La saliva parece agua, pero no lo es en absoluto. Aproximadamente el 99 % de su composición es agua, y el 1 % restante es el que hace el trabajo: electrolitos que protegen la boca contra la acidez, mucinas que hacen que el líquido sea resbaladizo, lisozima e inmunoglobulina A que limitan el crecimiento bacteriano, y α-amilasa, que comienza a digerir el almidón antes de que se trague la comida. En suspensión en ese líquido hay una población de material sólido: células escamosas planas desprendidas del revestimiento de la boca, una enorme cantidad de bacterias, restos de comida y hebras de moco. Una gota de esta saliva bajo el microscopio es una de las formas más rápidas de mostrarle a un estudiante que un fluido corporal es una suspensión de células en lugar de un líquido transparente, y también es una buena introducción al problema central de la microscopía óptica: las células vivas son transparentes, por lo que no basta con ampliarlas. Hay que darles contraste. En este laboratorio prepararás dos portaobjetos a partir de la misma muestra de saliva, uno sin tinción y otro con una gota de yodo de Lugol agregada, y examinarás ambos a través de los mismos tres objetivos: 40×, 100× y 400×. La comparación entre los dos portaobjetos con el mismo aumento, más que el aumento en sí mismo, es el objetivo del ejercicio: el portaobjetos sin tinción muestra lo poco que se ve sin un colorante, y el portaobjetos teñido muestra lo que el colorante revela.
Metas educativas
Funcionamiento de un microscopio compuesto
- Encienda el instrumento y su iluminador, y explique por qué la luz transmitida desde abajo es adecuada para una muestra transparente.
- Cambie los objetivos en el orden correcto, desde 40× hacia arriba, y vuelva a enfocar con el tornillo macrométrico después de cada cambio.
Comprensión de la ampliación y la resolución
- Calcule la magnificación total como el producto del objetivo y el ocular de 10×, y lea los dos números grabados en un objetivo como la magnificación y la apertura numérica.
- Explicar por qué el objetivo de mayor aumento no siempre es el correcto para empezar, y por qué la magnificación más allá del poder de resolución de la lente no aporta nada.
Preparación de un montaje húmedo
- Coloque una gota en un portaobjetos, baje un cubreobjetos sin atrapar aire y absorba el exceso para que el cubreobjetos quede plano.
- Prepare un par de portaobjetos que coincidan y que difieran en un solo aspecto, de modo que el efecto de la tinción pueda atribuirse a la tinción.
Uso de un medio de contraste
- Agregue yodo de Lugol a la segunda lámina y describa qué se vuelve visible que antes no lo era.
- Un tinte funciona absorbiendo luz en unas estructuras más que en otras, y mata a las células en el proceso.
Identificación de lo que hay en la muestra
- Reconocer las células epiteliales escamosas por su tamaño y forma, y distinguirlas de las hebras de moco, los detritos y las bacterias.
- Separe lo que pertenece a un organismo vivo de lo que no, y sea honesto acerca de cuáles de los objetos pequeños no se pueden identificar a esta resolución.
Registro y emisión de informes de observaciones
- Guardar una imagen en cada aumento y etiquetarla con la laminilla y el objetivo utilizado.
- Escriba una descripción que indique la ampliación, lo que se vio y lo que no se pudo resolver.
Protocolo
Frente a ti hay un microscopio óptico con 4 objetivos. Para facilitar su uso, ciertas funciones están desactivadas y se utilizan en laboratorios más avanzados.
Tenga en cuenta que la magnificación total se calcula multiplicando la magnificación del objetivo (por ejemplo, 4x) por la del ocular. El microscopio utilizado en este laboratorio tiene un ocular de 10x de magnificación. Por ejemplo, un objetivo con una magnificación de 4x dará como resultado una magnificación total de 40x.
Preparación
1. Encienda el microscopio presionando el interruptor en la parte delantera del dispositivo. Encenderá el iluminador para que la luz transmitida atraviese la muestra desde abajo, lo cual es ideal para especímenes transparentes.
