013 – Nutrienți

Fiecare aliment este un amestec de molecule biologice, iar patru familii domină: zaharurile simple, amidonul, lipidele și proteinele. Cunoașterea compoziției unui aliment în aceste elemente stă la baza etichetării nutriționale, a sfaturilor dietetice și a controlului calității în industria alimentară — iar cu mult înainte de existența instrumentelor, chimiștii au stabilit răspunsul cu ajutorul unui set de reacții de culoare care sunt încă predate și folosite ca teste rapide de screening și astăzi.

Fiecare test funcționează deoarece un reactiv reacționează cu o anumită caracteristică chimică și produce o modificare vizibilă. Soluția lui Fehling este redusă de grupa aldehidică liberă a unui zucăr reducător, iar cuprul(II) pe care îl conține este convertit în oxid de cupru(I) de culoare roșu-cărămidă. Iodul lui Lugol alunecă în spirala elicoidală a unei molecule de amidon și formează un complex iod-amidon intens colorat. Sudan IV este un colorant liposolubil care abandona apa și se dizolvă în orice picătură de lipide prezentă, colorând-o în roșu. Reactivul Biuret, cupru(II) în soluție alcalină, formează un complex violet cu legăturile peptidice care leagă aminoacizii dintr-o proteină. Niciunul dintre aceste teste nu este sensibil la altceva, ceea ce face setul informativ.

În acest laborator veți analiza patru alimente de zi cu zi — suc de mere, albuș de ou, o soluție de cereale și lapte — pentru toate cele patru familii de nutrienți. Fiecare aliment este împărțit între o eprubetă, pentru testul Fehling la cald, și trei godeuri ale unei microplăci, câte unul pentru fiecare dintre testele la rece. Veți încălzi eprubetele Fehling într-o baie de apă la peste 70 °C, veți adăuga fiecare reactiv în godeul etichetat corespunzător și veți trece cele șaisprezece observații rezultate într-un tabel de rezultate. Pe baza acelor culori veți construi un profil de nutrienți pentru fiecare aliment și îl veți verifica în raport cu ceea ce știți deja despre proveniența zaharurilor, a amidonului, a grăsimilor și a proteinelor.

Obiective educaționale

Familiarizarea cu mediul de laborator

• Localizați și folosiți echipamentul de pe o masă de biochimie: stativul pentru eprubete, microplăcile, plita electrică și baia de apă, suporturile și clemele, pipetele picurătoare și micropipeta, baghetele de sticlă pentru agitare și recipientul de colectare/recuperare.

Utilizarea echipamentului de protecție și manipularea în siguranță a reactivilor

• Purtați mănuși și protecție pentru ochi și rețineți că soluția Fehling și reactivul Biuret sunt puternic alcaline și corozive.
• Golește fiecare recipient în coșul de recuperare în loc de chiuvetă și încălzește eprubetele într-o baie de apă în loc de direct pe placă.

Pregătirea și divizarea probelor

• Măsurați 10 mL din fiecare aliment cu pipeta și transferați-l fără pierderi în eprubeta numerotată corespunzătoare.
• Umpleți cele trei godeuri ale microplăcii aferente fiecărui aliment și înțelegeți de ce aceeași probă trebuie împărțită în godeuri separate, în loc să fie testată consecutiv într-unul singur.

Evitarea contaminării încrucișate

• Curățați bagheta de sticlă după fiecare agitare.
• Explicarea modului în care un singur picurător sau bastonaș clătit necorespunzător poate transforma o godeu negativ în pozitiv și poate invalida întreaga placă: În tehnicile de laborator precum ELISA sau alte teste pe plăci cu godeuri, un singur picurător sau bastonaș nespălat (neclătit) care conține o concentrație mare dintr-o substanță țintă (antigen, anticorp sau analit) acționează ca o sursă de **contaminare încrucișată**. Iată cum se produce acest efect în lanț: 1. **Contaminarea godeului negativ:** Când instrumentul contaminat intră în contact cu un godeu care ar trebui să fie negativ (un eșantion fără substanța respectivă sau un control negativ), acesta depune o cantitate mică din substanța țintă direct în acel godeu. 2. **Obținerea unui rezultat fals-pozitiv:** La citirea plăcii, godeul negativ va reacționa cu reactivii de detecție (de exemplu, schimbând culoarea sau emiteând lumină) deoarece substanța introdusă prin contaminare este prezentă. Astfel, un rezultat care trebuia să fie negativ devine **pozitiv**. 3. **Invalidarea întregii plăci (Controlul Calității):** * **Controlul Negativ eșuat:** În mod normal, godeurile de control negativ *trebuie* să rămână negative pentru ca testul să fie considerat valid. Dacă unul dintre ele devine pozitiv, înseamnă că procedura a fost compromisă. * **Pierderea trasabilității și a încrederii:** Deoarece contaminarea poate fi aleatorie și s-ar putea să fi afectat și alte godeu în mod invizibil, integritatea întregului lot de testare este pusă sub semnul întrebării. * **Decizia de invalidare:** Din motive de siguranță a datelor și de diagnostic corect, laboratorul este obligat să declare toată placa invalidă și să repete testarea de la zero pentru toate eșantioanele.

