013 – Nutrients

Tots els aliments són una barreja de molècules biològiques, i quatre famílies hi dominen: sucres simples, midons, lípids i proteïnes. Saber quines d'aquestes conté un aliment és la base de l'etiquetatge nutricional, del consell dietètic i del control de qualitat a la indústria alimentària —i molt abans que existissin instruments, els químics van establir la resposta amb un grapat de reaccions de color que encara s'ensenyen, i s'utilitzen com a proves de cribratge ràpid, avui dia.

Cada prova funciona perquè un reactiu reacciona amb una característica química específica i produeix un canvi visible. La solució de Fehling es redueix pel grup aldehid lliure d'un sucre reductor, i el coure(II) que conté es converteix en òxid de coure(I) de color vermell maó. El iode de Lugol s'escola dins l'espiral helicoidal d'una molècula de midó i forma un complex de iode-midó intensament acolorit. El Sudan IV és un colorant liposoluble que abandona l'aigua i es dissol en qualsevol gota de lípid present, tot tenyint-la de vermell. El reactiu de Biuret, coure(II) en solució alcalina, forma un complex violaci amb els enllaços peptídics que enllacen els aminoàcids en una proteïna. Cap d'aquestes proves no és sensible a res més, la qual cosa fa que el conjunt sigui informatiu.

En aquest laboratori analitzareu quatre aliments quotidians —suc de poma, clara d'ou, una solució de cereals i llet— per a les quatre famílies de nutrients. Cada aliment es divideix entre un tub d'assaig, per a la prova de Fehling calenta, i tres pous d'una microplaca, un per a cadascuna de les proves fredes. Escalfareu els tubs de Fehling al bany maria per damunt de 70 °C, afegireu cada reactiu al seu pou etiquetat i consignareu les setze observacions resultants en una taula de resultats. A partir d'aquests colors, construireu un perfil de nutrients per a cada aliment i el comparareu amb el que ja sabeu sobre d'on provenen els sucres, el midó, el greix i la proteïna.

Objectius educatius

Familiarització amb l'entorn del laboratori

• Localitzeu i utilitzeu l'equipament d'un banc de bioquímica: l'graduïa de tubs d'assaig, les microplaques, la placa calenta i el bany maria, els suports i pinces, els comptagotes i la micropipeta, les varetes d'agitació de vidre i el recipient de recuperació.

Ús d'equips de protecció i manipulació segura de reactius

• Porta guants i protecció ocular, i tingues present que la solució de Fehling i el reactiu de Biuret són fortament alcalins i corrosius.
• Buideu cada recipient al cubell de recuperació en lloc d'aigüera, i calfeu els tubs d'assaig al bany maria en lloc de directament sobre la placa.

Preparació i divisió de mostres

• Mesureu 10 mL de cada aliment amb la pipeta i transferiu-lo sense pèrdues al seu tub d'assaig numerat.
• Carregueu els tres pous de la microplaca pertanyents a cada aliment, i enteneu per què la mateixa mostra s'ha de dividir entre pous separats en lloc de provar-se seqüencialment en un de sol.

Evitar la contaminació creuada

• Netegeu la vareta de vidre després de cada agitació.
• Explicar com un sol degoteig o vareta sense esbandir pot convertir un pou negatiu en positiu i invalidar tota la placa.

Realització de les quatre proves de nutrients

• Fes la prova de Fehling amb el bany maria portat per sobre de 70 °C, i explica per què només aquesta prova requereix calor.
• Fes les proves de Lugol, Sudan IV i Biuret a temperatura ambient, afegint el reactiu de Biuret en l'ordre correcte — primer l'àlcali, després el sulfat de coure.

Lectura i registre de resultats

• Registreu cada observació com a color i clasifiqueu-la com a positiva o negativa segons els criteris establerts.
• Reuneix les setze observacions en un perfil de nutrients per a cadascun dels quatre aliments.

