego oświetlacz i wyjaśnij, dlaczego światło przechodzące od dołu jest odpowiednie dla przezroczystego preparatu.
- Zmień obiektywy w odpowiedniej kolejności, od 40× w górę, i po każdej zmianie ustaw ostrość za pomocą śruby zgrubnej.
Zrozumienie powiększenia i rozdzielczości
- Oblicz całkowite powiększenie jako iloczyn obiektywu i dziesięciokrotnego okularu, a dwie liczby wyryte na obiektywie odczytaj jako powiększenie i aperture numeryczną.
- Wyjaśnij, dlaczego najwyższy obiektyw nie zawsze jest tym właściwym na początek oraz dlaczego powiększenie przekraczające zdolność rozdzielczą soczewki nic nie wnosi.
Przygotowanie preparatu mokrego
- Umieść kroplę na szkiełku podstawowym, opuść szkiełko nakrywkowe bez uwięzienia powietrza i odsącz nadmiar, tak aby szkiełko nakrywkowe spoczywało płasko.
- Przygotuj dobraną parę szkiełek różniących się pod jednym względem, tak aby efekt barwienia można było przypisać barwnikowi.
Użycie środka cieniującego
- Dodaj jod Lugola do drugiego szkiełka i opisz, co staje się widoczne, a czego wcześniej nie było widać.
- Barwnik działa poprzez pochłanianie światła w jednych strukturach silniej niż w innych, a w tym procesie zabija komórki.
Identyfikacja zawartości próbki
- Rozpoznawaj komórki nabłonka płaskiego po ich wielkości i kształcie oraz odróżniaj je od nici śluzu, detrytusu i bakterii.
- Oddziel to, co należy do żywego organizmu, od tego, co do niego nie należy, i bądź szczerzy co do tego, których małych obiektów nie da się zidentyfikować w tej rozdzielczości.
Rejestrowanie i zgłaszanie obserwacji
- Zapisz obraz przy każdym powiększeniu i opisz go, podając preparat oraz użyty obiektyw.
- Napisz opis podający powiększenie, to, co zaobserwowano, oraz to, czego nie udało się rozpoznać.
Protokół
Przed tobą znajduje się mikroskop optyczny z 4 obiektywami. W celu ułatwienia użytkowania niektóre funkcje zostały wyłączone i są wykorzystywane w bardziej zaawansowanych laboratoriach.
Należy pamiętać, że całkowite powiększenie oblicza się, mnożąc powiększenie obiektywu (na przykład 4x) przez powiększenie okularu. Mikroskop używany w tym laboratorium ma okular o powiększeniu 10x. Na przykład, obiektyw o powiększeniu 4x da całkowite powiększenie 40x.
Przygotowanie
1. Włącz mikroskop, naciskając przełącznik znajdujący się z przodu urządzenia. W ten sposób włączysz oświetlacz, dzięki czemu światło przechodzące przechodzi przez preparat od dołu, co jest idealnym rozwiązaniem w przypadku preparatów przezroczystych.
2. Połóż dwa czyste szkła mikroskopowe na swoim stanowisku pracy.
Przygotowanie pierwszego slajdu
1. Umieść kroplę śliny na pierwszym szkiełku.
2. Przykryj preparat szkiełkiem nakrywkowym.
3. Delikatnie osusz nadmiar śliny papierowym ręcznikiem.
Przygotowanie drugiej zjeżdżalni
1. Umieść kroplę śliny na drugim szkiełku mikroskopowym.
2. Umieść kroplę Lugola na tym samym szkiełku.
3. Przykryj preparat szkiełkiem nakrywkowym.
4. Ostrożnie osusz nadmiar płynu Lugola papierem chłonnym.
Obserwacje
Obserwacja pierwszego preparatu (tylko ślina)
Umieść pierwszy preparat na stoliku mikroskopu.
