013 – Nutrienti

Ogni alimento è una miscela di molecole biologiche e quattro famiglie dominano: zuccheri semplici, amidi, lipidi e proteine. Sapere quale di esse un alimento contenga è alla base dell'etichettatura nutrizionale, dei consigli dietetici e del controllo di qualità nell'industria alimentare; e molto prima che esistessero gli strumenti, i chimici hanno stabilito la risposta con una manciata di reazioni colorimetriche che vengono ancora insegnate, e ancora usate come test di screening rapido, oggi.

Ogni test funziona perché un reagente reagisce con una specifica caratteristica chimica e produce un cambiamento visibile. La soluzione di Fehling viene ridotta dal gruppo aldeidico libero di uno zucchero riducente, e il rame(II) in essa contenuto viene convertito in ossido di rame(I) rosso mattone. Lo iodio di Lugol si infila nella spirale elica di una molecola di amido e forma un complesso iodio-amido intensamente colorato. Il Sudan IV è un colorante liposolubile che abbandona l'acqua e si scioglie in qualsiasi gocciolina lipidica presente, colorandola di rosso. Il reagente di Biuret, rame(II) in soluzione alcalina, forma un complesso violetto con i legami peptidici che uniscono gli amminoacidi in una proteina. Nessuno di questi test è sensibile ad altro, il che è ciò che rende il gruppo informativo.

In questo laboratorio analizzerete quattro alimenti di uso quotidiano — succo di mela, albume d'uovo, una soluzione di cereali e latte — per tutte e quattro le famiglie di nutrienti. Ciascun alimento è suddiviso tra una provetta, per il test di Fehling a caldo, e tre pozzetti di una micropiastra, uno per ciascuno dei test a freddo. Scalderete le provette di Fehling in un bagno d'acqua a una temperatura superiore a 70 °C, aggiungerete ciascun reagente al rispettivo pozzetto etichettato e registrerete le sedici osservazioni risultanti in una tabella dei risultati. Da quei colori ricaverete un profilo nutrizionale per ciascun alimento e lo confronterete con ciò che già sapete sull'origine di zuccheri, amido, grassi e proteine.

Obiettivi Educativi

Familiarizzazione con l'ambiente di laboratorio

• Individuare e utilizzare l'attrezzatura di un banco di biochimica: l'isolotto per provette, le micropiastre, la piastra riscaldante e il bagno maria, sostegni e morsetti, contagocce e micropipetta, bacchette di agitazione in vetro e il contenitore di recupero.

Uso dei dispositivi di protezione e manipolazione sicura dei reagenti

• Indossare guanti e protezione per gli occhi, e ricordare che la soluzione di Fehling e il reattivo di Biuret sono fortemente alcalini e corrosivi.
• Svuota ogni contenitore nel bidone di recupero anziché nel lavandino e riscalda le provette a bagnomaria anziché direttamente sulla piastra.

Preparazione e divisione dei campioni

• Misurare 10 mL di ciascun alimento con la pipetta e trasferirlo senza perdite nella provetta numerata corrispondente.
• Caricare i tre pozzetti della piastra per microtitolazione appartenenti a ciascun alimento e comprendere perché lo stesso campione debba essere suddiviso in pozzetti separati anziché essere testato in sequenza in uno solo.

Evitare la contaminazione incrociata

• Pulire la bacchetta di vetro dopo ogni agitazione.
• Spiega come un singolo contagocce o bastoncino non risciacquato possa trasformare un pozzetto negativo in positivo e invalidare l'intera piastra.

Esecuzione dei quattro test sui nutrienti

• Eseguire il test di Fehling con il bagno d'acqua portato oltre i 70 °C, e spiegare perché solo questo test richiede calore.
• Eseguire i test di Lugol, Sudan IV e Biuret a temperatura ambiente, aggiungendo il reattivo di Biuret nell'ordine corretto — prima l'alcali, poi il solfato di rame.

Lettura e registrazione dei risultati

• Registra ogni osservazione come un colore e classificala come positiva o negativa rispetto ai criteri stabiliti.
• Assembla le sedici osservazioni in un profilo nutrizionale per ciascuno dei quattro alimenti.

