La saliva sembla aigua i és qualsevol cosa menys això. Aproximadament el 99 % és aigua, i l'1 % restant fa la feina: electrolits que actuen com a tampó per protegir la boca dels àcids, mucines que fan el fluid lliscós, lisozima i immunoglobulina A que limiten el creixement bacterià, i α-amilasa, que comença a digerir l'almidó abans que s'empassi el menjar. En aquest fluid hi ha una població de material sòlid: cèl·lules epitelials planes escatiformes descamades del revestiment de la boca, un gran nombre de bacteris, restes d'aliments i filaments de moco. Una gota d'aquesta sota el microscopi és una de les maneres més ràpides de mostrar a un estudiant que un fluid corporal és una suspensió de cèl·lules en lloc d'un líquid clar, i també és una bona introducció al problema central de la microscopia òptica: les cèl·lules vives són transparents, de manera que ampliar-les no n'hi ha prou. Cal proporcionar-los contrast. En aquest laboratori prepareu dues laminetes a partir de la mateixa mostra de saliva, una sense tinció i una altra amb una gota d'iode de Lugol afegida, i examineu-les amb els mateixos tres objectius: 40×, 100× i 400×. La comparació entre les dues laminetes a la mateixa ampliació, més que l'ampliació en si mateixa, és l'objectiu de l'exercici: la lamineta sense tenyir mostra com de poc es veu sense un colorant, i la lamineta tenyida mostra el que revela el colorant.
Objectius educatius
Funcionament d'un microscopi compost
- Engegueu l'instrument i el seu il·luminador, i expliqueu per què la llum transmesa des de sota convé a un espècimen transparent.
- Canvieu els objectius en l'ordre correcte, a partir de 40× cap amunt, i torneu a enfocar amb el cargol macromètric després de cada canvi.
Comprensió de la ampliació i la resolució
- Calculeu la magnificació total com el producte de l'objectiu i l'ocular de 10×, i llegiu els dos números gravats en un objectiu com a magnificació i obertura numèrica.
- Explicar per què l'objectiu més alt no sempre és el més adequat per començar, i per què augmentar la magnificació més enllà del poder de resolució de la lent no aporta res.
Preparació d'una preparació humida
- Poseu una gota en un portaobjectes, baixeu un cobreobjectes sense atrapar aire i assequeu l'excés perquè el cobreobjectes quedi pla.
- Prepareu un parell de portaobjectes aparellats que difereixin en un sol aspecte, de manera que l'efecte del tint es pugui atribuir al tint.
Ús d'un tint de contrast
- Afegiu iode de Lugol a la segona portaobjectes i descriviu què esdevé visible que no ho era abans.
- Un tint funciona absorbint llum en unes estructures més que en unes altres, i mata les cèl·lules en el procés.
Identificació del contingut de la mostra
- Reconèixer les cèl·lules epitelials escamoses per la seva mida i forma, i distingir-les de les fileres de moc, la runa i els bacteris.
- Separeu el que pertany a un organisme viu d'allò que no, i sigueu honestos sobre quins dels objectes petits no es poden identificar a aquesta resolució.
Registrament i comunicació d'observacions
- Deseu una imatge a cada augment i etiqueteu-la amb la preparació i l'objectiu utilitzat.
- Escriu una descripció que indiqui el augment, què es va veure i què no es va poder resoldre.
Protocol
Davant vostre hi ha un microscopi òptic amb 4 objectius. Amb l'objectiu de facilitar-ne l'ús, hi ha certes funcionalitats que estan deshabilitades i s'utilitzen en laboratoris més avançats.
Tingues en compte que la magnificació total es calcula multiplicant la magnificació de l'objectiu (per exemple, 4x) amb la de l'ocular. El microscopi utilitzat en aquest laboratori té un ocular amb una magnificació de 10x. Per exemple, un objectiu amb una magnificació de 4x donarà com a resultat una magnificació total de 40x.
Preparació
1. Enceneu el microscopi prement l'interruptor situat a la part frontal del dispositiu. S'encendrà elIl·luminador, de manera que la llum transmesa travessa la mostra des de baix, cosa ideal per a exemplars transparents.
2. Col·loque dues làmines netes a la seva àrea de treball.
Preparació de la primera diapositiva
1. Poseu una gota de saliva al primer portaobjectes.
2.Tapeu el portaobjectes amb una coberta.
