Saliva arată ca apa, dar este cu totul altceva. Aproximativ 99 % din ea este apă, iar restul de 1 % îndeplinește funcțiile esențiale: electroliți care protejează cavitatea bucală împotriva acidului, mucine care conferă fluidului o consistență alunecoasă, lizozimă și imunoglobulină A care limitează dezvoltarea bacteriilor, precum și α-amilaza, care începe să digere amidonul înainte ca alimentele să fie înghițite. În acest fluid se află o populație de particule solide — celule scuamoase plate desprinse din mucoasa bucală, bacterii în număr enorm, resturi alimentare și fire de mucus. O picătură din acesta, observată la microscop, este una dintre cele mai rapide modalități de a arăta unui student că un fluid corporal este o suspensie de celule, mai degrabă decât un lichid limpede, și reprezintă, de asemenea, o bună introducere în problema centrală a microscopiei optice: celulele vii sunt transparente, așa că mărirea lor nu este suficientă. Trebuie să le oferiți contrast. În acest laborator veți pregăti două lamele din aceeași probă de salivă, una simplă și una cu o picătură de iod Lugol adăugată, și le veți examina pe amândouă prin aceleași trei obiective, de 40×, 100× și 400×. Comparația dintre cele două lamele la aceeași mărire, mai degrabă decât mărirea în sine, constituie scopul exercițiului: lama simplă arată cât de puțin se vede fără colorare, iar lama colorată arată ce revelează colorantul.
Obiective educaționale
Funcționarea unui microscop compus
- Porniți instrumentul și iluminatorul acestuia și explicați de ce lumina transmisă de jos este potrivită pentru un eșantion transparent.
- Schimbați obiectivele în ordinea corectă, începând de la 40× în sus, și refaceți focalizarea cu șurubul de mișcare macro după fiecare schimbare.
Înțelegerea măririi și a rezoluției
- Calculați mărirea totală ca produs al obiectivului și al ocularului de 10× și citiți cele două numere gravate pe un obiectiv ca mărire și deschidere numerică.
- Explicați de ce obiectivul cu cea mai mare mărire nu este întotdeauna cel mai potrivit pentru a începe și de ce mărirea dincolo de puterea de rezoluție a lentilei nu adaugă nimic.
Pregătirea unei preparate native
- Puneți o picătură pe o lamă, coborâți o lamelă fără a prinde aer și absorbiți excesul astfel încât lamela să stea plată.
- Pregătiți o pereche de lamele comparabile care diferă printr-un singur aspect, astfel încât efectul colorantului să poată fi atribuit colorantului.
Utilizarea unei substanțe de contrast
- Adăugați iod Lugol pe a doua lamă și descrieți ce devine vizibil și care nu era vizibil înainte.
- Un colorant acționează prin absorbția luminii în unele structuri mai mult decât în altele, ucigând celulele în acest proces.
Identificarea a ceea ce se află în probă
- Recunoașteți celulele epiteliale scuamoase după dimensiunea și forma lor și distingeți-le de firele de mucus, resturi și bacterii.
- Separă ceea ce aparține unui organism viu de ceea ce nu aparține și fii sincer în legătură cu care dintre obiectele mici nu pot fi identificate la această rezoluție.
Înregistrarea și raportarea observațiilor
- Salvați o imagine la fiecare mărire și etichetați-o cu lama și obiectivul utilizat.
- Scrieți o descriere care să indice mărirea, ce a fost observat și ce nu a putut fi rezolvat.
Protocol
În fața dumneavoastră se află un microscop optic cu 4 obiective. Pentru a ușura utilizarea, anumite funcționalități sunt dezactivate și sunt utilizate în laboratoare mai avansate.
Vă rugăm să rețineți că mărirea totală se calculează înmulțind mărirea obiectivului (de exemplu, 4x) cu cea a ocularului. Microscopul utilizat în acest laborator are un ocular cu mărire de 10x. De exemplu, un obiectiv cu o mărire de 4x va rezulta într-o mărire totală de 40x.
Pregătire
1. Porniți microscopul apăsând pe comutatorul din fața aparatului. Veți porni iluminatorul, astfel încât lumina transmisă să treacă prin eșantion de dedesubt, ceea ce este ideal pentru probe transparente.
