013 – Nutrientes

Todo alimento es una mezcla de moléculas biológicas, y cuatro familias dominan: azúcares simples, almidones, lípidos y proteínas. Saber cuál de ellas contiene un alimento es la base del etiquetado nutricional, del consejo dietético y del control de calidad en la industria alimentaria; y mucho antes de que existieran los instrumentos, los químicos establecieron la respuesta con un puñado de reacciones de color que todavía se enseñan, y todavía se utilizan como pruebas de detección rápida, hoy en día.

Cada prueba funciona porque un reactivo reacciona con una característica química específica y produce un cambio visible. La solución de Fehling es reducida por el grupo aldehído libre de un azúcar reductor, y el cobre(II) que contiene se convierte en óxido de cobre(I) de color rojo ladrillo. El yodo de Lugol se desliza en la espiral helicoidal de una molécula de almidón y forma un complejo de yodo y almidón intensamente coloreado. El Sudán IV es un tinte liposoluble que abandona el agua y se disuelve en cualquier gota de lípido presente, tiñéndola de rojo. El reactivo de Biuret, cobre(II) en solución alcalina, forma un complejo violeta con los enlaces peptídicos que unen los aminoácidos en una proteína. Ninguna de estas pruebas es sensible a ninguna otra cosa, lo que es lo que hace que el conjunto sea informativo.

En este laboratorio analizará cuatro alimentos cotidianos —jugo de manzana, clara de huevo, una solución de cereal y leche— para las cuatro familias de nutrientes. Cada alimento se divide entre un tubo de ensayo, para la prueba de Fehling calentada, y tres pocillos de una microplaca, uno para cada una de las pruebas en frío. Calentará los tubos de Fehling en un baño de agua a más de 70 °C, añadirá cada reactivo a su pocillo etiquetado y registrará las dieciséis observaciones resultantes en una tabla de resultados. A partir de esos colores, elaborará un perfil de nutrientes para cada alimento y lo comparará con lo que ya sabe sobre el origen de los azúcares, el almidón, las grasas y las proteínas.

Metas educativas

Familiarización con el entorno de laboratorio

• Localice y utilice el equipo de una mesa de bioquímica: la gradilla para tubos de ensayo, las microplacas, la placa calefactora y el baño maría, los soportes y las pinzas, los goteros y la micropipeta, las varillas agitadoras de vidrio y el recipiente de recuperación.

Uso de equipo de protección y manejo seguro de reactivos

• Use guantes y protección ocular, y reconozca que la solución de Fehling y el reactivo de Biuret son fuertemente alcalinos y corrosivos.
• Vacíe todos los recipientes en el recipiente de recuperación en lugar del fregadero y caliente los tubos de ensayo en un baño María en lugar de directamente en la placa.

Preparación y división de muestras

• Mida 10 mL de cada alimento con la pipeta y transfiéralo sin pérdida a su tubo de ensayo numerado.
• Cargue los tres pozos de la placa de microtitulación correspondientes a cada alimento y comprenda por qué la misma muestra debe dividirse en pozos separados en lugar de analizarse secuencialmente en uno solo.

Evitar la contaminación cruzada

• Limpie la varilla de vidrio después de cada agitación.
• Explicar cómo un solo gotero o varilla sin enjuagar puede volver positivo un pocillo negativo e invalidar toda la placa.

Realización de las cuatro pruebas de nutrientes

• Lleve a cabo la prueba de Fehling con el baño María llevado a más de 70 °C y explique por qué esta prueba por sí sola requiere calor.
• Realice las pruebas de Lugol, Sudán IV y Biuret a temperatura ambiente, agregando el reactivo de Biuret en el orden correcto: primero el álcali y luego el sulfato de cobre.

Lectura y registro de resultados

• Registre cada observación como un color y clasifíquela como positiva o negativa según los criterios establecidos.
• Agrupe las dieciséis observaciones en un perfil nutricional para cada uno de los cuatro alimentos.

Interpretación química de las reacciones de color

• Relacione cada cambio de color con el grupo químico que se está detectando: aldehído, hélice de almidón, fase lipídica, enlace peptídico.
• Una observación de control es necesaria para establecer una línea base y asegurar que el experimento funciona correctamente, permitiendo comparar los resultados y descartar falsos positivos o contaminación. Si aparece color en un alimento que debería dar negativo, significa que hay contaminación cruzada, presencia de interferencias químicas o un resultado positivo falso.