Interpretazione chimica delle reazioni cromatiche

• Mettere in relazione ciascun cambiamento di colore con il gruppo chimico rilevato: aldeide, elica di amido, fase lipidica, legame peptidico.
• Un'osservazione di controllo è necessaria per stabilire una linea di base e confrontarla con i risultati sperimentali, garantendo che l'esperimento funzioni correttamente e che non vi siano interferenze o contaminazioni esterne. La presenza di un colore in un alimento che dovrebbe risultare negativo significherebbe che c'è un falso positivo, indicando la presenza della sostanza testata anche quando non dovrebbe esserci, oppure la presenza di interferenze o contaminazioni nel campione o nei reagenti.

Protocollo

Preparazione di campioni alimentari

1. Con la pipetta, misurare 10 mL del campione di succo di mela.
2. Versare 10 mL di succo di mela nella provetta 1.
3. Usando un contagocce, mettere da 5 a 10 gocce di succo di mela in ciascuno dei tre pozzetti della piastra a pozzetti identificata «J».
4. Svuotare l'eccesso dal contagocce nel contenitore di recupero.
5. Ripetere i passaggi da 1 a 4 per:

• Gli albumi d'uovo, che andranno nella provetta 2 e nei 3 pozzetti della piastra a pozzetti identificata «B»
• La soluzione di cereali, che andrà nella provetta 3 e nei 3 pozzetti della piastra a pozzetti identificata «C»
• Il latte, che andrà nella provetta 4 e nei 3 pozzetti della piastra a pozzetti identificata «L».

Identificazione dei carboidrati semplici negli alimenti

1. Riempire un becher da 500 mL con 400 mL di acqua di rubinetto.
2. Inserisci l'agitatore magnetico nel becher.
3. Posizionare il becher sulla piastra riscaldante e impostarla a 75°C. Attendere che la temperatura venga raggiunta.
4. Attivare l'agitatore magnetico (pulsante a sinistra).
5. Usando la pipetta, aggiungere 10 mL di Fehling A in ciascuna delle provette da 1 a 4 contenenti l'alimento.
6. Usando la pipetta, aggiungere 10 mL di Fehling B in ciascuna delle provette da 1 a 4 contenenti gli alimenti.
7. Mescola il contenuto della provetta 1 agitando con un movimento circolare.
8. Ripetere il passaggio precedente con le altre tre provette.
9. Fissare un morsetto universale al supporto sinistro, sopra il becher da 500 mL preparato nel passaggio 1.
10. Fissare la provetta 1 al morsetto universale sopra il centro del becher.
11. Verificare che nel provettone venga raggiunta una temperatura superiore a 70°C.
12. Prendere la provetta 1 e rimetterla nella sua posizione originale sul portaprovette.
13. Mescolare il contenuto della provetta agitando per qualche secondo con la bacchetta di vetro.
14. Ripetere i passaggi da 10 a 13 con le provette 2, 3 e 4.
15. Abbassare la temperatura della piastra riscaldante a 15 °C.
16. Spegni l'agitatore magnetico.

Le osservazioni della reazione di controllo si trovano nella tabella dei risultati.

Identificazione dei carboidrati complessi negli alimenti

1. Usando il contagocce, aggiungere da 5 a 10 gocce di soluzione di Lugol in ciascuno dei 4 pozzetti identificati «Lugol».
2. Svuotare l'eccesso dal contagocce nel contenitore di recupero.
3. Mescolare il contenuto con la bacchetta di vetro. Attenzione: assicurarsi di pulire bene la bacchetta di vetro dopo ogni agitazione per evitare di mescolare le sostanze!

Identificazione dei lipidi negli alimenti

1. Usando il contagocce, aggiungere da 5 a 10 gocce di Sudan IV in ciascuno dei 4 pozzetti identificati «Sudan IV».
2. Svuotare l'eccesso dal contagocce nel contenitore di recupero.
3. Mescolare i contenuti con la bacchetta di vetro.

Identificazione di proteine negli alimenti

1. Usando il contagocce, mettere 1 goccia di idrossido di sodio (NaOH) in ciascuno dei 4 pozzetti identificati «Biuret».
2. Svuotare l'eccesso dal contagocce nel contenitore di recupero.
3. Usare la pipetta per prelevare 1 pipetta piena (10 mL) di solfato di rame (CuSO4).
4. Usando la pipetta, erogare 1 mL di solfato di rame (CuSO4) negli stessi pozzetti etichettati «Biuret».

• Il pozzetto «J» (Biuret)
• Il pozzetto «B» (Biuret)
• Il pozzetto «C» (Biuret)
• Il pozzetto «L» (Biuret)

5. Svuotare l'eccesso dalla pipetta nel contenitore di recupero.
6. Mescolare i contenuti con la bacchetta di vetro.

Le osservazioni si trovano nella tabella dei risultati.

