La saliva parece agua, pero no lo es en absoluto. Aproximadamente el 99 % de su composición es agua, y el 1 % restante es el que realiza la labor: electrolitos que protegen la boca frente a la acidez, mucinas que hacen que el líquido sea resbaladizo, lisozima e inmunoglobulina A que limitan el crecimiento bacteriano, y α-amilasa, que comienza a digerir el almidón antes de que se trague la comida. En suspensión en ese líquido hay una población de material sólido: células escamosas planas desprendidas del revestimiento de la boca, bacterias en cantidades ingentes, restos de comida y hebras de moco. Una gota de este líquido bajo el microscopio es una de las formas más rápidas de mostrar a un estudiante que un fluido corporal es una suspensión de células en lugar de un líquido transparente, y también constituye una buena introducción al problema central de la microscopía óptica: las células vivas son transparentes, por lo que no basta con ampliarlas. Hay que proporcionarles contraste. En este laboratorio prepararás dos portaobjetos a partir de la misma muestra de saliva, uno sin tinción y otro con una gota de yodo de Lugol añadida, y examinarás ambos a través de los mismos tres objetivos: 40×, 100× y 400×. La comparación entre los dos portaobjetos al mismo aumento, más que el aumento en sí mismo, es el objetivo del ejercicio: el portaobjetos sin tinción muestra lo poco que se ve sin un colorante, y el portaobjetos teñido muestra lo que el colorante revela.
Objetivos Educativos
Funcionamiento de un microscopio compuesto
- Enciende el instrumento y su iluminador, y explica por qué la luz transmitida desde abajo es adecuada para una muestra transparente.
- Cambie los objetivos en el orden correcto, desde 40× hacia arriba, y vuelva a enfocar con el tornillo macrométrico después de cada cambio.
Comprensión de la ampliación y la resolución
- Calcule la ampliación total como el producto del objetivo y el ocular de 10×, y lea los dos números grabados en un objetivo como la ampliación y la apertura numérica.
- Explicar por qué el objetivo de mayor aumento no siempre es el adecuado para empezar, y por qué el aumento más allá del poder de resolución de la lente no aporta nada.
Preparación de un montaje húmedo
- Coloque una gota en un portaobjetos, baje un cubreobjetos sin atrapar aire y absorba el exceso para que el cubreobjetos quede plano.
- Prepara un par de portaobjetos emparejados que difieran en un solo aspecto, de modo que el efecto del tinte pueda atribuirse al tinte.
Uso de un medio de contraste
- Añade yodo de Lugol a la segunda diapositiva y describe qué se vuelve visible que no era visible antes.
- Un tinte funciona absorbiendo luz en unas estructuras más que en otras, y mata a las células en el proceso.
Identificación de lo que hay en la muestra
- Reconocer las células epiteliales escamosas por su tamaño y forma, y distinguirlas de las hebras de moco, los restos y las bacterias.
- Separa lo que pertenece a un organismo vivo de lo que no, y sé honesto acerca de cuáles de los objetos pequeños no se pueden identificar a esta resolución.
Registro e informe de observaciones
- Guarda una imagen en cada aumento y etiquétala con la laminilla y el objetivo utilizado.
- Escribe una descripción que indique la ampliación, lo que se vio y lo que no se pudo resolver.
Protocolo
Frente a usted hay un microscopio óptico con 4 objetivos. Para facilitar su uso, ciertas funciones están deshabilitadas y se utilizan en laboratorios más avanzados.
Tenga en cuenta que el aumento total se calcula multiplicando el aumento del objetivo (por ejemplo, 4x) con el del ocular. El microscopio utilizado en este laboratorio tiene un ocular de aumento 10x. Por ejemplo, un objetivo con un aumento de 4x dará como resultado un aumento total de 40x.
Preparación
1. Enciende el microscopio presionando el interruptor en la parte frontal del dispositivo. Encenderás el iluminador, de modo que la luz transmitida pase a través de la muestra desde abajo, lo cual es ideal para especímenes transparentes.
2. Coloque dos portaobjetos limpios en su área de trabajo.
Preparación de la primera diapositiva
1. Coloca una gota de saliva en el primer portaobjetos.
2. Cubra la lámina con un cubreobjetos.
3. Seque cuidadosamente el exceso de saliva con papel absorbente.
Preparación de la segunda diapositiva
1. Coloca una gota de saliva en el segundo portaobjetos.
Coloque una gota de Lugol en ese mismo portaobjetos.
