La salive ressemble à de l'eau, mais elle n'en est pas pour autant. Elle est composée à environ 99 % d'eau, et le 1 % restant remplit plusieurs fonctions : des électrolytes qui protègent la bouche contre l’acidité, des mucines qui rendent le liquide glissant, du lysozyme et de l’immunoglobuline A qui limitent la prolifération bactérienne, ainsi que de l’α-amylase, qui commence à digérer l’amidon avant même que les aliments ne soient avalés. En suspension dans ce liquide se trouve une population de particules solides : des cellules squameuses plates provenant de la muqueuse buccale, des bactéries en nombre considérable, des débris alimentaires et des filaments de mucus. En observer une goutte au microscope est l’un des moyens les plus rapides de montrer à un étudiant qu’un fluide corporel est une suspension de cellules plutôt qu’un liquide limpide, et c’est également une bonne introduction au problème central de la microscopie optique : les cellules vivantes sont transparentes, il ne suffit donc pas de les agrandir. Il faut leur apporter du contraste. Dans ce laboratoire, vous préparerez deux lames à partir du même échantillon de salive, l’une non colorée et l’autre à laquelle vous ajouterez une goutte d’iode de Lugol, puis vous les examinerez toutes les deux à l’aide des trois mêmes objectifs : 40×, 100× et 400×. C’est la comparaison entre les deux lames au même grossissement, plutôt que le grossissement lui-même, qui constitue l’intérêt de cet exercice : la lame non colorée montre à quel point peu de détails sont visibles sans coloration, tandis que la lame colorée montre ce que la coloration permet de révéler.
Objectifs Éducatifs
Fonctionnement d'un microscope composé
- Allumez l'instrument et son éclairage, et expliquez pourquoi la lumière transmise par le dessous convient à un spécimen transparent.
- Changez d'objectifs dans le bon ordre, à partir de 40× vers le haut, et faites la mise au point avec la vis macrométrique après chaque changement.
Compréhension du grossissement et de la résolution
- Calculez le grossissement total comme le produit de l'objectif et de l'oculaire 10×, et lisez les deux chiffres gravés sur un objectif comme le grossissement et l'ouverture numérique.
- Expliquez pourquoi l'objectif le plus puissant n'est pas toujours le bon pour commencer, et pourquoi un grossissement supérieur au pouvoir de résolution de la lentille n'apporte rien.
Préparation d'une préparation humide
- Déposez une goutte sur une lame, abaissez une lamelle sans emprisonner d'air et épongez l'excédent pour que la lamelle soit bien à plat.
- Préparez une paire de diapositives assorties qui ne diffèrent que par un seul aspect, afin que l'effet de la coloration puisse être attribué à la coloration.
Utilisation d'un agent de contraste
- Ajoutez de l'iode de Lugol à la deuxième lame et décrivez ce qui devient visible qui ne l'était pas auparavant.
- Un colorant agit en absorbant la lumière dans certaines structures plus que dans d'autres, et il tue les cellules au cours de ce processus.
Identification des composants de l'échantillon
- Reconnaître les cellules épithéliales squameuses par leur taille et leur forme, et les distinguer des filaments de mucus, des débris et des bactéries.
- Distinguez ce qui appartient à un organisme vivant de ce qui n'en fait pas partie, et indiquez en toute honnêteté quels sont les petits objets qui ne peuvent pas être identifiés à cette résolution.
Enregistrement et signalement des observations
- Enregistrez une image à chaque grossissement et étiquetez-la avec la lame et l'objectif utilisés.
- Rédiger une description qui indique le grossissement, ce qui a été vu et ce qui n'a pas pu être résolu.
Protocole
Devant vous se trouve un microscope optique doté de 4 objectifs. Pour en faciliter l'utilisation, certaines fonctionnalités sont désactivées et réservées à des laboratoires plus avancés.
Veuillez noter que le grossissement total est calculé en multipliant le grossissement de l'objectif (par exemple, 4x) par celui de l'oculaire. Le microscope utilisé dans ce laboratoire possède un oculaire de grossissement 10x. Par exemple, un objectif de grossissement 4x donnera un grossissement total de 40x.
Préparation
1. Allumez le microscope en appuyant sur l'interrupteur situé à l'avant de l'appareil. Vous allumerez ainsi le rétroéclairage, de sorte que la lumière transmise traverse l'échantillon par le dessous, ce qui est idéal pour les échantillons transparents.
2. Placez deux lames propres sur votre zone de travail.
Préparation de la première diapositive
1. Placez une goutte de salive sur la première lame.
2. Couvrir la lame avec une lamelle.
3. Tamponnez délicatement l'excès de salive avec du papier absorbant.
Préparation de la deuxième diapositive
1. Placez une goutte de salive sur la deuxième lame.
2. Placez une goutte de Lugol sur cette même lame.
Couvrez la lame avec une lamelle.