Protocolo

Preparación de muestras de alimentos

1. Con la pipeta, mida 10 mL de la muestra de jugo de manzana.
2. Vierta los 10 mL de jugo de manzana en el tubo de ensayo 1.
3. Usando un gotero, coloque de 5 a 10 gotas de jugo de manzana en cada uno de los tres pozos de la placa de toque identificados con la letra “J”.
4. Vacíe el exceso del cuentagotas en el recipiente de recuperación.
5. Repita los pasos 1 a 4 para:

• Claras de huevo que irán al tubo de ensayo 2 y a los 3 pozos de la placa de toque identificados con la letra “B”
• Solución de cereal que irá en el tubo de ensayo 3 y en los 3 pozos de la placa de toque identificados como “C”
• Leche que irá al tubo de ensayo 4 y a los 3 pozos de la placa de toque identificados con la letra “L”.

Identificación de carbohidratos simples en los alimentos

1. Vierta 400 mL de agua de la llave en un vaso de precipitados de 500 mL.
2. Introduzca la barra de agitación magnética en el vaso de precipitados.
3. Coloque el vaso de precipitados en la placa calefactora y ajústela a 75 °C. Espere hasta que se alcance la temperatura.
4. Enciende el agitador magnético (botón izquierdo).
5. Usando la pipeta, añada 10 mL de Fehling A a cada uno de los tubos de ensayo del 1 al 4 que contienen el alimento.
6. Usando la pipeta, agregue 10 mL de Fehling B a cada uno de los tubos de ensayo del 1 al 4 que contienen los alimentos.
7. Mezcle el contenido del tubo de ensayo 1 agitándolo con un movimiento circular.
8. Repita el paso anterior con los otros tres tubos de ensayo.
9. Coloque una pinza universal en el soporte izquierdo, arriba del vaso de precipitados de 500 mL preparado en el paso 1.
10. Asegure el tubo de ensayo 1 a la pinza universal por encima del centro del vaso de precipitados.
11. Verifique que se alcance una temperatura superior a 70 °C en el tubo de ensayo.
12. Toma el tubo de ensayo n.º 1 y colócalo de nuevo en su posición original en el soporte para tubos de ensayo.
13. Mezcle el contenido del tubo de ensayo agitándolo durante unos segundos con la varilla de vidrio.
14. Repita los pasos 10 a 13 con los tubos de ensayo 2, 3 y 4.
15. Baje la temperatura de la placa calefactora a 15 °C.
16. Apague el agitador magnético.

Las observaciones de la reacción de control se encuentran en la tabla de resultados.

Identificación de carbohidratos complejos en los alimentos

1. Usando el gotero, agregue de 5 a 10 gotas de solución de Lugol en cada uno de los 4 pozos identificados como “Lugol”.
2. Vacíe el exceso del cuentagotas en el recipiente de recuperación.
3. Mezcle el contenido usando la varilla de vidrio. Precaución: asegúrese de limpiar bien la varilla de vidrio después de cada agitación para evitar mezclar sustancias.

Identificación de lípidos en los alimentos

1. Con el gotero, agregue de 5 a 10 gotas de Sudán IV en cada uno de los 4 pozos identificados como “Sudán IV”.
2. Vacíe el exceso del cuentagotas en el recipiente de recuperación.
3. Mezcle el contenido usando la varilla de vidrio.

Identificación de proteínas en alimentos

1. Usando el gotero, coloque 1 gota de hidróxido de sodio (NaOH) en cada uno de los 4 pozos identificados como “Biuret”.
2. Vacíe el exceso del cuentagotas en el recipiente de recuperación.
3. Use la pipeta para extraer 1 pipeta llena (10 mL) de sulfato de cobre (CuSO4).
4. Usando la pipeta, dispense 1 mL de sulfato de cobre (CuSO4) en estos mismos pocillos etiquetados como “Biuret”.

• El pozo “J” (Biuret)
• El pozo “B” (Biuret)
• El pozo “C” (Biuret)
• El pozo “L” (Biuret)

5. Vacíe el exceso de la pipeta en el recipiente de recuperación.
6. Mezcle el contenido usando la varilla de vidrio.

Las observaciones se encuentran en la tabla de resultados.