3. Eixugueu amb cura l'excés de saliva amb paper absorbent.
Preparació de la segona diapositiva
1. Poseu una gota de saliva al segon portaobjectes.
2. Poseu una gota de Lugol al mateix portaobjectes.
3. Tapeu la làmina amb una coberta.
4. Eixuga acuradament l'excés de Lugol amb paper absorbent.
Observacions
Observació de la primera làmina (només saliva)
1. Col·loca el primer portaobjectes a la platina del microscopi.
2. Feu clic al botó « Microscopi « de la tauleta per veure la imatge del microscopi.
Podeu desar una imatge de la vista observada fent clic al botó «Desa la imatge«, situat a la zona inferior esquerra de la secció «Microscopi«.
3. Ajusteu la magnificació tocant els objectius del microscopi. Comenceu l'observació amb una magnificació de 40x (objectiu vermell – etiquetat Plan 4/0.10).
4. Refineu el focus amb els botons de desenfocament gruixut situats a l'esquerra i a la dreta del microscopi.
5. Augmenteu gradualment la magnificació de 40x a 100x (objectiu groc – etiquetat Plan 10/0.25), després a 400x (objectiu blau – etiquetat Plan 40/0.65), ajustant el focus segons sigui necessari.
Nota: Una ampliació de 1000x (objectiu de blanc – etiquetat Plan 100/1.25) requereix l'ús d'oli entre l'objectiu i la làmina de vidre. Per tant, no utilitzem aquest objectiu en aquest laboratori.
Observació de la segona làmina (saliva i Lugol)
1. Substitueix la primera diapositiva per la segona diapositiva que contingui la saliva i el Lugol.
2. Començant amb un augment de 100X (objectiu groc – etiquetat com a Plan 10/0,25), observeu la presència de nuclis cel·lulars, que haurien d'aparèixer de color marró per la Lugol.
No oblidis anotar les observacions importants!
Apaga el microscopi
1. Apagueu el microscopi prement l'interruptor situat a la part frontal del dispositiu.
Preguntes d'observació
Què observeu a la preparació de saliva no tenyida (sense Lugol)?
2. Quin és el propòsit del Lugol a l'experiment?
3. Quina part de la cèl·lula es fa més visible després d'afegir Lugol, i per què?
4. Per què heu de començar sempre l'observació amb un augment baix (40x) abans de passar a 100x o 400x?
5. Basant-te en les teves observacions, quines estructures de la saliva pertanyen a un ésser viu (cèl·lules humanes) i quins són elements no vius (moc, restes, etc.)?
6. Per a cada augment, compareu el que veieu a les vostres preparacions de saliva amb una imatge de referència publicada d'epiteli de la galta (vegeu la imatge de referència subministrada amb aquest pràctic). Aquest protocol no prepara un estès bucal, de manera que la comparació es fa respecte a la referència en lloc de fer-la respecte a una preparació pròpia.
Imatge de referència: epitheli bucal. Aquest laboratori només prepara portaobjectes de saliva; no pren cap frotis de galta. La pregunta 6 es respon a partir d'una micrografia de referència publicada de cèl·lules epitelials de la galta, que el professor proporciona juntament amb el laboratori. Què cal assenyalar-hi: les cèl·lules de la galta arriben com a cèl·lules poligonals grans, planes i intactes, sovint en làmines, cadascuna amb un nucli rodó clarament visible i un fons net. La saliva, en canvi, conté cèl·lules que ja s'han desprès —disperses, plegades o trencades, barrejades amb filaments de moc, bacteris i restes d'aliment. Les cèl·lules són del mateix tipus; el que difereix és el seu estat i el que les envolta.
Resultats previstos
Els resultats es troben en aquest document (PDF)
Totes dues portades porten la mateixa saliva. El que canvia entre elles és el contrast, i el que canvia entre objectius és com de petit pot ser un detall separat del seu veí. La primera taula dóna, per a cada objectiu de la simulació, els números gravats i el que s'espera que mostri en cadascuna de les dues portades.