3. Cubra la diapositiva con un cubreobjetos.
4. Seque cuidadosamente el exceso de Lugol con papel absorbente.
Observaciones
Observación de la primera diapositiva (solo saliva)
1. Coloca la primera portaobjetos en la platina del microscopio.
2. Haz clic en el botón « Microscopio « de la tableta para ver la imagen del microscopio.
Puede guardar una imagen de la vista observada haciendo clic en el botón « Guardar imagen «, situado en la zona inferior izquierda de la sección « Microscopio «.
3. Ajuste el aumento tocando los objetivos del microscopio. Comience la observación con un aumento de 40x (objetivo rojo - etiquetado Plan 4/0.10).
4. Refine el enfoque con las perillas de ajuste grueso ubicadas a la izquierda y a la derecha del microscopio.
5. Aumente gradualmente el aumento de 40x a 100x (lente objetivo amarillo – etiquetado Plan 10/0.25), luego a 400x (lente objetivo azul – etiquetado Plan 40/0.65), ajustando el enfoque según sea necesario.
Nota: Una magnificación de 1000x (objetivo de inmersión en aceite – etiquetado Plan 100/1.25) requiere el uso de aceite entre el objetivo y el cubreobjetos. Por lo tanto, no utilizamos este objetivo en este laboratorio.
Observación de la segunda lámina (saliva y Lugol)
1. Reemplaza la primera diapositiva con la segunda diapositiva que contiene la saliva y el Lugol.
2. Comenzando en un aumento de 100X (el objetivo amarillo, etiquetado como Plan 10/0.25), observe la presencia de núcleos de células, que deben aparecer coloreados de marrón por el Lugol.
¡No olvides anotar las observaciones importantes!
Apaga el microscopio
1. Apaga el microscopio presionando el interruptor en la parte frontal del dispositivo.
Preguntas de observación
1. ¿Qué observas en la preparación de saliva sin teñir (sin Lugol)?
2. ¿Cuál es el propósito del Lugol en el experimento?
3. ¿Qué parte de la célula se vuelve más visible después de añadir lugol y por qué?
4. ¿Por qué debes comenzar siempre la observación con magnificación baja (40x) antes de pasar a 100x o 400x?
5. Basado en tus observaciones, ¿qué estructuras en la saliva pertenecen a un ser vivo (células humanas) y cuáles son elementos no vivos (moco, restos, etc.)?
6. Para cada aumento, compare lo que ve en sus portaobjetos de saliva con una imagen de referencia publicada de epitelio de la mejilla (consulte la imagen de referencia suministrada con este laboratorio). Este protocolo no prepara un frotis de la mejilla, por lo que la comparación se realiza con la referencia en lugar de con un portaobjetos que usted haya preparado.
Imagen de referencia — epitelio de la mejilla. Este trabajo de laboratorio se limita a la preparación de portaobjetos de saliva; no se realiza frotis bucal. La pregunta 6 se responde comparando los resultados con una micrografía de referencia publicada de células epiteliales bucales, que el profesor proporciona junto con el material del trabajo. Qué hay que destacar en ella: las células de la mejilla se presentan como células poligonales grandes, planas e intactas, a menudo en capas, cada una con un núcleo redondo claramente visible y un fondo limpio. La saliva, por el contrario, contiene células que ya se han desprendido —dispersas, plegadas o rotas, mezcladas con hebras de moco, bacterias y restos de comida—. Las células son del mismo tipo; lo que difiere es su estado y lo que las rodea.
Resultados esperados
Los resultados se encuentran en este documento (PDF)
Ambas preparaciones contienen la misma saliva. Lo que cambia entre ellas es el contraste, y lo que cambia entre los objetivos es cuán pequeño puede ser un detalle para separarse de su vecino. La primera tabla indica, para cada objetivo en la simulación, los números grabados en él y lo que se puede esperar que muestre en cada una de las dos preparaciones.
