013 – Živiny

Každá potravina je směsí biologických molekul, přičemž doménu tvoří čtyři skupiny: jednoduché cukry, škroby, lipidy a bílkoviny. Vědomost o tom, které z nich potravina obsahuje, je základem nutričního značení, výživového poradenství a kontroly kvality v potravinářském průmyslu – a již dávno předtím, než existovaly přístroje, chemici tuto otázku zodpověděli pomocí několika barevných reakcí, které se dodnes vyučují a používají jako rychlé orientační testy.

Každý test funguje tak, že činidlo reaguje s jedním specifickým chemickým znakem a vyvolá viditelnou změnu. Fehlingovo činidlo je redukováno volnou aldehydovou skupinou redukujícího cukru a měďnaté ionty, které obsahuje, se přeměňují na cihlově červený oxid měďný. Lugolův roztok zapadá do šroubovicové smyčky molekuly škrobu a vytváří intenzivně zbarvený komplex jodu a škrobu. Sudan IV je barvivo rozpustné v tucích, které opouští vodu a rozpouští se v jakékoli přítomné lipidové kapénce, kterou zbarví červeně. Biuretové činidlo, což je měďnatý iont v alkalickém roztoku, tvoří fialový komplex s peptidovými vazbami, které spojují aminokyseliny v bílkovině. Žádný z těchto testů není citlivý na nic jiného, což je to, co činí tuto sadu vypovídající.

V této laboratoři budete analyzovat čtyři běžné potraviny – jablečný džus, vaječný bílek, obilný roztok a mléko – na přítomnost všech čtyř skupin živin. Každá potravina je rozdělena do jedné zkumavky pro zahřívaný Fehlingův test a do tří jamek mikrotitrační destičky, a to pro každý ze tří studených testů. Zkumavky s Fehlingovým činidlem zahřejete ve vodní lázni nad 70 °C, do každé označené jamky přidáte příslušné činidlo a výsledných šestnáct pozorování zaznamenáte do tabulky výsledků. Z těchto barev sestavíte nutriční profil pro každou potravinu a porovnáte jej s tím, co již víte o zdroji cukrů, škrobu, tuků a bílkovin.

Vzdělávací cíle

Seznámení s laboratorním prostředím

• Vyhledejte a použijte vybavení biochemického pracovního stolu: stojan na zkumavky, mikrodestičky, topnou desku a vodní lázeň, stojany a svorky, kapátka a micropipetu, skleněné tyčinky na míchání a nádobu na odpad.

Použití ochranných prostředků a bezpečné zacházení s činidly

• Noste rukavice a ochranu očí a mějte na paměti, že Fehlingovo činidlo i biuretové činidlo jsou silně zásadité a žíravé.
• Všechny nádoby vyprázdněte do záchytné nádoby namísto do dřezu a zkumavky zahřívejte ve vodní lázni namísto přímo na plotýnce.

Příprava a dělení vzorků

• Odměřte 10 mL každé potraviny pipetou a přeneste je beze ztrát do očíslované zkumavky.
• Naplňte tři jamky mikrodestičky patřící ke každé potravině a pochopte, proč musí být stejný vzorek rozdělen do samostatných jamek namísto postupného testování v jedné.

Zamezení křížové kontaminaci

• Po každém míchání očistěte skleněnou tyčinku.
• Vysvětlete, jak může jedno neopláchnuté kapátko nebo tyčinka proměnit negativní jamku v pozitivní a znehodnotit celou destičku.

Provádění čtyř testů živin

• Proveďte Fehlingův test s vodní lázní zahřátou nad 70 °C a vysvětlete, proč jako jediný vyžaduje teplo.
• Proveďte testy s Lugolovým roztokem, Sudanem IV a biuretovým činidlem při pokojové teplotě a biuretové činidlo přidávejte ve správném pořadí — nejprve zásadu, poté síran měďnatý.

Čtení a zaznamenávání výsledků

• Zaznamenejte každé pozorování jako barvu a klasifikujte jej jako pozitivní nebo negativní vůči stanoveným kritériím.
• Sestavte šestnáct pozorování do nutričního profilu pro každou ze čtyř potravin.