| Objectiu | Augment total | El detall més petit resolt | Camp de visió | Portaobjectes amb saliva simple | Portaobjectes de saliva + Lugol |
|---|---|---|---|---|---|
| Pla 4 / 0,10 (vermell) | 40× | aproximadament 2,8 µm | uns 4,5 mm | Un camp pàl·lid, gairebé buit. Disperses taques grises i els perfils circulars foscos de bombolles d'aire atrapades són els objectes més conspicus; les cèl·lules amb prou feines són detectables | El camp adopta el tint groguenc-marró del iode i els cúmuls de material més dens es fan visibles com a taques més fosques |
| Pla 10 / 0.25 (groc) | 100× | aproximadament 1,1 µm | uns 1,8 mm | Contorns irregulars i tènues de cèl·lules planes i restes granulars grises; el contrast continua sent molt baix | Els contorns cel·lulars destaquen sobre un fons verd-groc i els nuclis apareixen com a petits punts marrons; aquest és el grau de magnificació en què la tinció comença a donar fruit. |
| Pla 40 / 0,65 (blau) | 400× | aproximadament 0,42 µm | aproximadament 0,45 mm | Una o dues cèl·lules omplen gran part del camp com a contorns grisos pàl·lids, envoltades de material granular; els nuclis són difícilment distingibles | Una sola cèl·lul·la tenyida omple el camp: citoplasma marró-verd amb granulositat visible i un nucli arrodonit clarament més fosc |
| Pla 100 / 1.25 oli | 1000× | aproximadament 0,22 µm | uns 0,18 mm | No s'utilitza en aquest laboratori: l'objectiu requereix oli d'immersió entre la lent i el cubreobjectes i està desactivat a la simulació | No utilitzat |
La segona taula enumera el que hi ha realment a la mostra, amb la mida de cada objecte, de manera que un estudiant pugui decidir només a partir dels números quin objectiu es necessita per veure'l.
| Què hi ha a la gota | Mida típica | Sense taques | Després de Lugol |
|---|---|---|---|
| Cèl·lula epitelial escamosa descamada de la mucosa bucal | de 50 a 70 µm de diàmetre, molt prim i pla | Un contorn lleuger i irregular, fàcil de passar per alt perquè la cèl·lula és gairebé tan transparent com l'aigua que l'envolta | Una cèl·lula poligonal clarament delimitada, amb citoplasma de color groc marronós a oliva |
| Nucli d'aquesta cèl·lula | de 8 a 12 µm | Gairebé indistingible del citoplasma | La característica més òbvia de la platina: un cos compacte, clarament de color marró més fosc prop del centre |
| Filaments de moc | Irregular, de desenes a centenars de µm de llargada | Molt tènues, flonjos, sovint només visibles on fan arrugues | Tintades i molt més fàcils de rastrejar; solen agrupar cúmuls de residus |
| Bacteris | Cocus d'aproximadament 1 µm, bastons de 1 a 3 µm de llarg i d'aproximadament 0,5 µm d'ample | Invisible a 40×, a tot estirar puntets en moviment a 400× | Petits punts foscos a 400×, al límit de resolució o més enllà — comptables en principi, no identificables |
| Restes d'aliments i grànuls | Uns quants µm cap amunt | Material granular gris, el més visible de la planxa plana | Fortament tacat on hi ha midó present, ja que el iode és un reactiu del midó |
| Bombolles d'aire sota el cubreobjectes | De desenes a centenars de µm | Línies nítides, molt fosques, perfectament circulars — un artefacte, no pas una estructura | Incanviat; una taca no tanca una bombolla, la qual cosa és una manera útil d'identificar-ne una |
Els dos números de l'objectiu i què compra cadascun. La magnificació total és el producte de les dues lents del trajecte: M = Mobjectiu × Mocular, així que l'objectiu 4× amb l'ocular 10× del microscopi proporciona 40×, i l'objectiu 40× proporciona 400×. Tanmateix, l'augment per si sol només fa que la imatge sigui més gran; si dos punts propers continuen sent distingibles ho determina el segon nombre, l'obertura numèrica. El criteri d'Abbe dóna la separació mínima resoluble com a d = λ / (2 NA). Prenent λ = 550 nm, a mitjan rang visible, l'objectiu de 0,10 dona d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, és a dir, uns 2,8 µm; l'objectiu de 0,25 ofereix uns 1,1 µm; i l'objectiu de 0,65 ofereix uns 0,42 µm. Una cèl·lula epitelial de 60 µm es resol amb facilitat amb els tres objectius, així com el seu nucli de 10 µm, però un bacteri d'1 µm queda fora de l'abast del primer, és marginal amb el segon i només acaba d'entrar dins del tercer. Augmentar la magnificació de l'ocular faria més gran la imatge sense afegir-hi detall —una simple magnificació buida—, i per això l'objectiu d'immersió en oli, amb una NA de 1,25 que realment resol detalls més fins, és l'única manera de veure els bacteris correctament.