2. Plasați două lame curate pe suprafața de lucru.
Pregătirea primului slide
1. Pune o picătură de salivă pe un lamă.
2. Acoperiți lamela cu o lamă de acoperire.
3. Tamponează cu grijă excesul de salivă cu hârtie absorbantă.
Pregătirea celui de-al doilea diapozitiv
1. Pune o picătură de salivă pe al doilea lamă.
2. Pune o picătură de Lugol pe același lamă.
3. Acoperiți lama cu o lamă de acoperire.
4. Tamponați cu grijă excesul de lugol cu hârtie absorbantă.
Observații
Observația primei lame (numai salivă)
1. Așezați prima lamă pe platina microscopului.
2. Apăsați butonul « Microscop « de pe tabletă pentru a vizualiza imaginea microscopului.
Puteți salva o imagine a vizualizării observate, făcând clic pe butonul « Salvare imagine «, situat în zona din stânga jos a secțiunii « Microscop «.
3. Reglați mărirea atingând obiectivele microscopului. Începeți observația la mărirea de 40x (obiectiv roșu - marcat Plan 4/0.10).
4. Rafinați focalizarea cu butoanele de reglaj grosier situate în stânga și în dreapta microscopului.
5. Măriți treptat mărirea de la 40x la 100x (obiectivul galben – etichetat Plan 10/0.25), apoi la 400x (obiectivul albastru – etichetat Plan 40/0.65), reglând focalizarea după cum este necesar.
Notă: O mărire de 1000x (obiectiv alb – etichetat Plan 100/1.25) necesită utilizarea uleiului între obiectiv și lamela de protecție. Prin urmare, nu folosim acest obiectiv în acest laborator.
Observarea celui de-al doilea preparat (salivă și Lugol)
1. Înlocuiți primul diapozitiv cu al doilea diapozitiv care conține saliva și lugolul.
2. Pornind de la mărire 100X (obiectivul galben – etichetat Plan 10/0.25), notați prezența nucleilor celulari, care ar trebui să apară colorați în maro de către Lugol.
* Nu uitați să notați observațiile importante!
Oprește microscopul
1. Opriți microscopul apăsând comutatorul din fața aparatului.
Întrebări de observație
1. Ce observați în lamela de salivă netratată (fără Lugol)?
2. Care este scopul Lugolului în experiment?
3. Ce parte a celulei devine mai vizibilă după adăugarea de Lugol și de ce?
4. De ce trebuie să începi întotdeauna observația la mărire mică (40x) înainte de a trece la 100x sau 400x?
5. Bazat pe observațiile dumneavoastră, care structuri din salivă aparțin unui organism viu (celule umane) și care sunt elemente neînsuflețite (mucozități, resturi etc.)?
6. Pentru fiecare mărire, comparați ceea ce vedeți în frotiurile dumneavoastră de saliva cu o imagine de referință publicată a epiteliului bucal (consultați imaginea de referință furnizată împreună cu acest laborator). Acest protocol nu pregătește un frotiu bucal, astfel încât comparația se face în raport cu referința și nu cu o lamă pe care ați făcut-o singur.
Imagine de referință — epiteliul jugal. Acest laborator pregătește doar frotiuri de salivă; nu prelevează o frotiu bucal. La Întrebarea 6 se răspunde pe baza unei microfotografii de referință publicate a celulelor epiteliale bucale, pe care profesorul o furnizează împreună cu laboratorul. Ce trebuie evidențiat în aceasta: celulele bucale apar ca celule poligonale mari, plate, intacte, adesea în foițe, fiecare având un nucleu rotund clar vizibil și un fundal curat. Saliva, prin contrast, conține celule care au fost deja exfoliate — dispersate, pliate sau rupte, amestecate cu fire de mucus, bacterii și resturi alimentare. Celule sunt de același tip; ceea ce diferă este starea lor și ceea ce le înconjoară.
Rezultate anticipate
Rezultatele se găsesc în acest document (PDF)
Ambele lame conțin aceeași salivă. Ceea ce se schimbă între ele este contrastul, iar ceea ce se schimbă între obiective este cât de mic detaliu poate fi separat de cel învecinat. Primul tabel prezintă, pentru fiecare obiectiv din simulare, numerele gravate pe acesta și ceea ce se preconizează că va arăta pe fiecare dintre cele două lame.