Chemická interpretace barevných reakcí

• Přiřaďte každou změnu barvy detekované chemické skupině: aldehyd, šroubovice škrobu, lipidová fáze, peptidová vazba.
• Kontrolní pozorování je nutné k tomu, aby sloužilo jako srovnávací základna (blank), která potvrdí, že test funguje správně a že výsledky nejsou ovlivněny vnějšími faktory nebo falešnou pozitivitou. Pokud by potravina, která by měla mít negativní výsledek, vykazovala zbarvení, znamenalo by to falešně pozitivní výsledek, což značí kontaminaci, chybu v testovací proceduře nebo přítomnost interferujících látek.

Protokol

Příprava potravinových vzorků

1. Pipetou odměřte 10 mL vzorku jablečného džusu.
2. Nalijte 10 ml jablečného džusu do zkumavky 1.
3. Pomocí kapátka naneste 5 až 10 kapek jablečného džusu do každé ze tří jamek destičky označené «J».
4. Vylijte přebytek z kapátka do sběrné nádoby.
5. Opakujte kroky 1 až 4 pro:

• Vaječné bílky, které přijdou do zkumavky 2 a do 3 jamek destičky označené «B»
• Obilný roztok, který přijde do zkumavky 3 a do 3 jamek destičky označené «C»
• Mléko, které přijde do zkumavky 4 a do 3 jamek destičky označené «L».

Identifikace jednoduchých sacharidů v potravinách

1. Nalijte 400 ml kohoutkové vody do 500 ml kádinky.
2. Vložte magnetickou míchací tyčinku do kádinky.
3. Položte kádinku na plotýnku a nastavte na 75 °C. Počkejte, až se teploty dosáhne.
4. Zapněte magnetické míchadlo (levé tlačítko).
5. Pomocí pipety přidejte 10 mL Fehlingova roztoku A do každé ze zkumavek 1 až 4 obsahujících potravinu.
6. Pomocí pipety přidejte 10 mL Fehlingova roztoku B do každé ze zkumavek 1 až 4 obsahujících potraviny.
7. Smíchejte obsah zkumavky 1 krouživým pohybem.
8. Zopakujte předchozí krok s ostatními třemi zkumavkami.
9. Připevněte univerzální svorku na levý stojan, nad 500 mL kádinku připravenou v kroku 1.
10. Upevněte zkumavku 1 do univerzální svorky nad středem kádinky.
11. Ověřte, že se ve zkumavce dosáhlo teploty nad 70 °C.
12. Vezměte zkumavku 1 a vraťte ji na její původní místo ve stojanu na zkumavky.
13. Promíchejte obsah zkumavky několikasekundovým mícháním skleněnou tyčinkou.
14. Opakujte kroky 10 až 13 se zkumavkami 2, 3 a 4.
15. Snižte teplotu plotýnky na 15 °C.
16. Vypni magnetické míchadlo.

Pozorování kontrolní reakce jsou uvedena v tabulce výsledků.

Identifikace komplexních sacharidů v potravinách

1. Pomocí kapátka přidejte 5 až 10 kapek Lugolova roztoku do každé ze 4 jamek označených «Lugol».
2. Vylijte přebytek z kapátka do sběrné nádoby.
3. Promíchejte obsah skleněnou tyčinkou. Pozor: po každém míchání skleněnou tyčinku dobře očistěte, aby nedošlo ke smíchání látek!

Identifikace lipidů v potravinách

1. Pomocí kapátka přidejte 5 až 10 kapek Sudanu IV do každé ze 4 jamek označených «Sudan IV».
2. Vylijte přebytek z kapátka do sběrné nádoby.
3. Obsah promíchejte skleněnou tyčinkou.

Identifikace bílkovin v potravinách

1. Pomocí kapátka naneste 1 kapku hydroxidu sodného (NaOH) do každé ze 4 jamek označených «Biuret».
2. Vylijte přebytek z kapátka do sběrné nádoby.
3. Pomocí pipety nasajte 1 plnou pipetu (10 mL) síranu měďnatého (CuSO4).
4. Pomocí pipety naneste 1 mL síranu měďnatého (CuSO4) do týchž jamek označených «Biuret».

• Jamka «J» (Biuret)
• Jamka «B» (Biuret)
• Jamka «C» (Biuret)
• Jamka «L» (Biuret)

5. Vylijte přebytečnou tekutinu z pipety do sběrné nádoby.
6. Obsah promíchejte skleněnou tyčinkou.

Pozorování jsou uvedena v tabulce výsledků.