Per què comenceu amb poca potència. El camp de visió s'encongeix en proporció a la magnificació de l'objectiu: amb un nombre de camp de 18, el diàmetre visible és aproximadament 18 / Mobjectiu, donant uns 4,5 mm a 40×, 1,8 mm a 100× i 0,45 mm a 400×. A 400× esteu mirant menys de mig mil·límetre d'un portaobjectes que fa 20 mm d'amplada, de manera que si comenceu per aquí gairebé segur que estareu mirant líquid buit. La profunditat de camp es redueix amb l'O.N. al mateix temps, de manera que l'objectiu més potent també és més difícil d'enfocar. Trobar la mostra a 40×, centrar-la i només llavors pujar de potència d'objectiu no és una formalitat; és l'única manera eficient de treballar.
Què fa realment el iode de Lugol. La solució de Lugol és iode dissolt en iodur de potassium en forma d'ió triiodur. És coneguda sobretot com el reactiu per almidó —el triiodur atrapat dins de l'hèlix d'amilosa produeix el color blau-negre familiar— i per això les restes de menjar del portaobjectes es poden tenyir intensament. Sobre les cèl·lules mateixes, actua com a colorant de contrast general més que no pas específic: el iode s'uneix al glycogen i a les proteïnes, i com que el nucli és la concentració més densa de macromolècules de la cèl·lula, absorbeix més colorant que el citoplasma prim circumdant i apareix com un cos de color marró clarament més fosc. Aquest és tot el mecanisme, i val la pena deixar clar als estudiants que no hi ha cap especificitat química implicada: una preparació de cèl·lules de la galta en un laboratori escolar sovint es tiny amb blau de metilè, que s'uneix als àcids nucleics i dóna un nucli blau més net. El preu de qualsevol d'aquests colorants és el mateix: maten la cèl·lula, de manera que res del que es veu al segon portaobjectes és viu.
Resum de tasques per rang de qualificació
De 9è a 10è grau
- Enfocament fer funcionar el microscopi correctament i veure per si mesmos per a què serveix una tinció.
- Activitats: prepareu ambdues preparacions i observeu-les cadascuna a 40×, 100× i 400×; deseu i etiqueteu una imatge a cada augment; dibuixeu allò que és visible en cada preparació a 400× l'una al costat de l'altra; anomeneu les estructures identificades i indiqueu quins objectes no s'han pogut identificar; indiqueu en una sola frase per què la segona preparació és més fàcil de llegir; i doneu la regla de l'ordre en què s'utilitzen els objectius.
11è curs
- Enfocament el vessant quantitatiu de la microscopia: augment, obertura numèrica i camp de visió.
- Activitats: calculeu el augment total de cada objectiu amb l'ocular de 10×; utilitzeu d = λ / (2 NA) amb λ = 550 nm per calcular la resolució dels quatre objectius, inclòs el d'immersió en oli; estimeu el diàmetre d'una cèl·lula epitelial comparant-lo amb el camp de visió; decidiu a partir d'aquests nombres quins objectes de la Taula 2 pot i no pot resoldre cada objectiu; i expliqueu a què s'uneix el Lugol i per què el nucli n'absorbeix més que el citoplasma.
12è curs / Nivell universitari
- Enfocament el contrast com a limitació real de la microscopia òptica i el disseny d'una preparació.
- Activitats: explicar per què una cèl·lula sense tenyir és gairebé invisible en camp clar en termes d'absorció i índex de refracció, i descriure com el contrast de fase o el contrast d'interferència diferencial recupera la imatge sense un tenyidor; explicar el paper de l'oli d'immersió en elevar l'apertura numèrica per sobre d'1 i calcular la resolució guanyada; distingir l'augment buit d'un augment real de la potència de resolució; justificar l'elecció d'un colorant per a aquest exemplar i comparar el de Lugol amb el blau de metilè i amb un tinció de Gram, indicant què revelaria cadascun; i exposar com s'hauria de preparar i comptar la mostra perquè una afirmació sobre l'abundància bacteriana a la saliva sigui defensable.
Equipament de laboratori
Instruments
- Microscopi compost amb il·luminador i quatre objectius: Pla 4/0.10, Pla 10/0.25, Pla 40/0.65 i Pla 100/1.25 d'immersió en oli (sense utilitzar), amb un ocular de 10×
- Portaobjectes (2)
- Cobracles (2)
- Pinces
- Gotes
- Vas de precipitats (50 mL)
- Paper de cuina absorbent, per eixugar l'excés de líquid
Productes
- Saliva humana en suspensió
- Solució de iode de Lugol 2 %