4. Essuyez délicatement l'excès de Lugol avec du papier absorbant.
Observations
Observation de la première lame (salive uniquement)
1. Placez la première lame sur la platine du microscope.
2. Cliquez sur le bouton « Microscope « sur la tablette pour afficher l'image du microscope.
Vous pouvez enregistrer une image de la vue observée en cliquant sur le bouton « Enregistrer l'image «, situé dans la partie inférieure gauche de la section « Microscope «.
3. Ajustez le grossissement en touchant les objectifs du microscope. Commencez l'observation à un grossissement de 40x (objectif rouge – étiqueté Plan 4/0.10).
4. Affinez la mise au point à l'aide des vis micrométriques situées sur la gauche et la droite du microscope.
5. Augmentez progressivement le grossissement de 40x à 100x (objectif jaune – étiqueté Plan 10/0.25), puis à 400x (objectif bleu – étiqueté Plan 40/0.65), en ajustant la mise au point si nécessaire.
Note : Un grossissement de 1000x (objectif à immersion – étiqueté Plan 100/1,25) nécessite l'utilisation d'huile entre l'objectif et la lamelle. Par conséquent, nous n'utilisons pas cet objectif dans ce laboratoire.
Observation de la deuxième lame (salive et Lugol)
1. Remplacez la première diapositive par la deuxième diapositive contenant la salive et le Lugol.
2. En commençant à un grossissement de 100x (objectif jaune – marqué Plan 10/0,25), notez la présence des noyaux cellulaires, qui devraient apparaître colorés en brun par le Lugol.
N'oubliez pas de noter les observations importantes !
Éteindre le microscope
1. Éteignez le microscope en appuyant sur l'interrupteur situé à l'avant de l'appareil.
Questions d'observation
1. Que remarquez-vous sur la lame de salive non colorée (sans Lugol) ?
2. Quel est le but du Lugol dans l'expérience ?
3. Quelle partie de la cellule devient plus visible après l'ajout de Lugol, et pourquoi ?
4. Pourquoi doit-on toujours commencer l'observation à faible grossissement (40x) avant de passer à 100x ou 400x ?
5. D'après vos observations, quelles structures dans la salive appartiennent à un être vivant (cellules humaines) et quels sont les éléments non vivants (mucus, débris, etc.) ?
6. Pour chaque grossissement, comparez ce que vous voyez dans vos préparations de salive avec une image de référence publiée de l'épithélium buccal (voir l'image de référence fournie avec ce TP). Ce protocole ne prépare pas de frottis buccal, la comparaison se fait donc par rapport à la référence et non par rapport à une lame que vous auriez préparée vous-même.
Image de référence — épithélium de la joue. Ce laboratoire prépare uniquement des lames de salive ; il ne prélève pas de frottis buccal. La question 6 trouve sa réponse à l'aide d'une photomicrographie de référence publiée de cellules épithéliales buccales, que l'enseignant fournit avec le laboratoire. Ce qu'il faut y souligner : les cellules buccales se présentent sous forme de grandes cellules polygonales, plates et intactes, souvent en amas, chacune avec un noyau rond clairement visible et un fond propre. La salive, en revanche, contient des cellules qui ont déjà desquamées — éparpillées, repliées ou brisées, mélangées à des filaments de mucus, des bactéries et des débris alimentaires. Il s'agit du même type de cellules ; ce qui diffère, c'est leur état et leur environnement.
Résultats attendus
Les résultats figurent dans ce document (PDF)
Les deux lames présentent la même salive. Ce qui varie entre elles, c'est le contraste ; ce qui varie d'un objectif à l'autre, c'est la taille minimale d'un détail pouvant être distingué de son voisin. Le premier tableau indique, pour chaque objectif de la simulation, les chiffres qui y sont gravés et ce qu'il devrait permettre de voir sur chacune des deux lames.