• Pozitivní výsledek pro přítomnost jednoduchých sacharidů se projeví cihlově červenou sraženinou (Cu₂O) ve zkumavce (Fehlingova reakce).
• Pozitivní výsledek pro přítomnost komplexních sacharidů se projeví fialovým zbarvením (jód-škrobový komplex) ve jamce (Lugolův test).
• Pozitivní výsledek testu na přítomnost lipidů se projeví zbarvením do červena (komplex Sudan IV – lipidy) v jamce (test Sudan IV).
• Pozitivní výsledek pro přítomnost bílkovin se projeví zbarvením do fialova (biuretový komplex) ve jamce (biuretový test).

Předvídané výsledky

Kompletní sada výsledků. Čtyři potraviny jsou testovány na čtyři živiny, což dává šestnáct pozorování. Fehlingova zkouška se odečítá v zahřáté zkumavce; ostatní tři se odečítají v označených jamkách mikrotitrační destičky.

Jednoduché cukry — Fehlingův test. Fehlingovo činidlo je měď(II) udržovaná v roztoku vinanem v silně zásaditém prostředí. Redukující cukr — glukóza, fruktóza, maltóza, laktóza, jakýkoli cukr s volnou aldehydovou skupinou nebo s kruhem, který se na ni může otevřít — je touto mědí(II) oxidován; měď se přitom redukuje na měď(I) a sráží se jako cihlově červený oxid měďný:

R–CHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → R–COO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O

Reakce probíhá při pokojové teplotě pomalu, a proto jako jediný z testů vyžaduje vodní lázeň nad 70 °C; protokol vás vede k ověření této teploty uvnitř zkumavky před odečtem. Jablečný džus je pozitivní, protože ovocná šťáva je z velké části tvořena volnou fruktózou a glukózou. Pozitivní je i obilný roztok, protože částečný rozklad škrobu zanechává v suspenzi redukující cukry. Sacharóza by naopak dala negativní výsledek, přestože je to cukr, protože její dva kruhy jsou vzájemně uzamčené a žádný volný aldehyd nezbývá — užitečná připomínka, že «redukující cukr» je užší kategorie než «cukr».

Škrob — Lugolův test. Lugolovo činidlo je jod rozpuštěný v jodidu draselném, přítomný převážně jako trijodidový ion I₃⁻. Amylóza, lineární složka škrobu, se vine do šroubovice, jejíž vnitřek je právě tak široký, aby pojal řetězec těchto iontů. Vzniklý inkluzní komplex silně absorbuje uprostřed viditelného spektra a jeví se modročerný až tmavě fialový. Zbarví se pouze obilný roztok; ostatní tři potraviny škrob neobsahují. Protože barva závisí na neporušené šroubovici, zahřátím pozitivní jamky by modř vybledla — šroubovice se rozvine — a po ochlazení by se barva vrátila.

Lipidy — test Sudan IV. Sudan IV je lysochrom: barvivo bez afinity k vodě a se silnou afinitou k tukům. Po přidání do jamky přejde téměř celé do jakékoli přítomné lipidové fáze a obarví ji červeně, zatímco vodná fáze zůstane bledá. Mléko je pozitivní, protože mléčný tuk je v něm rozptýlen jako emulze jemných kapének. Chemicky se zde nic nespotřebovává — jde o test rozpustnosti, ne o reakci, a proto funguje za studena a okamžitě.

Bílkoviny — biuretový test. Protokol předepisuje přidat nejdříve hydroxid sodný a jako druhý síran měďnatý, přičemž na pořadí záleží: alkálie je to, co umožňuje iontu měďnatému koordinovat se s atomy dusíku peptidové kostry. Čtyři takové dusíky z přilehlých peptidových vazeb chelatují jeden Cu²⁺a vzniklý komplex absorbuje kolem 540 nm, což dává charakteristickou fialovou. Vaječný bílek i mléko jsou oba pozitivní, jak by jejich názvy v jakékoli nutriční tabulce napovídaly. Test vyžaduje alespoň dvě po sobě jdoucí peptidové vazby, takže roztok volných aminokyselin by žádnou barvu nedal — test detekuje bílkovinu, nikoli dusík.