• Un risultato positivo per la presenza di carboidrati semplici produrrà un precipitato rosso mattone (Cu₂O) nella provetta (reazione di Fehling).
• Un risultato positivo per la presenza di carboidrati complessi comporterà una colorazione viola (complesso iodio-amido) nel pozzetto (test di Lugol).
• Un risultato positivo alla presenza di lipidi provocherà una colorazione rossa (Sudan IV – complesso lipidico) nel pozzetto (test Sudan IV).
• Un risultato positivo per la presenza di proteine si tradurrà in una colorazione viola (complesso del biureto) nel pozzetto (test del biureto).

Risultati Previsti

L'insieme completo dei risultati. Quattro alimenti vengono testati per quattro nutrienti, fornendo sedici osservazioni. Il test di Fehling viene letto nella provetta riscaldata; gli altri tre vengono letti nei pozzetti della micropiastra etichettata.

Zuccheri semplici — test di Fehling. La soluzione di Fehling è rame(II) mantenuto in soluzione dal tartrato in ambiente fortemente alcalino. Uno zucchero riducente — glucosio, fruttosio, maltosio, lattosio, qualsiasi zucchero con un'aldeide libera o un anello che possa aprirsi per formarne una — viene ossidato da quel rame(II), che a sua volta si riduce a rame(I) e precipita come ossido di rame(I) rosso mattone:

R–CHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → R–COO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O

La reazione è lenta a temperatura ambiente, ed è per questo che solo questo test richiede il bagno d'acqua oltre i 70 °C; il protocollo prevede di confermare quella temperatura all'interno della provetta prima della lettura. Il succo di mela è positivo perché il succo di frutta è in gran parte fruttosio e glucosio liberi. Anche la soluzione di cereali è positiva, perché la degradazione parziale dell'amido lascia zuccheri riducenti nella sospensione. Il saccarosio, al contrario, darebbe un risultato negativo pur essendo uno zucchero, perché i suoi due anelli sono bloccati insieme e non rimane alcuna aldeide libera — un utile promemoria che «zucchero riducente» è una categoria più ristretta di «zucchero».

Amido — test di Lugol. Il reattivo di Lugol è iodio disciolto in ioduro di potassio, presente principalmente come ione triioduro I₃⁻. L'amilosio, la componente lineare dell'amido, si avvolge in un'elica il cui interno è largo appena a sufficienza per accogliere una catena di questi ioni. Il complesso di inclusione risultante assorbe fortemente al centro dello spettro visibile e appare da blu-nero a viola intenso. Solo la soluzione di cereali cambia colore; gli altri tre alimenti non contengono amido. Poiché il colore dipende dall'integrità dell'elica, riscaldare un pozzetto positivo farebbe sbiadire il blu — l'elica si svolge — e il colore tornerebbe con il raffreddamento.

Lipidi — test Sudan IV. Il Sudan IV è un lisocromo: un colorante senza affinità per l'acqua e con forte affinità per i grassi. Aggiunto a un pozzetto, si ripartisce quasi interamente in qualsiasi fase lipidica presente e la colora di rosso, lasciando pallida la fase acquosa. Il latte è positivo, perché il grasso del latte vi è disperso come un'emulsione di goccioline fini. Qui non viene consumato nulla chimicamente — è un test di solubilità, non una reazione, ed è per questo che funziona a freddo e immediatamente.

Proteine — test di Biuret. Il protocollo prevede di aggiungere prima l'idrossido di sodio e poi il solfato di rame, e l'ordine è importante: l'alcali è ciò che consente allo ione rame(II) di coordinarsi con gli atomi di azoto dello scheletro peptidico. Quattro di questi azoti provenienti da legami peptidici adiacenti chelano un Cu²⁺, e il complesso risultante assorbe intorno a 540 nm, dando il malva caratteristico. L'albume e il latte sono entrambi positivi, come i loro nomi in qualsiasi tabella nutrizionale farebbero prevedere. Il test richiede almeno due legami peptidici consecutivi, quindi una soluzione di amminoacidi liberi non darebbe alcun colore — il test rileva la proteina, non l'azoto.