| Objectif | Grossissement total | Les moindres détails sont mis en évidence | Champ de vision | Lame de salive pure | Lame de salive + solution de Lugol |
|---|---|---|---|---|---|
| Plan 4 / 0,10 (rouge) | 40× | environ 2,8 µm | environ 4,5 mm | Un champ pâle, presque vide. Des taches grises éparses et les contours circulaires sombres des bulles d'air emprisonnées constituent les éléments les plus visibles ; les cellules sont à peine perceptibles. | Le champ prend la teinte jaune-brun de l'iode et les amas de matière plus denses deviennent visibles sous forme de taches plus sombres |
| Plan 10 / 0,25 (jaune) | 100× | environ 1,1 µm | environ 1,8 mm | Contours irréguliers et flous de cellules aplaties et débris granulaires gris ; contraste toujours très faible | Les contours des cellules se détachent sur un fond jaune-vert et les noyaux apparaissent sous forme de petits points bruns — c'est à ce grossissement que le colorant commence à donner des résultats |
| Plan 40 / 0,65 (bleu) | 400× | environ 0,42 µm | environ 0,45 mm | Une ou deux cellules occupent une grande partie du champ sous forme de contours gris pâle, entourées d'une substance granuleuse ; les noyaux sont difficiles à distinguer | Une seule cellule colorée occupe tout le champ : cytoplasme brun-vert présentant une granularité visible et un noyau arrondi nettement plus foncé |
| Formule 100 / Huile 1,25 | 1000× | environ 0,22 µm | environ 0,18 mm | Non utilisé dans ce laboratoire : l'objectif nécessite de l'huile à immersion entre la lentille et la lamelle et est désactivé dans la simulation | Non utilisé |
Le deuxième tableau énumère ce qui se trouve réellement dans l'échantillon, avec la taille de chaque objet, afin qu'un élève puisse décider, à partir des chiffres seuls, quel objectif est nécessaire pour l'observer.
| Qu'y a-t-il dans la goutte | Taille typique | Non taché | Après le Lugol |
|---|---|---|---|
| Cellule épithéliale malpighienne desquamée de la muqueuse buccale | de 50 à 70 µm de diamètre, très fin et plat | Un contour fin et irrégulier, facile à rater car la cellule est presque aussi transparente que l'eau qui l'entoure | Une cellule polygonale aux limites nettes, au cytoplasme teinté de brun-jaune à olive |
| Noyau de cette cellule | 8 à 12 µm | À peine distinguishable du cytoplasme | La caractéristique la plus évidente de la diapositive : un corps compact, nettement plus brun foncé près du centre |
| Brins de mucus | Irrégulier, long de dix à des centaines de µm | Très vagues, floconneux, souvent visibles seulement là où ils se froissent | Teinté et beaucoup plus facile à retracer ; ils ont tendance à maintenir ensemble des amas de débris |
| Bactéries | Coques d'environ 1 µm, bâtonnets de 1 à 3 µm de long et d'environ 0,5 µm de large | Invisibles à 40×, tout au plus des points minuscules en mouvement à 400× | Petits points sombres à 400×, à la limite de résolution ou au-delà — dénombrables en principe, non identifiables |
| Débris alimentaires et granulés | Quelques µm vers le haut | Matériau granulaire gris, la chose la plus visible sur la lame simple | Fortement coloré là où l'amidon est présent, puisque l'iode est un réactif de l'amidon |
| Des bulles d'air sous la lamelle | Des dizaines à des centaines de µm | Des contours nets, très sombres, parfaitement circulaires — un artefact, pas une structure | Inchangée ; une tache ne tache pas une bulle, ce qui est un moyen utile d'en identifier une |
Les deux chiffres sur l'objectif, et ce que chacun permet d'acheter. Le grossissement total est le produit des deux lentilles sur le trajet : M = Mobjectif × Moculaire, ainsi, l'objectif 4× combiné à l'oculaire 10× du microscope donne 40×, et l'objectif 40× donne 400×. Le grossissement seul, cependant, ne fait qu'agrandir l'image ; la capacité à distinguer deux points proches est déterminée par le second nombre, l'ouverture numérique. Le critère d'Abbe donne la plus petite séparation résoluble sous la forme d = λ / (2 NA). En prenant λ = 550 nm, au milieu du spectre visible, l'objectif de 0,10 donne d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, c'est-à-dire environ 2,8 µm ; l'objectif de 0,25 donne environ 1,1 µm ; et l'objectif de 0,65 donne environ 0,42 µm. Une cellule épithéliale de 60 µm est nettement résolue par les trois, son noyau de 10 µm également par les trois, mais une bactérie de 1 µm dépasse les capacités du premier, est à la limite pour le deuxième et tout juste accessible avec le troisième. Pousser le grossissement de l'oculaire plus loin agrandirait l'image sans ajouter de détails — un grossissement vide —, ce qui explique pourquoi l'objectif à immersion à l'huile, dont l'ouverture numérique de 1,25 résout réellement des détails plus fins, est le seul moyen de bien observer les bactéries.