2. Coloque dos portaobjetos limpios en su área de trabajo.
Preparación de la primera diapositiva
1. Coloque una gota de saliva en el primer portaobjetos.
2. Cubra la laminilla con un cubreobjetos.
3. Con cuidado, absorba el exceso de saliva con papel absorbente.
Preparación de la segunda diapositiva
1. Coloque una gota de saliva en el segundo portaobjetos.
2. Coloque una gota de Lugol en ese mismo portaobjetos.
3. Cubra el portaobjetos con un cubreobjetos.
4. Seca cuidadosamente el exceso de Lugol con papel absorbente.
Observaciones
Observación de la primera diapositiva (solo saliva)
1. Coloque la primera diapositiva en la platina del microscopio.
2. Haga clic en el botón «Microscopio« de la tableta para ver la imagen del microscopio.
Puede guardar una imagen de la vista observada haciendo clic en el botón «Guardar imagen«, ubicado en la esquina inferior izquierda de la sección «Microscopio«.
3. Ajuste la magnificación tocando los objetivos del microscopio. Comience la observación a una magnificación de 40x (objetivo rojo – etiquetado Plan 4/0.10).
4. Ajuste el enfoque con las perillas de enfoque grueso ubicadas a la izquierda y derecha del microscopio.
5. Aumente gradualmente la magnificación de 40x a 100x (objetivo amarillo, etiquetado Plan 10/0.25) y luego a 400x (objetivo azul, etiquetado Plan 40/0.65), ajustando el enfoque según sea necesario.
Nota: Un aumento de 1000x (objetivo blanco – etiquetado como Plan 100/1.25) requiere el uso de aceite entre el objetivo y el cubreobjetos. Por lo tanto, no utilizamos este objetivo en este laboratorio.
Observación de la segunda diapositiva (saliva y Lugol)
1. Reemplace la primera diapositiva con la segunda diapositiva que contiene la saliva y el Lugol.
2. Comenzando con un aumento de 100X (objetivo amarillo, marcado como Plan 10/0.25), observe la presencia de núcleos celulares, los cuales deben verse de color marrón debido al Lugol.
* ¡No olvides registrar las observaciones importantes!
Apaga el microscopio
1. Apague el microscopio presionando el interruptor en la parte frontal del dispositivo.
Preguntas de observación
1. ¿Qué nota en la placa de saliva sin teñir (sin Lugol)?
2. ¿Cuál es el propósito del Lugol en el experimento?
3. ¿Qué parte de la célula se vuelve más visible después de agregar Lugol y por qué?
4. ¿Por qué debe comenzar siempre la observación con un aumento bajo (40x) antes de pasar a 100x o 400x?
5. Según tus observaciones, ¿qué estructuras en la saliva pertenecen a un ser vivo (células humanas) y cuáles son elementos no vivos (moco, restos, etc.)?
6. Para cada aumento, compare lo que ve en sus portaobjetos de saliva con una imagen de referencia publicada del epitelio de la mejilla (consulte la imagen de referencia proporcionada con este laboratorio). Este protocolo no prepara un frotis de la mejilla, por lo que la comparación se realiza frente a la referencia en lugar de frente a un portaobjetos que usted mismo haya preparado.
Imagen de referencia — epitelio de la mejilla. Este laboratorio prepara únicamente portaobjetos de saliva; no se realiza un frotis de mejilla. La pregunta 6 se responde utilizando una micrografía de referencia publicada de células epiteliales de mejilla, que el profesor proporciona junto con el laboratorio. Qué señalar en ella: las células de la mejilla se presentan como células grandes, planas, intactas y poligonales, a menudo en capas, cada una con un núcleo redondo claramente visible y un fondo limpio. La saliva, en cambio, contiene células que ya se han desprendido: dispersas, dobladas o rotas, mezcladas con hebras de moco, bacterias y restos de comida. Las células son del mismo tipo; lo que difiere es su estado y lo que las rodea.
Resultados esperados
Los resultados se encuentran en este documento (PDF)
Ambas laminillas contienen la misma saliva. Lo que cambia entre ellas es el contraste, y lo que cambia entre los objetivos es cuán pequeño puede separarse un detalle de su vecino. La primera tabla indica, para cada objetivo en la simulación, los números grabados en él y lo que se puede esperar que muestre en cada una de las dos laminillas.