• Un resultado positivo para la presencia de carbohidratos simples dará como resultado un precipitado rojo ladrillo (Cu₂O) en el tubo de ensayo (reacción de Fehling).
• Un resultado positivo para la presencia de carbohidratos complejos dará como resultado una coloración púrpura (complejo yodo-almidón) en el pocillo (prueba de Lugol).
• Un resultado positivo para la presencia de lípidos dará como resultado una coloración roja (complejo Sudán IV – lípidos) en el pocillo (prueba de Sudán IV).
• Un resultado positivo para la presencia de proteínas dará lugar a una coloración púrpura (complejo de Biuret) en el pocillo (prueba de Biuret).

Resultados esperados

El conjunto completo de resultados. Cuatro alimentos son evaluados para cuatro nutrientes, lo que da dieciséis observaciones. La prueba de Fehling se lee en el tubo de ensayo caliente; las otras tres se leen en los pocillos rotulados de la microplaca.

Azucares simples: prueba de Fehling. La solución de Fehling es cobre(II) mantenido en solución por tartrato en un álcali fuerte. Un azúcar reductor —glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, cualquier azúcar con un aldehído libre o un anillo que pueda abrirse a uno— es oxidado por ese cobre(II), el cual se reduce a su vez a cobre(I) y precipita como óxido de cobre(I) de color rojo ladrillo:

R–CHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → R–COO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O

La reacción es lenta a temperatura ambiente, por lo que esta prueba por sí sola requiere el baño María por encima de 70 °C; el protocolo indica confirmar esa temperatura dentro del tubo antes de realizar la lectura. El jugo de manzana da positivo porque el jugo de fruta contiene principalmente fructosa y glucosa libres. La solución de cereal también da positivo, porque la descomposición parcial del almidón deja azúcares reductores en la suspensión. La sacarosa, por el contrario, daría un resultado negativo a pesar de ser un azúcar, porque sus dos anillos están unidos y no queda ningún aldehído libre; un recordatorio útil de que “azúcar reductor” es una categoría más limitada que “azúcar”.

Almidón: prueba de Lugol. El reactivo de Lugol es yodo disuelto en yoduro de potasio, presente principalmente como el ion triyoduro I₃⁻. La amilosa, el componente lineal del almidón, se enrolla en una hélice cuyo interior es apenas lo suficientemente ancho para aceptar una cadena de estos yones. El complejo de inclusión resultante absorbe intensamente en el centro del espectro visible y se ve de azul a negro y de púrpura oscuro. Solo la solución de cereal vira; los otros tres alimentos no contienen almidón. Debido a que el color depende de que la hélice esté intacta, calentar un pocillo positivo haría que el azul se desvanezca —la hélice se desenrolla— y este regresaría al enfriarse.

Lípidos: prueba de Sudán IV. Sudán IV es un liocromo: un tinte sin afinidad por el agua y con una fuerte afinidad por las grasas. Al añadirse a un pocillo, se distribuye casi por completo en cualquier fase lipídica presente y la tiñe de rojo, dejando la fase acuosa pálida. La leche da positivo, porque la grasa de la leche está dispersa en ella como una emulsión de pequeñas gotitas. Aquí no se consume nada químicamente; se trata de una prueba de solubilidad, no de una reacción, razón por la cual funciona en frío y de manera inmediata.

Proteínas — Prueba de Biuret. El protocolo indica que se debe agregar hidróxido de sodio primero y sulfato de cobre en segundo lugar, y el orden importa: el álcali es lo que permite que el ion cobre(II) se coordine con los átomos de nitrógeno del esqueleto peptídico. Cuatro de estos nitrógenos de enlaces peptídicos adyacentesquelatan a un Cu²⁺, y el complejo resultante absorbe alrededor de 540 nm, lo que produce el color malva característico. Tanto la clara de huevo como la leche dan positivo, como lo predirían sus nombres en cualquier tabla nutricional. La prueba requiere al menos dos enlaces peptídicos en secuencia, por lo que una solución de aminoácidos libres no daría color; la prueba detecta proteínas, no nitrógeno.