Interpretació química de les reaccions de color

• Relacioneu cada canvi de color amb el grup químic detectat: aldehid, hèlice de midó, fase lipídica, enllaç peptídic.
• Cal una observació de control per establir una línia de base o punt de referència, la qual cosa permet descartar falsos positius, assegurar que el mètode de prova funciona correctament i comparar els resultats amb certesa. Si un aliment que hauria de donar un resultat negatiu mostra un color, significaria que hi ha hagut un resultat positiu inesperat. Això podria indicar contaminació creuada, un error en el procediment de la prova, reactius defectuosos o la presència de la substància analitzada on no hauria de ser-hi.

Protocol

Preparació de mostres d'aliments

1. Amb la pipeta, mesureu 10 mL de la mostra de suc de poma.
2. Aboca els 10 mL de suc de poma al tub d'assaig 1.
3. Amb un comptagotes, poseu de 5 a 10 gotes de suc de poma a cadascun dels tres pous de la placa de pous identificada «J».
4. Buidar l'excés del comptagotes al recipient de recuperació.
5. Repetiu els passos de l'1 al 4 per a:

• Les clares d'ou, que aniran al tub d'assaig 2 i als 3 pous de la placa de pous identificada «B»
• La solució de cereals, que anirà al tub d'assaig 3 i als 3 pous de la placa de pous identificada «C»
• La llet, que anirà al tub d'assaig 4 i als 3 pous de la placa de pous identificada «L».

Identificació de carbohidrats simples en els aliments

1. Ompliu un vas de precipitats de 500 ml amb 400 ml d'aigua de l'aixeta.
2. Introduïu la vareta d'agitació magnètica al vas de precipitats.
3. Poseu el vas de precipitats a la placa calefactora i poseu-la a 75°C. Espereu fins que s'assoleixi la temperatura.
4. Encén l'agitador magnètic (botó esquerre).
5. Amb la pipeta, afegeix 10 mL de Fehling A a cadascun dels tubs d'assaig 1 a 4 que contenen l'aliment.
6. Amb la pipeta, afegeix 10 mL de Fehling B a cadascun dels tubs d'assaig 1 a 4 que contenen els aliments.
7. Barreja el contingut del tub d'assaig 1 fent-lo girar amb un moviment circular.
8. Repeteix el pas anterior amb els altres tres tubs d'assaig.
9. Fixa una pinça universal al suport esquerre, per sobre del vas de precipitats de 500 mL preparat al pas 1.
10. Fixa el tub d'assaig 1 a la pinça universal per sobre del centre del vas de precipitats.
11. Verificar que s'assoleix una temperatura superior a 70°C al tub d'assaig.
12. Pren el tub d'assaig 1 i torna'l a la seva posició original a la gradeta de tubs d'assaig.
13. Barreja el contingut del tub d'assaig removent uns segons amb la vareta de vidre.
14. Repetiu els passos 10 a 13 amb els tubs d'assaig 2, 3 i 4.
15. Abaixa la temperatura de la placa calefactora a 15 °C.
16. Apaga l'agitador magnètic.

Les observacions de la reacció de control es troben a la taula de resultats.

Identificació de carbohidrats complexos en aliments

1. Amb el comptagotes, afegeix de 5 a 10 gotes de solució de Lugol a cadascun dels 4 pous identificats «Lugol».
2. Buidar l'excés del comptagotes al recipient de recuperació.
3. Barreja el contingut amb la vareta de vidre. Atenció: assegura't de netejar bé la vareta de vidre després de cada remenada per evitar barrejar substàncies!

Identificació de lípids en aliments

1. Amb el comptagotes, afegeix de 5 a 10 gotes de Sudan IV a cadascun dels 4 pous identificats «Sudan IV».
2. Buidar l'excés del comptagotes al recipient de recuperació.
3. Barreja els continguts amb la vareta de vidre.

Identificació de proteïnes en aliments

1. Amb el comptagotes, posa 1 gota d'hidròxid de sodi (NaOH) a cadascun dels 4 pous identificats «Biuret».
2. Buidar l'excés del comptagotes al recipient de recuperació.
3. Utilitza la pipeta per extreure 1 pipeta plena (10 mL) de sulfat de coure (CuSO4).
4. Amb la pipeta, dispensa 1 mL de sulfat de coure (CuSO4) en aquests mateixos pous etiquetats «Biuret».