| Objetivo | Magnificación total | El detalle más pequeño resuelto | Campo de visión | Frotis de saliva simple | Portaobjetos de saliva + Lugol |
|---|---|---|---|---|---|
| Plan 4 / 0.10 (rojo) | 40× | alrededor de 2.8 µm | alrededor de 4.5 mm | Un campo pálido y casi vacío. Pequeñas manchas grises dispersas y los contornos circulares oscuros de burbujas de aire atrapadas son los objetos más conspicuos; las células apenas son detectables | El campo adquiere el tono amarillo-marrón del yodo y los cúmulos de material más densos se vuelven visibles como manchas más oscuras |
| Plan 10 / 0.25 (amarillo) | 100× | aproximadamente 1.1 µm | alrededor de 1.8 mm | Contornos irregulares tenues de células planas y restos granulares grises; el contraste sigue siendo muy bajo | Los contornos celulares resaltan sobre un fondo verde amarillo y los núcleos aparecen como pequeños puntos marrones; esta es la ampliación a la que la tinción empieza a dar resultados |
| Plan 40 / 0.65 (azul) | 400× | alrededor de 0.42 µm | alrededor de 0.45 mm | Una o dos células ocupan gran parte del campo como contornos de color gris claro, rodeadas de material granular; los núcleos son difíciles de distinguir | Una sola célula teñida llena el campo: citoplasma pardo-verdoso con granulación visible y un núcleo redondeado claramente más oscuro |
| Plan 100 / 1.25 aceite | 1000× | alrededor de 0,22 µm | aproximadamente 0.18 mm | No se usa en este laboratorio: el objetivo requiere aceite de inmersión entre la lente y el cubreobjetos y está deshabilitado en la simulación | No utilizado |
La segunda tabla enumera lo que hay realmente en la muestra, con el tamaño de cada objeto, para que un estudiante pueda decidir solo a partir de los números qué objetivo se necesita para verlo.
| ¿Qué hay en el paquete? | Tamaño típico | Sin mancha | Después de Lugol |
|---|---|---|---|
| célula epitelial escamosa descamada del revestimiento bucal | de 50 a 70 µm de ancho, muy delgado y plano | Un contorno tenue e irregular, fácil de pasar por alto porque la célula es casi tan transparente como el agua que la rodea | Una célula poligonal de bordes claramente definidos, citoplasma teñido de marrón amarillento a oliváceo |
| Núcleo de esa célula | de 8 a 12 µm | Apenas distinguible del citoplasma | La característica más evidente de la diapositiva: un cuerpo compacto y claramente de color marrón más oscuro cerca del centro |
| Hebras de moco | Irregular, de decenas a cientos de µm de largo | Muy tenues, vaporosas, a menudo visibles solo donde se arrugan | Tintadas y mucho más fáciles de rastrear; tienden a mantener unidas las acumulaciones de residuos |
| Bacterias | Cocos de aproximadamente 1 µm, bacilos de 1 a 3 µm de largo y aproximadamente 0,5 µm de ancho | Invisible a 40×, en el mejor de los casos motas en movimiento a 400× | Pequeños puntos oscuros a 400×, en el límite de resolución o más allá de este —contables en principio, no identificables |
| Residuos de comida y gránulos | Unos µm hacia arriba | Material granular gris, lo más visible en la placa lisa | Se tiñe fuertemente donde hay almidón presente, ya que el yodo es un reactivo para el almidón |
| Burbujas de aire debajo del cubreobjetos | De decenas a cientos de µm | Contornos nítidos, muy oscuros y perfectamente circulares: un artefacto, no una estructura | Sin cambios; una mancha no mancha a una burbuja, lo cual es una manera útil de identificar una |
Los dos números en el objetivo, y lo que cada uno compra. La magnificación total es el producto de las dos lentes en la trayectoria: M = Mobjetivo × Mocular, por lo que el objetivo de 4× con el ocular de 10× del microscopio da 40×, y el objetivo de 40× da 400×. Sin embargo, la ampliación por sí sola solo hace que la imagen sea más grande; el que dos puntos cercanos sigan siendo distinguibles lo determina el segundo número, la apertura numérica. El criterio de Abbe establece que la separación resoluble más pequeña es d = λ / (2 NA). Tomando λ = 550 nm, en el medio del rango visible, el objetivo de 0,10 da d = 550 / (2 × 0,10) = 2750 nm, es decir, aproximadamente 2,8 µm; el objetivo de 0,25 da aproximadamente 1,1 µm; y el objetivo de 0,65 da aproximadamente 0,42 µm. Una célula epitelial de 60 µm se resuelve cómodamente con los tres, al igual que su núcleo de 10 µm con los tres, pero una bacteria de 1 µm está más allá del primero, es marginal en el segundo y apenas está dentro del tercero. Aumentar la ampliación del ocular agrandaría la imagen sin añadir detalles (ampliación vacía), razón por la cual el objetivo de inmersión en aceite, cuya NA de 1,25 realmente resuelve detalles más finos, es la única vía para ver las bacterias correctamente.