Por qué un pocillo de Biuret positivo muestra tanto un color como un precipitado. Las dos señales son dos compuestos diferentes del mismo cobre. El tinte malva del líquido es el complejo de biuret en sí: el Cu²⁺ retenido por los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos adyacentes es soluble, por lo que colorea todo el pocillo de manera uniforme. El precipitado es hidróxido de cobre(II), formado dondequiera que un Cu²⁺ ion se encuentra con los iones hidróxido antes de encontrarse con un enlace peptídico: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un sólido de color azul pálido. El hidróxido de cobre(II) se encuentra entre los hidróxidos comunes menos solubles, por lo que una vez que los enlaces peptídicos presentes han tomado su parte del cobre, el exceso sale de la solución en forma de este sólido. Las dos observaciones cuentan, por tanto, una misma historia dos veces: la proteína reclama parte del cobre como un complejo malva soluble, y el hidróxido reclama el resto como un sólido.

¿Por qué el tubo de ensayo 4 se vuelve tenuemente morado?. La leche en el tubo de Fehling desarrolla un tinte púrpura pálido pero ningún precipitado rojo ladrillo. Esto no es un Fehling positivo. La solución de Fehling suministra cobre(II) en álcali fuerte —exactamente las condiciones de la prueba de Biuret— de modo que la proteína de la leche forma el complejo violeta de Biuret en el tubo de Fehling. Interpretado estrictamente, el resultado es: no se detectó azúcar reductor. Es un buen ejemplo de por qué un positivo se define por un color determinado y una forma determinada, precipitado o coloración, en lugar de por “algo sucedió”. La leche sí contiene lactosa, un azúcar reductor, por lo que cabría esperar que una incubación más prolongada o más caliente también diera un auténtico precipitado rojo ladrillo.

Resumen de tareas por rango de calificaciones

Grado 9-10

• Enfoque las cuatro familias de nutrientes y el color que revela a cada una, y una técnica cuidadosa y libre de contaminación.
• Actividades: prepara las cuatro muestras y carga los tubos y los pozos; ejecuta las cuatro pruebas; registra las dieciséis observaciones en la tabla de resultados como colores; indica qué nutrientes contiene cada alimento y verifica si los resultados coinciden con lo que diría una etiqueta nutricional.

Undécimo grado

• Enfoque la química detrás de cada cambio de color y el razonamiento que convierte una observación en una conclusión.
• Actividades: Nombre el grupo químico detectado por cada reactivo; explique por qué solo la prueba de Fehling necesita calentamiento por encima de 70 °C; explique por qué el hidróxido de sodio precede al sulfato de cobre en la prueba de Biuret; explique por qué la solución de cereal da positivo tanto para Fehling como para Lugol; explique el púrpura tenue en el tubo de ensayo 4 sin llamarlo un Fehling positivo.

12.º grado / Nivel universitario

• Enfoque la especificidad, los controles y los límites del análisis cualitativo.
• Actividades: escribe las semirreacciones redox de la prueba de Fehling e identifica qué se oxida y qué se reduce; predecir el resultado de realizar la prueba con una solución pura de sacarosa y justificar la predicción; diseñar los controles positivos y negativos que este protocolo necesitaría para ser válido, y explicar qué descartaría cada uno; analizar el umbral de detección de cada prueba y por qué un resultado negativo es una evidencia menos sólida que uno positivo; describir cómo se adapta la prueba de Biuret para medir la concentración de proteínas de manera cuantitativa.

Elementos esenciales para el laboratorio

Instrumentos

• Tubos de ensayo de 50 mL ×4
• Gradilla para tubos de ensayo
• Microplacas (placas de pozos) ×2
• Pipeta (10 mL)
• Goteros (1 mL)
• Vaso de precipitado (500 mL)
• Hornilla eléctrica
• Agitador magnético y barra magnética
• Termómetro
• Soporte y abrazaderas
• Varillas de vidrio
• Frasco lavador
• Contenedor de recuperación
• Toalla de papel
• Guantes y protección ocular

Productos

• Jugo de manzana
• Clara de huevo en solución
• Cereales en suspensión
• Leche 3% grasa
• Agua de la llave (baño de agua, 400 mL)
• reactivo de Fehling, soluciones A y B
• Solución de yodo de Lugol 2%
• Solución de Sudán IV
• Reactivo de Biuret: hidróxido de sodio, NaOH 2,5 M
• Reactivo de Biuret: sulfato de cobre, CuSO₄ 0.0094 M