Proč pozitivní Biuretova jamka vykazuje jak barvu, tak sraženinu. Tyto dva signály jsou dvě různé sloučeniny téže mědi. Fialový nádech tekutiny je samotný biuretový komplex: Cu²⁺ zadržený atomy dusíku sousedních peptidových vazeb je rozpustný, takže rovnoměrně zbarví celou jamku. Sraženinou je hydroxid měďnatý, který vzniká všude tam, kde iont Cu²⁺ se setká s hydroxidovými ionty dříve, než se setká s peptidovou vazbou: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), světle modrá pevná látka. Hydroxid měďnatý patří mezi nejméně rozpustné z běžných hydroxidů, takže jakmile přítomné peptidové vazby spotřebují svůj podíl mědi, přebytek opustí roztok v podobě této pevné látky. Obě pozorování tedy vyprávějí jeden příběh dvakrát: protein si přisvojí část mědi jako rozpustný fialový komplex a hydroxid si zbytek nárokuje jako pevnou látku.

Proč zkumavka 4 zbledne do fialova. Mléko ve Fehlingově zkumavce získá slabý fialový nádech, ale žádnou cihlově červenou sraženinu. To není Fehlingův pozitivní výsledek. Fehlingovo činidlo dodává měď(II) v silně zásaditém prostředí — přesně podmínky biuretového testu — takže mléčná bílkovina vytvoří ve Fehlingově zkumavce fialový biuretový komplex. Přísně vzato zní výsledek: nebyl zjištěn žádný redukující cukr. Je to dobrá ilustrace toho, proč je pozitivní výsledek definován pojmenovanou barvou a pojmenovanou formou, sraženinou nebo zbarvením, a ne tím, že «se něco stalo». Mléko laktózu, redukující cukr, skutečně obsahuje, takže při delší nebo teplejší inkubaci by se dala očekávat i skutečná cihlově červená sraženina.

Shrnutí úkolů podle věkové kategorie

9. až 10. ročník

• Zaměření čtyři rodiny živin a barva, která každou z nich odhaluje, a pečlivá technika bez kontaminace.
• Aktivity: Připravte čtyři vzorky a naplňte zkumavky a jamky; proveďte všechny čtyři testy; zapište šestnáct pozorování do tabulky výsledků jako barvy; uveďte, jaké živiny každá potravina obsahuje, a zkontrolujte, zda výsledky odpovídají tomu, co by uváděla nutriční tabulka.

11. ročník

• Zaměření chemie za každou změnou barvy a úvaha, která mění pozorování v závěr.
• Aktivity: pojmenovat chemickou skupinu detekovanou každým činidlem; vysvětlit, proč pouze Fehlingův test vyžaduje zahřátí nad 70 °C; vysvětlit, proč hydroxid sodný předchází síranu měďnatému v biuretovém testu; zdůvodnit, proč je obilný roztok pozitivní ve Fehlingově i Lugolově testu; vysvětlit slabé fialové zbarvení ve zkumavce 4, aniž byste je označili za Fehlingův pozitivní výsledek.

12. ročník / Úroveň college

• Zaměření specifičnost, kontroly a limity kvalitativní analýzy.
• Aktivity: napište redoxní poloreakce pro Fehlingův test a určete, co se oxiduje a co se redukuje; předpovězte výsledek testování čistého roztoku sacharózy a zdůvodněte svou předpověď; navrhněte pozitivní a negativní kontroly, které by tento protokol potřeboval, aby byl obhajitelný, a uveďte, co by každá z nich vyloučila; diskutujte o detekční prahové hodnotě každého testu a o tom, proč je negativní výsledek slabším důkazem než pozitivní; popište, jak je Biuretův test upraven pro kvantitativní měření koncentrace bílkovin.

Laboratorní potřeby

Nástroje

• Zkumavky 50 mL ×4
• Stojan na zkumavky
• Mikrotitrační destičky (jamkové destičky) ×2
• Pipeta (10 ml)
• Kapátka (1 ml)
• Kádinka (500 ml)
• Plotýnka
• Magnetická míchačka a míchací tyčinka
• Teploměr
• Stojan a svorky
• Skleněné tyče
• Promývací láhev
• Záchytná nádoba
• Papírová utěrka
• Rukavice a ochrana očí

Produkty

• Jablečný džus
• Vaječný bílek v roztoku
• Cereálie v suspenzi
• Mléko 3% s obsahem tuku
• Voda z kohoutku (vodní lázeň, 400 ml)
• Fehlingovo činidlo, roztoky A a B
• Lugolův jodový roztok 2%
• Roztok Sudanu IV
• Biuretovo činidlo — hydroxid sodný, NaOH 2,5 M
• Biuretovo činidlo — síran měďnatý, CuSO₄ 0,0094 M