2. Kliknij przycisk «Mikroskop« na tablecie, aby wyświetlić obraz z mikroskopu.
Możesz zapisać obraz obserwowanego widoku, klikając przycisk «Zapisz obraz« znajdujący się w lewej dolnej części sekcji «Mikroskop«.
3. Dostosuj powiększenie, dotykając obiektywów mikroskopu. Rozpocznij obserwację przy powiększeniu 40x (czerwony obiektyw – oznaczony Plan 4/0.10).
4. Wyostrz obraz za pomocą pokręteł do zgrubnej regulacji, znajdujących się po lewej i prawej stronie mikroskopu.
5. Stopniowo zwiększaj powiększenie z 40x do 100x (żółty obiektyw – oznaczony Plan 10/0,25), a następnie do 400x (niebieski obiektyw – oznaczony Plan 40/0,65), dostosowując w razie potrzeby ostrość.
Uwaga: Powiększenie 1000x (obiektyw biały – oznaczony jako Plan 100/1,25) wymaga zastosowania oleju między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym. Z tego powodu nie używamy tego obiektywu w naszym laboratorium.
Obserwacja drugiej szkiełka (ślina i Lugol)
1. Zamień pierwszy slajd na drugi, zawierający ślinę i Lugola.
2. Zaczynając od powiększenia 100X (obiektyw żółty – oznaczony Plan 10/0,25), zanotuj obecność jąder komórkowych, które powinny być zabarwione na brązowo przez odczynnik Lugola.
Nie zapomnij zanotować ważnych spostrzeżeń!
Wyłącz mikroskop
1. Wyłącz mikroskop, naciskając przycisk na przedniej części urządzenia.
Pytania do refleksji
1. Co zauważasz na niebarwionym preparacie śliny (bez Lugola)?
2. Jaki jest cel użycia jodyny Lugola w eksperymencie?
3. Która część komórki staje się bardziej widoczna po dodaniu Lugola i dlaczego?
4. Dlaczego należy zawsze rozpoczynać obserwację od niskiego powiększenia (40x), zanim przejdzie się do 100x lub 400x?
5. Na podstawie Twoich obserwacji, które struktury w ślinie należą do organizmu żywego (komórki ludzkie), a które są elementami nieożywionymi (śluz, resztki itp.)?
6. Dla każdego powiększenia porównaj to, co widzisz na preparatach ze śliną, z publikowanym zdjęciem referencyjnym nabłonka policzka (patrz zdjęcie referencyjne dostarczone do tego ćwiczenia laboratoryjnego). Ten protokół nie uwzględnia przygotowania rozmazu z policzka, dlatego porównania dokonuje się z materiałem referencyjnym, a nie z samodzielnie przygotowanym preparatem.
Zdjęcie referencyjne — nabłonek policzka. To laboratorium przygotowuje wyłącznie preparaty ze śliny; nie pobiera wymazu z policzka. Na pytanie 6 odpowiada się w oparciu o opublikowaną referencyjną mikrofotografię nabłonka policzka, którą nauczyciel dostarcza wraz z instrukcją do laboratorium. Co w niej wskazać: komórki policzka występują jako duże, płaskie, nienaruszone komórki wielokątne, często w warstwach, każda z jednym wyraźnie widocznym okrągłym jądrem i czystym tłem. Ślina natomiast zawiera komórki, które już uległy złuszczeniu — rozproszone, zwinięte lub uszkodzone, wymieszane z pasmami śluzu, bakteriami i resztkami pokarmowymi. Komórki są tego samego typu; różnią się ich stanem oraz tym, co je otacza.