| Obiectiv | Magnificare totală | Cel mai mic detaliu rezolvat | Câmp vizual | Lamă simplă cu salivă | Lama cu salivă + Lugol |
|---|---|---|---|---|---|
| Planul 4 / 0,10 (roșu) | 40× | aproximativ 2,8 µm | aproximativ 4,5 mm | Un câmp palid, aproape gol. Pete cenușii răzlețe și contururile circulare întunecate ale bulelor de aer prinse sunt cele mai vizibile obiecte; celulele sunt abia detectabile | Câmpul capătă nuanța galben-maronie a iodului, iar aglomerările mai dense de material devin vizibile ca pete mai întunecate |
| Plan 10 / 0,25 (galben) | 100× | aproximativ 1,1 µm | aproximativ 1,8 mm | Contururi neregulate estompate de celule plate și resturi granuloase gri; în continuare contrast foarte scăzut | Contururile celulare ies în evidență pe un fundal galben-verde, iar nucleii apar ca mici puncte maronii — aceasta este mărirea la care colorația își arată prima dată utilitatea |
| Plan 40 / 0,65 (albastru) | 400× | aproximativ 0,42 µm | aproximativ 0,45 mm | Una sau două celule ocupă o mare parte din câmp sub formă de contururi de culoare gri pal, înconjurate de material granular; nucleii sunt greu de distins | O singură celulă colorată umple câmpul vizual: citoplasmă brun-verzuie cu granulație vizibilă și un nucleu rotund, în mod clar mai întunecat |
| Plan 100 / ulei 1.25 | 1000× | aproximativ 0,22 µm | aproximativ 0,18 mm | Neutilizat în acest laborator: obiectivul necesită ulei de imersie între lentilă și lamelă și este dezactivat în simulare | Neutilizat |
A doua tabelă enumeră ce se află efectiv în probă, împreună cu dimensiunea fiecărui obiect, astfel încât un elev să poată decide doar pe baza numerelor ce obiectiv este necesar pentru a-l vedea.
| Ce este în pachet | Dimensiune tipică | Nepatat | După Lugol |
|---|---|---|---|
| Celulă epitelială scuamoasă descamată de pe mucoasa bucală | cu lățimea de 50 până la 70 µm, foarte subțiri și plate | Un contur slab și neregulat, ușor de ratat deoarece celula este aproape la fel de transparentă ca apa din jur | O celulă poligonală clar delimitată, cu citoplasma colorată de la galben-maroniu până la oliv |
| Nucleul acelei celule | de la 8 la 12 µm | Abia deosebit de citoplasmă | Cea mai evidentă caracteristică a lamei: un corp compact, de un maro în mod distinct mai închis, aproape de centru |
| Fire de mucus | Neregulate, de la zeci la sute de µm lungime | Foarte vagi, diafane, adesea vizibile doar acolo unde se încrețesc | Colorate și mult mai ușor de urmărit; au tendința de a ține laolaltă mase de resturi |
| Bacterii | Coci de aproximativ 1 µm, bacili cu lungimea de 1 până la 3 µm și lățimea de aproximativ 0,5 µm | Invizibil la 40×, cel mult pete în mișcare la 400× | Puncte mici și întunecate la 400×, la limita sau dincolo de limita de rezoluție — numărabile în principiu, neidentificabile |
| Resturi alimentare și granule | Câțiva µm în sus | Material granular gri, cel mai vizibil lucru de pe lama simplă | Colorat puternic acolo unde amidonul este prezent, deoarece iodul este un reactiv pentru amidon |
| Bule de aer sub lameleă | Zeci până la sute de µm | Contururi aspre, foarte întunecate, perfect circulare — un artefact, nu o structură | Neschimbată; o pată nu pătează o bulă, ceea ce reprezintă un mod util de a identifica una |
Cele două numere de pe obiectiv și ce cumpără fiecare. Mărirea totală este produsul celor două lentile de pe traseu: M = Mobiectiv × Mocular, deci obiectivul de 4× cu ocularul de 10× al microscopului oferă 40×, iar obiectivul de 40× oferă 400×. Totuși, mărirea în sine face doar imaginea mai mare; dacă două puncte apropiate rămân distinguibile este stabilit de al doilea număr, deschiderea numerică. Criteriul lui Abbe dă cea mai mică separație rezolvabilă ca d = λ / (2 NA). Luând λ = 550 nm, în mijlocul domeniului vizibil, obiectivul de 0,10 dă d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, adică aproximativ 2,8 µm; obiectivul de 0,25 dă aproximativ 1,1 µm; iar cel de 0,65 dă aproximativ 0,42 µm. O celulă epitelială de 60 µm este rezolvată confortabil de toate trei, nucleul său de 10 µm la fel de toate trei, dar o bacterie de 1 µm este dincolo de primul, la limită la al doilea și abia în interiorul celui de-al treilea. Creșterea măririi ocularului ar mări imaginea fără a adăuga detalii — mărire goală — motiv pentru a cărui cauză obiectivul cu imersie în ulei, a cărui NA de 1,25 rezolvă cu adevărat detalii mai fine, este singura cale de a vedea bacteriile în mod corespunzător.