• El pou «J» (Biuret)
• El pou «B» (Biuret)
• El pou «C» (Biuret)
• El pou «L» (Biuret)

5. Buidar l'excés de la pipeta a la paperera de recuperació.
6. Barreja els continguts amb la vareta de vidre.

Les observacions es troben a la taula de resultats.

• Un resultat positiu per a la presència de carbohidrats simples donarà lloc a un precipitat vermell maó (Cu₂O) al tub d'assaig (reacció de Fehling).
• Un resultat positiu per a la presència de carbohidrats complexos donarà lloc a una coloració morada (complex iod-midó) al pou (test de Lugol).
• Un resultat positiu per a la presència de lípids donarà lloc a una coloració vermella (Sudan IV – complex de lípids) al pou (test de Sudan IV).
• Un resultat positiu per a la presència de proteïnes donarà lloc a una coloració porpra (complex de biuret) al pou (assaig de biuret).

Resultats previstos

El conjunt complet de resultats. Quatre aliments es proven per a quatre nutrients, la qual cosa dóna setze observacions. El test de Fehling es llegeix al tub d'assaig escalfat; els altres tres es llegeixen als pous de la microplaca etiquetats.

Sucres simples — prova de Fehling. La solució de Fehling és coure(II) mantingut en solució pel tartrat en un medi fortament alcalí. Un sucre reductor — glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, qualsevol sucre amb un aldehid lliure o amb un anell que es pugui obrir per formar-ne un — és oxidat per aquest coure(II), que al seu torn es redueix a coure(I) i precipita com a òxid de coure(I) vermell maó:

R–CHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → R–COO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O

La reacció és lenta a temperatura ambient, i per això només aquesta prova necessita el bany maria per sobre de 70 °C; el protocol et fa confirmar aquesta temperatura dins del tub abans de la lectura. El suc de poma és positiu perquè el suc de fruita és en gran part fructosa i glucosa lliures. La solució de cereals també és positiva, perquè la degradació parcial del midó deixa sucres reductors en la suspensió. La sacarosa, en canvi, donaria un resultat negatiu tot i ser un sucre, perquè els seus dos anells estan bloquejats entre ells i no queda cap aldehid lliure — un recordatori útil que «sucre reductor» és una categoria més estreta que «sucre».

Midó — prova de Lugol. El reactiu de Lugol és iode dissolt en iodur de potassi, present principalment com l'ió triiodur I₃⁻. L'amilosa, el component lineal del midó, s'enrotlla en una hèlix l'interior de la qual és just prou ample per acollir una cadena d'aquests ions. El complex d'inclusió resultant absorbeix fortament al mig de l'espectre visible i apareix de blau negrós a violeta fosc. Només la solució de cereals canvia de color; els altres tres aliments no contenen midó. Com que el color depèn que l'hèlix estigui intacta, escalfar un pou positiu faria empal·lidir el blau — l'hèlix es desenrotlla — i el color tornaria en refredar-se.

Lípids — prova de Sudan IV. El Sudan IV és un lisocrom: un colorant sense afinitat per l'aigua i amb una forta afinitat pels greixos. Afegit a un pou, passa gairebé del tot a qualsevol fase lipídica present i la tenyeix de vermell, deixant pàl·lida la fase aquosa. La llet és positiva, perquè el greix de la llet hi està dispers com una emulsió de gotetes fines. Aquí no es consumeix res químicament — és una prova de solubilitat, no una reacció, i per això funciona en fred i immediatament.

Proteïnes — prova de Biuret. El protocol diu que primer afegiu hidròxid de sodi i segon sulfat de coure, i l'ordre importa: l'àlcali és el que permet que l'ió coure(II) es coordini amb els àtoms de nitrogen de l'esquelet peptídic. Quatre d'aquests nitrògens d'enllaços peptídics adjacents quelen un Cu²⁺, i el complex resultant absorbeix al voltant de 540 nm, donant el malva característic. La clara d'ou i la llet són totes dues positives, com els seus noms en qualsevol taula nutricional farien preveure. La prova requereix almenys dos enllaços peptídics consecutius, de manera que una solució d'aminoàcids lliures no donaria cap color — la prova detecta la proteïna, no el nitrogen.