Przewidywane wyniki
Wyniki znajdują się w tym dokumencie (PDF)
Oba szkiełka zawierają tę samą ślinę. To, co zmienia się między nimi, to kontrast, a to, co zmienia się między obiektywami, to jak mały detal można odróżnić od sąsiedniego. Pierwsza tabela podaje dla każdego obiektywu w symulacji numery na nim wygrawerowane oraz to, czego można się po nim spodziewać na każdym z dwóch szkiełek.
| Cel | Całkowite powiększenie | Rozwiązany najmniejszy detal | Pole widzenia | Preparat świeżej śliny | Szkiełek ze śliną i płynem Lugola |
|---|---|---|---|---|---|
| Plan 4 / 0,10 (czerwony) | 40× | około 2,8 µm | około 4,5 mm | Blady, prawie pusty obszar. Rozproszone szare plamki i ciemne, okrągłe kontury uwięzionych pęcherzyków powietrza są najbardziej widocznymi obiektami; komórki są ledwo wyczuwalne | Pole nabiera żółtobrązowego odcienia jodyny, a gęstsze skupiska materiału stają się widoczne jako ciemniejsze plamy |
| Plan 10 / 0,25 (żółty) | 100× | około 1,1 µm | około 1,8 mm | Niewyraźne, nieregularne zarysy płaskich komórek i szary, ziarnisty detrytus; nadal bardzo niski kontrast | Obrysy komórek odznaczają się na żółto-zielonym tle, a jądra komórkowe jawią się jako małe brązowe kropki — to właśnie przy tym powiększeniu barwienie zaczyna przynosić efekt |
| Plan 40 / 0,65 (niebieski) | 400× | około 0,42 µm | około 0,45 mm | Jedna lub dwie komórki wypełniają większą część pola jako bladoszare zarysy, otoczone ziarnistym materiałem; jądra komórkowe są trudne do rozróżnienia | Pole widzenia wypełnia pojedyncza zabarwiona komórka: brązowo-zielona cytoplazma o widocznej ziarnistości oraz wyraźnie ciemniejsze, zaokrąglone jądro |
| Plan 100 / 1,25 olej | 1000× | około 0,22 µm | około 0,18 mm | Nieużywane w tym laboratorium: obiektyw wymaga olejku imersyjnego między soczewką a szkiełkiem nakrywkowym i jest wyłączony w symulacji | Nieużywany |
Druga tabela zawiera listę tego, co faktycznie znajduje się w próbie, wraz z rozmiarem każdego obiektu, dzięki czemu uczeń może zdecydować na podstawie samych liczb, który obiektyw jest potrzebny, aby go zobaczyć.
| Co jest w zrzucie | Typowy rozmiar | Niefarbowane | Po Lugolu |
|---|---|---|---|
| Komórka nabłonka płaskiego złuszczona z wyściółki jamy ustnej | o szerokości od 50 do 70 µm, bardzo cienkie i płaskie | Niewyraźny, nieregularny zarys, łatwy do przeoczenia, ponieważ komórka jest prawie tak samo przezroczysta jak otaczająca ją woda | Wyraźnie wyodrębniona komórka wielokątna, cytoplazma zabarwiona na kolor od brązowo-żółtego do oliwkowego |
| Jądro tej komórki | od 8 do 12 µm | Prawie nie do odróżnienia od cytoplazmy | Najbardziej oczywista cecha slajdu: kompaktowe, wyraźnie ciemnobrązowe ciałko w pobliżu środka |
| Nici śluzu | Nieregularne, o długości od dziesiątek do setek µm | Bardzo słabe, delikatne, często widoczne tylko tam, gdzie się marszczą | Są zabarwione i znacznie łatwiejsze do wykrycia; mają tendencję do wiązania w grudki zanieczyszczeń |