De ce pornești la putere redusă. Câmpul vizual scade proporțional cu mărirea obiectivului: cu un număr de câmp de 18, diametrul vizibil este de aproximativ 18 / Mobiectiv, oferind aproximativ 4,5 mm la 40×, 1,8 mm la 100× și 0,45 mm la 400×. La 400× priviți mai puțin de jumătate de milimetru dintr-o lamă cu o lățime de 20 mm, așa că, dacă începeți de acolo, aproape sigur veți privi un lichid gol. Adâncimea de câmp scade odată cu deschiderea numerică (NA) în același timp, așa că obiectivul cu mărire mai mare este și mai greu de pus la focar. Găsirea specimenului la 40×, centrarea lui și abia apoi trecerea la obiective superioare nu este o formalitate; este singura modalitate eficientă de lucru.
Ce face de fapt iodul Lugol. Soluția lui Lugol este iod dizolvat în iodură de potasiu sub formă de ion triiodură. Este cel mai bine cunoscută ca reactiv pentru amidon — triiodura capturată în interiorul helicii de amiloză dă culoarea albastru-neagră caracteristică — și acesta este motivul pentru care resturile alimentare de pe lamă se pot colora puternic. Pe celule în sine acționează ca un colorant de contrast general, mai degraba decât unul specific: iodul se leagă de glicogen și de proteine, iar deoarece nucleul reprezintă cea mai densă concentrație de macromolecule din celulă, absoarbe mai mult colorant decât citoplasma subțire din jur și apare ca un corp maroniu mult mai întunecat. Acesta este întregul mecanism și merită explicat clar elevilor că nu este implicată nicio specificitate chimică: o preparație din celule epiteliale bucale dintr-un laborator școlar este colorată cel mai adesea cu albastru de metilen, care se leagă de acizii nucleici și oferă un nucleu albastru mai curat. Prețul oricăruia dintre acești coloranți este același: ucid celula, așa că nimic din ceea ce se vede pe a doua lamă nu este viu.
Rezumatul temei pe intervale de note
Clasele a IX-a și a X-a
- Concentrare: operarea corectă a microscopului și vederea cu propriii ochi pentru ce servește o colorație.
- Activități: pregătiți ambele lame și vizualizați fiecare la 40×, 100× și 400×; salvați și etichetați câte o imagine la fiecare mărire; desenați ceea ce este vizibil pe fiecare lamă la 400× una lângă alta; denumiți structurile identificate și spuneți care obiecte nu au putut fi identificate; precizați într-o singură propoziție de ce a doua lamă este mai ușor de citit; și dați regula pentru ordinea în care sunt utilizate obiectivele.
Clasa a XI-a
- Concentrare: latura cantitativă a microscopiei — mărirea, deschiderea numerică și câmpul vizual.
- Activități: calculează mărirea totală a fiecărui obiectiv cu ocularul de 10×; folosește d = λ / (2 NA) cu λ = 550 nm pentru a calcula rezoluția tuturor celor patru obiective, inclusiv cel cu imersie în ulei; estimează diametrul unei celule epiteliale comparându-l cu câmpul vizual; stabilește pe baza acelor numere ce obiecte din Tabelul 2 poate și nu poate rezolva fiecare obiectiv; și explică de ce se leagă Lugolul și de ce nucleul absoarbe mai mult decât citoplasma.
Clasa a XII-a / Nivel universitar
- Concentrare: contrastul ca limitare reală a microscopiei optice și proiectarea unei preparate.
- Activități: explicați de ce o celulă necolorată este aproape invizibilă în câmp luminos din punctul de vedere al absorbției și al indicelui de refracție și descrieți modul în care contrastul de fază sau contrastul de interferență diferențială redă imaginea fără colorare; explicați rolul uleiului de imersie în creșterea aperturii numerice peste 1 și calculați rezoluția obținută; faceți distincția între mărirea falsă și o creștere reală a puterii de rezoluție; justifica alegerea unui colorant pentru acest specimen și compara soluția Lugol cu albastrul de metilen și cu colorantul Gram, precizând ce ar evidenția fiecare dintre aceștia; și prezenta modul în care ar trebui pregătită și numărată proba pentru ca o afirmație privind abundența bacteriilor în salivă să fie justificabilă.
Esențiale de laborator
Instrumente
- Microscop compus cu iluminator și patru obiective: Plan 4/0.10, Plan 10/0.25, Plan 40/0.65 și Plan 100/1.25 imersie în ulei (nefolosit), cu un ocular de 10×
- Lame de microscop (2)
- Lamele acoperitoare (2)
- Pensetă
- Picurători
- Pahar de laborator (50 ml)
- Prosop de hârtie absorbantă, pentru tamponarea excesului de lichid
Produse
- Salivă umană în suspensie
- Soluția de iod a lui Lugol 2 %