Perché un pozzetto del test di Biuret positivo mostra sia un colore che un precipitato. I due segnali sono due composti diversi dello stesso rame. La tinta malva del liquido è il complesso del biureto stesso: il Cu²⁺ trattenuto dagli atomi di azoto dei legami peptidici adiacenti è solubile, quindi colora uniformemente l'intero pozzetto. Il precipitato è idrossido di rame(II), formato ovunque uno ione Cu²⁺ incontra gli ioni idrossido prima di incontrare un legame peptidico: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un solido azzurro pallido. L'idrossido di rame(II) è tra i meno solubili dei comuni idrossidi, quindi una volta che i legami peptidici presenti hanno preso la loro parte di rame, l'eccesso lascia la soluzione come questo solido. Le due osservazioni raccontano quindi una storia due volte: la proteina reclama parte del rame come complesso malva solubile e l'idrossido reclama il resto come solido.

Perché la provetta numero 4 diventa debolmente viola. Il latte nella provetta di Fehling sviluppa una lieve tinta violacea ma nessun precipitato rosso mattone. Questo non è un positivo di Fehling. La soluzione di Fehling fornisce rame(II) in ambiente fortemente alcalino — esattamente le condizioni del test di Biuret — quindi la proteina del latte forma il complesso violetto di Biuret nella provetta di Fehling. Letto in senso stretto, il risultato è: nessuno zucchero riducente rilevato. È una buona illustrazione del perché un positivo sia definito da un colore preciso e da una forma precisa, precipitato o colorazione, piuttosto che da «è successo qualcosa». Il latte contiene effettivamente lattosio, uno zucchero riducente, quindi un'incubazione più lunga o più calda dovrebbe dare anche un autentico precipitato rosso mattone.

Riepilogo del compito per intervallo di voti

Classe 9-10

• Concentrazione: le quattro famiglie di nutrienti e il colore che rivela ciascuna di esse, e un'attenta tecnica priva di contaminazioni.
• Attività: prepara i quattro campioni e riempi le provette e i pozzetti; esegui tutti e quattro i test; registra le sedici osservazioni nella tabella dei risultati come colori; indica quali sostanze nutritive contiene ciascun alimento e verifica se i risultati corrispondono a ciò che riporterebbe un'etichetta nutrizionale.

Undicesimo anno

• Concentrazione: la chimica dietro ogni cambiamento di colore e il ragionamento che trasforma un'osservazione in una conclusione.
• Attività: nominare il gruppo chimico rilevato da ciascun reattivo; spiegare perché solo il test di Fehling richiede un riscaldamento oltre i 70 °C; spiegare perché l'idrossido di sodio precede il solfato di rame nel test di Biuret; spiegare perché la soluzione di cereali risulti positiva sia al Fehling sia al Lugol; spiegare la lieve tinta violacea nella provetta 4 senza definirla un positivo di Fehling.

12ª classe / Livello universitario

• Concentrazione: specificità, controlli e limiti dell'analisi qualitativa.
• Attività: scrivere le semireazioni di ossido-riduzione relative al test di Fehling e identificare quale sostanza viene ossidata e quale ridotta; prevedere il risultato dell’analisi di una soluzione pura di saccarosio e giustificare la previsione; progettare i controlli positivi e negativi necessari affinché questo protocollo sia validabile, e indicare cosa ciascuno di essi escluderebbe; discutere la soglia di rilevamento di ciascun test e spiegare perché un risultato negativo costituisce una prova meno forte rispetto a uno positivo; descrivere in che modo il test di Biuret viene adattato per misurare quantitativamente la concentrazione proteica.

Materiale essenziale di laboratorio

Strumenti

• Provette 50 mL ×4
• Portaprovette
• Micropiastre (piastre a pozzetti) ×2
• Pipetta (10 mL)
• Contagocce (1 mL)
• Becher (500 mL)
• Piastra riscaldante
• Agitatore magnetico e ancoretta magnetica
• Termometro
• Supporto e morsetti
• Bacchette di vetro
• Spruzzetta
• Contenitore di recupero
• Carta da cucina
• Guanti e protezione per gli occhi

Prodotti

• Succo di mela
• Albume d'uovo in soluzione
• Cereali in sospensione
• Latte 3% grasso
• Acqua del rubinetto (bagno d'acqua, 400 mL)
• Reattivo di Fehling, soluzioni A e B
• Soluzione di iodio di Lugol al 2%
• Soluzione di Sudan IV
• Reattivo di Biureto — idrossido di sodio, NaOH 2,5 M
• Reagente di Biureto — solfato di rame, CuSO₄ 0,0094 M