| Objetivo | Aumento total | El detalle más pequeño resuelto | Campo de visión | Portaobjetos con saliva sin diluir | Portaobjetos de saliva + Lugol |
|---|---|---|---|---|---|
| Plan 4 / 0,10 (rojo) | 40× | alrededor de 2,8 µm | alrededor de 4,5 mm | Un campo pálido y casi vacío. Pequeñas motas grises dispersas y los contornos circulares oscuros de burbujas de aire atrapadas son los objetos más conspicuos; las células apenas son detectables | El campo adquiere la tonalidad amarillo-marrón del yodo y los cúmulos de material más densos se vuelven visibles como manchas más oscuras |
| Plan 10 / 0,25 (amarillo) | 100× | alrededor de 1,1 µm | aproximadamente 1,8 mm | Contornos irregulares tenues de células planas y restos granulares grises; el contraste sigue siendo muy bajo | Los contornos celulares destacan sobre un fondo verde-amarillo y los núcleos aparecen como pequeños puntos marrones; esta es la ampliación a la que la tinción empieza a dar frutos. |
| Plan 40 / 0,65 (azul) | 400× | aproximadamente 0,42 µm | alrededor de 0,45 mm | Una o dos células ocupan gran parte del campo como contornos de color gris claro, rodeadas de material granular; los núcleos son difíciles de distinguir | Una sola célula teñida llena el campo: citoplasma pardo-verdoso con granulación visible y un núcleo redondeado claramente más oscuro |
| Plan 100 / 1.25 aceite | 1000× | alrededor de 0,22 µm | aproximadamente 0,18 mm | No se utiliza en este laboratorio: el objetivo requiere aceite de inmersión entre la lente y el cubreobjetos y está deshabilitado en la simulación | No utilizado |
La segunda tabla enumera lo que hay realmente en la muestra, con el tamaño de cada objeto, para que un estudiante pueda decidir solo a partir de los números qué objetivo se necesita para verlo.
| ¿Qué hay en la gota? | Tamaño típico | Sin mancha | Tras Lugol |
|---|---|---|---|
| Célula epitelial escamosa descamada del revestimiento bucal | de 50 a 70 µm de diámetro, muy delgado y plano | Un contorno irregular y tenue, fácil de pasar por alto porque la célula es casi tan transparente como el agua que la rodea | Una célula poligonal con límites bien definidos, cuyo citoplasma presenta una coloración que va del marrón amarillento al oliva. |
| Núcleo de esa célula | De 8 a 12 µm | Apenas distinguible del citoplasma | La característica más evidente de la diapositiva: un cuerpo compacto, de un marrón claramente más oscuro, cerca del centro |
| Hilos de moco | De forma irregular, con una longitud de entre decenas y cientos de µm | Muy tenues, difusas; a menudo solo se ven donde se arrugan | Son de color y mucho más fáciles de localizar; tienden a mantener unidos los grupos de residuos. |
| Bacterias | Cocos de aproximadamente 1 µm; bacilos de entre 1 y 3 µm de longitud y aproximadamente 0,5 µm de anchura | Invisible a 40×; como mucho, se aprecian motas en movimiento a 400×. | Pequeños puntos oscuros a 400×, en el límite de resolución o más allá de este; en principio, se pueden contar, pero no se pueden identificar. |
| Restos de comida y gránulos | Unos pocos µm hacia arriba | Material granular gris, lo que más llama la atención en la diapositiva de la llanura | Fuertemente teñido donde el almidón está presente, ya que el yodo es un reactivo para el almidón |
| Burbujas de aire debajo del cubreobjetos | De decenas a cientos de µm | Contornos nítidos, muy oscuros y perfectamente circulares: un artefacto, no una estructura | Sin cambios; una mancha no mancha una burbuja, lo cual es una forma útil de identificarla |
Las dos cifras que figuran en el objetivo y lo que se consigue con cada una de ellas. El aumento total es el producto de las dos lentes en la trayectoria: M = Mobjetivo × Mocular, por lo que el objetivo de 4×, junto con el ocular de 10× del microscopio, ofrece un aumento de 40×, y el objetivo de 40× ofrece un aumento de 400×. Sin embargo, el aumento por sí solo solo hace que la imagen sea más grande; que dos puntos cercanos sigan siendo distinguibles viene determinado por el segundo número, la apertura numérica. El criterio de Abbe establece que la separación mínima resoluble es d = λ / (2 NA). Si tomamos λ = 550 nm, en el centro del rango visible, el objetivo de 0,10 da d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, es decir, unos 2,8 µm; el objetivo de 0,25 da unos 1,1 µm; y el objetivo de 0,65 da unos 0,42 µm. Una célula epitelial de 60 µm se resuelve con facilidad con los tres, al igual que su núcleo de 10 µm, pero una bacteria de 1 µm queda fuera del alcance del primero, al límite del segundo y apenas dentro del tercero. Aumentar aún más el aumento del ocular ampliaría la imagen sin aportar más detalles —es lo que se conoce como «aumento vacío»—, por lo que el objetivo de inmersión en aceite, cuya NA de 1,25 permite realmente resolver detalles más finos, es la única forma de observar correctamente las bacterias.