Pourquoi vous commencez à faible puissance. Le champ de vision diminue proportionnellement au grossissement de l'objectif : avec un indice de champ de 18, le diamètre visible est d'environ 18 / Mobjectif, soit environ 4,5 mm à 40×, 1,8 mm à 100× et 0,45 mm à 400×. À 400×, vous observez moins d'un demi-millimètre d'une lame qui mesure 20 mm de large, donc si vous commencez par là, vous regarderez presque certainement du liquide vide. La profondeur de champ diminue en même temps avec l'ouverture numérique, ce qui rend également l'objectif le plus puissant plus difficile à mettre au point. Trouver le spécimen à 40×, le centrer, et seulement ensuite monter les objectifs n'est pas une formalité ; c'est la seule façon efficace de travailler.
Ce que fait réellement l'iode de Lugol. La solution de Lugol est de l'iode dissous dans de l'iodure de potassium sous forme d'ion triiodure. Elle est surtout connue comme réactif de l'amidon — le triiodure piégé à l'intérieur de l'hélice d'amylose donne la couleur bleu-noir familière — et c'est pourquoi les débris alimentaires sur la lame peuvent se colorer fortement. Sur les cellules elles-mêmes, elle agit comme un colorant de contraste général plutôt que spécifique : l'iode se lie au glycogène et aux protéines, et comme le noyau est la concentration la plus dense de macromolécules dans la cellule, il absorbe plus de colorant que le cytoplasme mince qui l'environne et apparaît comme un corps brun nettement plus foncé. C'est tout le mécanisme, et il vaut la peine d'expliquer clairement aux étudiants qu'aucune spécificité chimique n'est impliquée : une préparation de cellules buccales dans un laboratoire scolaire est plus souvent colorée au bleu de méthylène, qui se lie aux acides nucléiques et donne un noyau bleu plus net. Le prix à payer pour l'utilisation de l'un de ces colorants est le même : ils tuent la cellule, de sorte que rien de ce que l'on observe sur la lame n'est vivant.
Résumé du devoir par tranche d'âge
Classe de 3e à la 2de
- Focalisation utiliser correctement le microscope et voir par eux-mêmes à quoi sert une coloration.
- Activités : préparez les deux lames et observez chacune à 40×, 100× et 400× ; enregistrez et étiquetez une image à chaque grossissement ; dessinez ce qui est visible sur chaque lame à 400× côte à côte ; nommez les structures identifiées et indiquez quels objets n'ont pas pu être identifiés ; énoncez en une seule phrase pourquoi la deuxième lame est plus facile à lire ; et donnez la règle concernant l'ordre d'utilisation des objectifs.
11e année
- Focalisation le côté quantitatif de la microscopie — grossissement, ouverture numérique et champ de vision.
- Activités : calculez le grossissement total de chaque objectif avec l'oculaire 10× ; utilisez d = λ / (2 NA) avec λ = 550 nm pour déterminer la résolution des quatre objectifs, y compris celui à immersion dans l'huile ; estimez le diamètre d'une cellule épithéliale en le comparant au champ de vision ; déterminez à partir de ces chiffres quels objets du Tableau 2 chaque objectif peut ou ne peut pas résoudre ; et expliquez à quoi se lie le the Lugol et pourquoi le noyau en absorbe plus que le cytoplasme.
12e année / Niveau universitaire
- Focalisation le contraste comme limite réelle de la microscopie optique, et la conception d'une préparation.
- Activités : expliquer pourquoi une cellule non colorée est pratiquement invisible en champ clair, en termes d’absorption et d’indice de réfraction, et décrire comment le contraste de phase ou le contraste d’interférence différentielle permet de rendre l’image visible sans coloration ; expliquer le rôle de l’huile d’immersion dans l’augmentation de l’ouverture numérique au-delà de 1 et calculer le gain de résolution obtenu ; faire la distinction entre un grossissement fictif et une véritable augmentation du pouvoir de résolution ; justifier le choix d'un colorant pour cet échantillon et comparer le colorant de Lugol au bleu de méthylène et à la coloration de Gram, en précisant ce que chacun permettrait de mettre en évidence ; et exposer comment l'échantillon devrait être préparé et compté pour qu'une affirmation concernant l'abondance bactérienne dans la salive soit défendable.
Essentiels de laboratoire
Instruments
- Microscope composé avec illuminateur et quatre objectifs : Plan 4/0,10, Plan 10/0,25, Plan 40/0,65 et Plan 100/1,25 à immersion (non utilisé), avec un oculaire 10×
- Lames de microscope (2)
- Lamelles (2)
- Pince à épiler
- Gouttes
- Bécher (50 mL)
- Papier essuie-tout absorbant, pour éponger l'excès de liquide
Produits
- Salive humaine en suspension
- Solution d'iode de Lugol 2 %