| Bakterie | Koki o wielkości około 1 µm, pałeczki o długości od 1 do 3 µm i szerokości około 0,5 µm | Niewidoczne przy powiększeniu 40×, co najwyżej poruszające się plamki przy 400× | Małe ciemne punkty przy powiększeniu 400×, na granicy rozdzielczości lub poza nią — w zasadzie możliwe do zliczenia, ale niemożliwe do zidentyfikowania |
| Resztki żywności i granulki | O kilka µm w górę | Szary materiał ziarnisty – najbardziej rzucający się w oczy element na płaskim slajdzie | Wyraźnie zabarwia się w miejscach, gdzie występuje skrobia, ponieważ jod jest odczynnikiem do wykrywania skrobi |
| Pęcherzyki powietrza pod szkiełkiem nakrywkowym | Od kilkudziesięciu do kilkuset µm | Ostry, bardzo ciemny, idealnie okrągły zarys — artefakt, nie struktura | Bez zmian; plama nie pozostawia śladu na bańce, co stanowi przydatny sposób jej rozpoznania |
Dwie liczby na obiektywie i co każda z nich oznacza. Całkowite powiększenie jest iloczynem dwóch soczewek w układzie: M = Mcel × Mokular, więc obiektyw 4× w połączeniu z okularem mikroskopu o powiększeniu 10× daje powiększenie 40×, a obiektyw 40× daje powiększenie 400×. Samo powiększenie powoduje jednak jedynie powiększenie obrazu; to, czy dwa sąsiadujące punkty pozostają rozróżnialne, zależy od drugiej liczby, czyli apertury numerycznej. Kryterium Abbego podaje najmniejszy rozdzielalny odstęp jako d = λ / (2 NA). Przyjmując λ = 550 nm, czyli wartość w środku zakresu widzialnego, obiektyw 0,10 daje d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, czyli około 2,8 µm; obiektyw o powiększeniu 0,25 zapewnia około 1,1 µm; a obiektyw o powiększeniu 0,65 zapewnia około 0,42 µm. Komórka nabłonkowa o wielkości 60 µm jest wyraźnie rozdzielana przez wszystkie trzy obiektywy, podobnie jak jej jądro o wielkości 10 µm, ale bakteria o wielkości 1 µm przekracza możliwości pierwszego obiektywu, jest na granicy rozdzielczości drugiego i ledwo mieści się w zakresie rozdzielczości trzeciego. Zwiększenie powiększenia okularowego spowodowałoby powiększenie obrazu bez dodania szczegółów — byłoby to „puste powiększenie” — dlatego obiektyw z immersją olejową, którego liczba apertury (NA) wynosząca 1,25 rzeczywiście pozwala na rozróżnienie drobniejszych szczegółów, jest jedyną metodą umożliwiającą prawidłowe obserwowanie bakterii.
Dlaczego zaczyna się od niskiej mocy?. Pole widzenia zmniejsza się proporcjonalnie do powiększenia obiektywu: przy liczbie pola wynoszącej 18 widoczna średnica wynosi w przybliżeniu 18 / Mcel, co daje około 4,5 mm przy powiększeniu 40×, 1,8 mm przy 100× i 0,45 mm przy 400×. Przy powiększeniu 400× obserwuje się mniej niż pół milimetra preparatu o szerokości 20 mm, więc jeśli zacznie się od tego powiększenia, prawie na pewno będzie się patrzeć na pustą przestrzeń w płynie. Głębia ostrości zmniejsza się jednocześnie wraz z wartością NA, więc obiektyw o wyższym powiększeniu jest również trudniejszy do ustawienia ostrości. Znalezienie preparatu przy powiększeniu 40×, wycentrowanie go, a dopiero potem przechodzenie na obiektywy o większym powiększeniu nie jest formalnością; jest to jedyny efektywny sposób pracy.