Per què un pou de Biuret positiu mostra tant un color com un precipitat. Els dos senyals són dos compostos diferents del mateix coure. El tint malva del líquid és el complex de biuret en si: el Cu²⁺ mantingut pels àtoms de nitrogen d'enllaços peptídics adjacents és soluble, de manera que acoloreix tot el pou de manera uniforme. El precipitat és hidròxid de coure(II), format allà on un ió Cu²⁺ troba ions hidròxid abans de trobar un enllaç peptídic: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un sòlid de color blau pàl·lid. L'hidròxid de coure(II) es troba entre els hidròxids comuns menys solubles, de manera que un cop els enllaços peptídics presents han pres la seva part del coure, l'excés abandona la solució en forma d'aquest sòlid. Per tant, les dues observacions expliquen una mateixa història dues vegades: la proteïna reclama una part del coure com a complex malva soluble, i l'hidròxid reclama la resta com a sòlid.

Per què el tub d'assaig 4 es torna lleugerament porpra. La llet al tub de Fehling desenvolupa un lleu tint violeta però cap precipitat vermell maó. Això no és un positiu de Fehling. La solució de Fehling aporta coure(II) en un medi fortament alcalí — exactament les condicions de la prova de Biuret — de manera que la proteïna de la llet forma el complex violeta de Biuret al tub de Fehling. Llegit estrictament, el resultat és: cap sucre reductor detectat. És una bona il·lustració de per què un positiu es defineix per un color amb nom i una forma amb nom, precipitat o coloració, i no per «alguna cosa ha passat». La llet sí que conté lactosa, un sucre reductor, així que una incubació més llarga o més calenta hauria de donar també un autèntic precipitat vermell maó.

Resum de tasques per rang de qualificació

De 9è a 10è grau

• Enfocament les quatre famílies de nutrients i el color que revela cadascuna, i una tècnica acurada i lliure de contaminació.
• Activitats: prepareu les quatre mostres i ompliu els tubs i els pous; executeu les quatre proves; registreu les setze observacions a la taula de resultats com a colors; indiqueu quins nutrients conté cada aliment i comproveu si els resultats coincideixen amb el que diria una etiqueta nutricional.

11è curs

• Enfocament la química darrere de cada canvi de color, i el raonament que converteix una observació en una conclusió.
• Activitats: anomenar el grup químic detectat per cada reactiu; explicar per què només la prova de Fehling necessita escalfament per sobre de 70 °C; explicar per què l'hidròxid de sodi precedeix el sulfat de coure en la prova de Biuret; explicar que la solució de cereals sigui positiva tant a Fehling com a Lugol; explicar el lleu violeta del tub d'assaig 4 sense anomenar-lo positiu de Fehling.

12è curs / Nivell universitari

• Enfocament especificitat, controls i els límits de l'anàlisi qualitativa.
• Activitats: escriure les semireaccions redox del test de Fehling i identificar què s'oxida i què es redueix; predir el resultat d'analitzar una solució de sacarosa pura i justificar la predicció; dissenyar els controls positius i negatius que aquest protocol necessitaria per ser defensable, i dir què descartaria cadascun; discutir el llindar de detecció de cada prova i per què un resultat negatiu és una evidència més feble que un de positiu; descriure com s'adapta el test de Biuret per mesurar quantitativament la concentració de proteïnes.

Equipament de laboratori

Instruments

• Tubs d'assaig 50 mL ×4
• Gradella per a tubs d'assaig
• Microplaques (plaques de pous) ×2
• Pipeta (10 mL)
• Comptagotes (1 mL)
• Got de precipitats (500 mL)
• Plaqueta elèctrica
• Agitador magnètic i barra d'agitació
• Termòmetre
• Suport i mordasses
• Barres de vidre
• Proveta de rentat
• Contenidor de recuperació
• Paper de cuina
• Guants i protecció ocular

Productes

• Suc de poma
• Clar d'ou en solució
• Cereals en suspensió
• Llet 3% greix
• Aigua de l'aixeta (bany maria, 400 mL)
• Reactiu de Fehling, solucions A i B
• Solució de iode de Lugol al 2%
• Solució de Sudan IV
• Reactiu de Biuret — hidròxid de sodi, NaOH 2,5 M
• Reagent de Biuret — sulfat de coure, CuSO₄ 0,0094 M