¿Por qué hay que empezar con una potencia baja?. El campo de visión se reduce en proporción al aumento del objetivo: con un número de campo de 18, el diámetro visible es aproximadamente 18 / M.objetivo, lo que supone unos 4,5 mm a 40×, 1,8 mm a 100× y 0,45 mm a 400×. A 400× se observa menos de medio milímetro de un portaobjetos de 20 mm de ancho, por lo que, si se empieza por ahí, lo más probable es que se vea líquido sin nada. La profundidad de campo se reduce al mismo tiempo que la NA, por lo que también resulta más difícil enfocar con un objetivo de mayor aumento. Encontrar la muestra a 40×, centrarla y solo entonces ir aumentando el aumento de los objetivos no es una mera formalidad; es la única forma eficaz de trabajar.
Qué hace realmente el yodo de Lugol. La solución de Lugol es yodo disuelto en yoduro de potasio en forma de ion triyoduro. Es más conocida como el reactivo del almidón —el triyoduro atrapado dentro de la hélice de amilosa produce el característico color azul-negro— y por eso los restos de comida en el portaobjetos pueden mancharse intensamente. En las propias células actúa como un colorante de contraste general más que específico: el yodo se une al glucógeno y a las proteínas, y dado que el núcleo es la concentración más densa de macromoléculas de la célula, absorbe más colorante que el delgado citoplasma que lo rodea y aparece como un cuerpo de color marrón claramente más oscuro. Ese es todo el mecanismo, y conviene dejar claro a los alumnos que no interviene ninguna especificidad química: una preparación de células bucales en un laboratorio escolar se tiñe con mayor frecuencia con azul de metileno, que se une a los ácidos nucleicos y proporciona un núcleo azul más nítido. El precio de cualquiera de estos colorantes es el mismo: matan la célula, por lo que nada de lo que se ve en el segundo portaobjetos está vivo.
Resumen de la asignación por rango de calificación
Grados 9–10
- Enfoque: utilizar correctamente el microscopio y comprobar por sí mismos para qué sirve una tinción.
- Actividades Prepara ambas preparaciones y obsérvalas a 40×, 100× y 400×; guarda y etiqueta una imagen para cada aumento; dibuja, una al lado de la otra, lo que se ve en cada preparación a 400×; nombra las estructuras identificadas e indica qué objetos no se han podido identificar; explica en una frase por qué el segundo portaobjetos es más fácil de observar; y indica la regla que determina el orden en el que se utilizan los objetivos.
Undécimo grado
- Enfoque: los aspectos cuantitativos de la microscopía: aumento, apertura numérica y campo de visión.
- Actividades Calcula el aumento total de cada objetivo con el ocular de 10×; utiliza la fórmula d = λ / (2 NA), donde λ = 550 nm, para calcular la resolución de los cuatro objetivos, incluido el de inmersión en aceite; estima el diámetro de una célula epitelial comparándolo con el campo de visión; a partir de esas cifras, determinar qué objetos de la tabla 2 puede y no puede resolver cada objetivo; y explicar a qué se une el Lugol y por qué el núcleo lo absorbe en mayor medida que el citoplasma.
12.º curso / Nivel universitario
- Enfoque: el contraste como la verdadera limitación de la microscopía óptica y el diseño de la preparación.
- Actividades explicar por qué una célula sin teñir es prácticamente invisible en campo claro en términos de absorción e índice de refracción, y describir cómo el contraste de fase o el contraste de interferencia diferencial permiten recuperar la imagen sin necesidad de tinción; explicar la función del aceite de inmersión a la hora de elevar la apertura numérica por encima de 1 y calcular la resolución obtenida; distinguir entre el aumento de magnificación «ficticio» y un aumento real del poder de resolución; justificar la elección de un colorante para esta muestra y comparar el Lugol con el azul de metileno y con la tinción de Gram, indicando qué revelaría cada uno; y exponer cómo habría que preparar y contar la muestra para que una afirmación sobre la abundancia bacteriana en la saliva sea defendible.
Esenciales de laboratorio
Instrumentos
- Microscopio compuesto con iluminador y cuatro objetivos: Plan 4/0.10, Plan 10/0.25, Plan 40/0.65 y Plan 100/1.25 de inmersión en aceite (no usado), con un ocular de 10×
- Portaobjetos de microscopio (2)
- Cubreobjetos (2)
- Pinzas
- Goteros
- Vaso de precipitados (50 mL)
- Papel de cocina absorbente, para secar el exceso de líquido
Productos
- Saliva humana en suspensión
- Solución de yodo de Lugol 2 %