Co tak naprawdę robi płyn Lugola. Roztwór Lugola to jod rozpuszczony w jodku potasu w postaci jonów trijodku. Najbardziej znany jest jako odczynnik do barwienia skrobi — trijodek uwięziony wewnątrz helisy amylozy nadaje jej charakterystyczny niebiesko-czarny kolor — i właśnie dlatego resztki żywności na szkiełku mogą ulec silnemu zabarwieniu. W przypadku samych komórek roztwór ten działa raczej jako ogólny barwnik kontrastowy niż specyficzny: jod wiąże się z glikogenem i białkami, a ponieważ jądro komórkowe stanowi miejsce o największym zagęszczeniu makrocząsteczek w komórce, pochłania ono więcej barwnika niż otaczająca je cienka cytoplazma i jawi się jako wyraźnie ciemniejsze, brązowe ciało. Na tym polega cały mechanizm i warto jasno wyjaśnić uczniom, że nie ma tu mowy o specyficzności chemicznej: preparat komórek policzkowych w szkolnym laboratorium jest częściej barwiony błękitem metylenowym, który wiąże się z kwasami nukleinowymi i nadaje jądru komórkowemu czystszy niebieski kolor. Cena każdego z tych barwników jest taka sama: zabijają one komórkę, więc nic, co widać na drugim preparacie, nie jest żywe.
Podsumowanie zadania według zakresu ocen
Klasy 9–10
- Skupienie: prawidłowa obsługa mikroskopu i przekonanie się na własne oczy, do czego służy barwnik.
- Aktywności: przygotuj oba preparaty i obejrzyj każdy z nich przy powiększeniu 40×, 100× i 400×; zapisz i opisz zdjęcie przy każdym powiększeniu; narysuj obok siebie to, co widać na każdym preparacie przy powiększeniu 400×; nazwij zidentyfikowane struktury i wskaż, których obiektów nie udało się zidentyfikować; wyjaśnij w jednym zdaniu, dlaczego drugi preparat jest łatwiejszy do odczytania; oraz podaj zasadę dotyczącą kolejności stosowania obiektywów.
Klasa 11
- Skupienie: ilościowa strona mikroskopii — powiększenie, apertura numeryczna i pole widzenia.
- Aktywności: oblicz całkowite powiększenie każdego obiektywu z okularem 10×; użyj wzoru d = λ / (2 NA) dla λ = 550 nm, aby obliczyć zdolność rozdzielczą wszystkich czterech obiektywów, w tym obiektywu immersyjnego olejowego; oszacuj średnicę komórki nabłonkowej, porównując ją z polem widzenia; na podstawie tych liczb oceń, które obiekty z Tabeli 2 każdy obiektyw może, a których nie może rozdzielić; oraz wyjaśnij, z czym wiąże się Płyn Lugola i dlaczego jądro komórkowe pochłania go w większym stopniu niż cytoplazma.
Klasa 12 / Poziom akademicki
- Skupienie: kontrast jako rzeczywiste ograniczenie mikroskopii świetlnej oraz projekt preparatu.
- Aktywności: Niewarczona komórka jest prawie niewidzialna w jasnym polu, ponieważ większość komórek biologicznych składa się głównie z wody i ma współczynnik załamania światła bardzo zbliżony do otaczającego je środowiska wodnego. Powoduje to minimalną absorpcję światła (komórki są niemal przezroczyste), a niewielkie różnice w gęstości lub grubości wywołują jedynie przesunięcia fazowe przechodzących przez nią fal świetlnych, a nie zmiany amplitudy czy długości fali, których ludzkie oko lub czujnik aparatu nie potrafią bezpośrednio zarejestrować. Kontrast fazowy przekształca te niewidoczne przesunięcia fazowe fal świetlnych przechodzących przez próbkę w widoczne zmiany amplitudy (natężenia światła) za pomocą pierścienia fazowego w obiektywie i przesłony pierścieniowej w kondensorze, dzięki czemu struktury o różnym współczynniku załamania stają się jasne lub ciemne na szarym tle. Z kolei różnicowo-interferencyjny