¿Por qué comienzas a baja potencia?. El campo de visión se reduce en proporción a la magnificación del objetivo: con un número de campo de 18, el diámetro visible es aproximadamente 18 / Mobjetivo, lo que da unos 4.5 mm a 40×, 1.8 mm a 100× y 0.45 mm a 400×. A 400× estás viendo menos de medio milímetro de una placa que mide 20 mm de ancho, por lo que si empiezas ahí casi con seguridad estarás viendo líquido vacío. La profundidad de campo se reduce con la AN al mismo tiempo, por lo que el objetivo de mayor aumento también es más difícil de enfocar. Encontrar la muestra a 40×, centrarla y solo entonces subir los objetivos no es una formalidad; es la única manera eficiente de trabajar.
Lo que realmente hace el yodo de Lugol. La solución de Lugol es yodo disuelto en yoduro de potasio como ion triyoduro. Es más conocida como el reactivo para el almidón —el triyoduro atrapado dentro de la hélice de amilosa produce el familiar color azul negruzco— y por eso los restos de comida en el portaobjetos se pueden teñir intensamente. En las células mismas actúa como un tinte de contraste general en lugar de uno específico: el yodo se une al glucógeno y a las proteínas, y debido a que el núcleo es la concentración más densa de macromoléculas en la célula, absorbe más tinte que el delgado citoplasma circundante y aparece como un cuerpo marrón claramente más oscuro. Ese es todo el mecanismo, y vale la pena dejar claro a los estudiantes que no interviene ninguna especificidad química: una preparación de células de la mucosa yugal en un laboratorio escolar se tiñe más a menudo con azul de metileno, que se une a los ácidos nucleicos y da un núcleo azul más limpio. El precio de cualquiera de estos tintes es el mismo: matan la célula, por lo que nada de lo que se ve en el segundo portaobjetos está vivo.
Resumen de tareas por rango de calificaciones
Grado 9-10
- Enfoque utilizar correctamente el microscopio y ver por sí mismos para qué sirve una tinción.
- Actividades: prepare ambas laminillas y observe cada una a 40×, 100× y 400×; guarde y etiquete una imagen en cada aumento; dibuje lo que es visible en cada laminilla a 400× lado a lado; nombre las estructuras identificadas y diga qué objetos no pudieron ser identificados; establezca en una sola oración por qué la segunda laminilla es más fácil de leer; y dé la regla sobre el orden en que se usan los objetivos.
Undécimo grado
- Enfoque el lado cuantitativo de la microscopía: aumento, apertura numérica y campo de visión.
- Actividades: calcular la ampliación total de cada objetivo con el ocular de 10×; usar d = λ / (2 NA) con λ = 550 nm para calcular la resolución de los cuatro objetivos, incluido el de inmersión en aceite; estimar el diámetro de una célula epitelial comparándolo con el campo de visión; decidir a partir de esos números qué objetos de la Tabla 2 puede y no puede resolver cada objetivo; y explicar a qué se une el Lugol y por qué el núcleo absorbe más cantidad que el citoplasma.
12.º grado / Nivel universitario
- Enfoque el contraste como la limitación real de la microscopía óptica y el diseño de una preparación.
- Actividades: explicar por qué una célula sin teñir es casi invisible en el campo claro en términos de absorción e índice de refracción, y describir cómo el contraste de fase o el contraste de interferencia diferencial permiten recuperar la imagen sin necesidad de tinción; explicar la función del aceite de inmersión para elevar la apertura numérica por encima de 1 y calcular la resolución obtenida; distinguir entre el aumento de la magnificación y un aumento genuino del poder de resolución; justificar la elección de un colorante para esta muestra y comparar el Lugol con el azul de metileno y con la tinción de Gram, indicando qué revelaría cada uno; y explicar cómo se debería preparar y contar la muestra para que una afirmación sobre la abundancia bacteriana en la saliva sea defendible.
Elementos esenciales para el laboratorio
Instrumentos
- Microscopio compuesto con iluminador y cuatro objetivos: Plan 4/0.10, Plan 10/0.25, Plan 40/0.65 y Plan 100/1.25 de inmersión en aceite (sin usar), con un ocular de 10×
- Portaobjetos de microscopio (2)
- Cubreobjetos (2)
- Pinzas
- Goteros
- Vaso de precipitados (50 mL)
- Toalla de papel absorbente, para secar el exceso de líquido
Productos
- Saliva humana en suspensión
- Solución de yodo de Lugol 2 %