kontrast (DIC) wykorzystuje pryzmaty Nomarskiego do rozszczepienia spolaryzowanego światła na dwie wiązki, które przechodzą przez sąsiadujące punkty próbki o minimalnie różniących się grubościach lub współczynnikach załamania; po ponownym połączeniu wiązek dochodzi do interferencji, co daje trójwymiarowy obraz reliefowy. Olejek imersyjny podnosi numeryczną aperturę (NA) powyżej 1, ponieważ ma współczynnik załamania światła (zazwyczaj ok. 1,515) zbliżony do szkiełka nakrywkowego i szkiełka obiektywu, co zapobiega załamywaniu i rozpraszaniu światła na granicy szkła i powietrza. Dzięki temu zbiera on znacznie więcej stożków światła o dużych kątach wychodzących z próbki, które w przeciwnym razie uległyby całkowitemu odbiciu. Uzyskaną rozdzielczość ($d$) oblicza się ze wzoru Abbego: $d = \frac{\lambda}{2 \text{NA}}$, gdzie $\lambda$ to długość fali światła, a $\text{NA} = n \sin\theta$ (gdzie $n$ to współczynnik załamania ośrodka, a $\theta$ to połowa kąta apertura obiektywu). Zastosowanie olejku o wyższym $n$ bezpośrednio zwiększa $\text{NA}$, zmniejszając wartość $d$, co pozwala rozróżnić mniejsze odległości między dwoma punktami. Puste powiększenie to sytuacja, w której obraz jest powiększany optycznie lub cyfrowo bez jednoczesnego wzrostu numerycznej apertury, co prowadzi do uzyskania większego, ale rozmytego obrazu, który nie ujawnia żadnych nowych detali anatomicznych. Prawdziwy wzrost zdolności rozdzielczej wymaga zwiększenia NA (np. poprzez użycie olejku imersyjnego lub obiektywu o większej aperturze), co faktycznie pozwala rozróżnić drobniejsze szczegóły. Wybór barwnika do próbek śliny zależy od celu badania: błękit metylenowy jest idealny do ogólnego barwienia morfologicznego bakterii i komórek nabłonka, ponieważ łatwo barwi jądra komórkowe i ściany komórkowe, dając wysoki kontrast w jasnym polu. Lugol (płyn Lugola) stosuje się głównie do wykrywania struktur polisacharydowych, takich jak skrobia (barwi się na granatowo), ale w bakteriologii służy jako zaprawa w barwieniu metodą Grama. Barwienie metodą Grama pozwala rozróżnić bakterie Gram-dodatnie (barwią się na fioletowo dzięki grubej warstwie peptydoglikanu) od Gram-ujemnych (barwią się na różowo/czerwono). Aby oszacowanie liczebności bakterii w ślinie było metodologicznie obronne, próbka śliny musi zostać pobrana w znormalizowany sposób (np. ślina stymulowana o określonej porze dnia), dokładnie rozcieńczona w seryjnych rozcieńczeniach buforowych w celu uzyskania zliczalnych kolonii, a następnie wysiana na odpowiednie podłoże agarowe lub naniesiona na komorę hemocytometryczną (np. komorę Neubauera) w celu zliczenia bezpośredniego pod mikroskopem. Dla wiarygodności statystycznej konieczne jest wykonanie wielu powtórzeń technicznych i biologicznych, a także zastosowanie odpowiednich metod wykluczania błędów (np. martwych komórek za pomocą barwienia żywotności), aby ekstrapolacja do całkowitej liczby komórek w mililitrze śliny była statystycznie istotna.
Podstawowe wyposażenie laboratorium
Instrumenty
- Mikroskop złożony z oświetlaczem i czterema obiektywami: Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65 oraz Plan 100/1,25 olejowy (nieużywany), z okularem 10×
- Szkiełka mikroskopowe (2)
- Szkiełka nakrywkowe (2)
- Pęseta
- Kroplomierze
- Zlewka (50 mL)
- Chłonny ręcznik papierowy do odsączania nadmiaru płynu
Produkty
- Ludzka ślina w zawiesinie
- Roztwór jodu Lugola 2 %