Efectuarea celor patru teste pentru nutrienți

• Efectuați testul Fehling cu baia de apă adusă peste 70 °C și explicați de ce doar acest test necesită căldură.
• Efectuați testele Lugol, Sudan IV și Biuret la temperatura camerei, adăugând reactivul Biuret în ordinea corectă — mai întâi alcalii, apoi sulfatul de cupru.

Citirea și înregistrarea rezultatelor

• Înregistrați fiecare observație ca o culoare și clasificați-o ca pozitivă sau negativă în raport cu criteriile menționate.
• Combinați cele șaisprezece observații într-un profil nutrițional pentru fiecare dintre cele patru alimente.

Interpretarea chimică a reacțiilor de culoare

• Puneți în corespondență fiecare schimbare de culoare cu grupa chimică detectată: aldehidă, helix de amidon, fază lipidică, legătură peptidică.
• O observație de control este necesară pentru a stabili o linie de bază, asigurând că testul funcționează corect și că rezultatele nu sunt influențate de contaminare, factori de mediu sau erori ale procedurii. Prezența unei culori într-un aliment care ar trebui să aibă un rezultat negativ înseamnă că testul este pozitiv, indicând fie prezența substanței testate (cum ar fi un alergen, un aditiv sau un contaminant), fie o reacție fals-pozitivă cauzată de interferențe chimice sau de o eroare experimentală.

Protocol

Pregătirea probelor alimentare

1. Cu ajutorul pipetei, măsurați 10 mL din proba de suc de mere.
2. Toarnă cei 10 ml de suc de mere în eprubeta 1.
3. Folosind un picurător, puneți 5 până la 10 picături de suc de mere în fiecare dintre cele trei godeuri ale plăcii cu godeuri identificate «J».
4. Goliți excesul din picurător în recipientul de recuperare.
5. Repetați pașii de la 1 la 4 pentru:

• Albușurile de ou, care vor merge în eprubeta 2 și în cele 3 godeuri ale plăcii cu godeuri identificate «B»
• Soluția de cereale, care va merge în eprubeta 3 și în cele 3 godeuri ale plăcii cu godeuri identificate «C»
• Laptele, care va merge în eprubeta 4 și în cele 3 godeuri ale plăcii cu godeuri identificate «L».

Identificarea carbohidraților simpli în alimente

1. Umpleți un pahar Berzelius de 500 mL cu 400 mL de apă de la robinet.
2. Introduceți bara de agitare magnetică în pahar.
3. Puneți paharul pe plita electrică și setați la 75°C. Așteptați până la atingerea temperaturii.
4. Porniți agitatorul magnetic (butonul din stânga).
5. Folosind pipeta, adăugați 10 mL de Fehling A în fiecare dintre eprubetele 1–4 care conțin alimentul.
6. Folosind pipeta, adăugați 10 mL de Fehling B în fiecare dintre eprubetele 1–4 care conțin alimentele.
7. Amestecați conținutul eprubetei 1 prin rotire circulară.
8. Repetați pasul anterior cu celelalte trei eprubete.
9. Fixați o clemă universală pe stativul din stânga, deasupra paharului Berzelius de 500 mL pregătit la pasul 1.
10. Fixați eprubeta 1 în clema universală deasupra centrului paharului Berzelius.
11. Verificați că în eprubetă s-a atins o temperatură mai mare de 70°C.
12. Luați eprubeta 1 și puneți-o înapoi în poziția ei originală în stativul pentru eprubete.
13. Amestecați conținutul eprubetei agitând câteva secunde cu bagheta de sticlă.
14. Repetați pașii de la 10 la 13 cu eprubetele 2, 3 și 4.
15. Coborâți temperatura plitei la 15 °C.
16. Oprește agitatorul magnetic.

Observațiile reacției de control se găsesc în tabelul de rezultate.

Identificarea carbohidraților complecși în alimente

1. Folosind picurătorul, adăugați 5 până la 10 picături de soluție Lugol în fiecare dintre cele 4 godeuri identificate «Lugol».
2. Goliți excesul din picurător în recipientul de recuperare.
3. Amestecați conținutul cu bagheta de sticlă. Atenție: curățați bine bagheta de sticlă după fiecare amestecare pentru a evita amestecarea substanțelor!

Identificarea lipidelor în alimente

1. Folosind picurătorul, adăugați 5 până la 10 picături de Sudan IV în fiecare dintre cele 4 godeuri identificate «Sudan IV».
2. Goliți excesul din picurător în recipientul de recuperare.
3. Amestecați conținutul folosind bagheta de sticlă.

Identificarea proteinelor în alimente

1. Folosind picurătorul, puneți 1 picătură de hidroxid de sodiu (NaOH) în fiecare dintre cele 4 godeuri identificate «Biuret».
2. Goliți excesul din picurător în recipientul de recuperare.
3. Folosiți pipeta pentru a extrage 1 pipetă plină (10 mL) de sulfat de cupru (CuSO4).
4. Folosind pipeta, distribuiți 1 mL de sulfat de cupru (CuSO4) în aceleași godeuri etichetate «Biuret».

• Godeul «J» (Biuret)
• Godeul «B» (Biuret)
• Godeul «C» (Biuret)
• Godeul «L» (Biuret)

5. Goliți excesul din pipetă în recipientul de recuperare.
6. Amestecați conținutul folosind bagheta de sticlă.

Observațiile se găsesc în tabelul de rezultate.

• Un rezultat pozitiv pentru prezența carbohidraților simpli va duce la formarea unui precipitat roșu-cărămiziu (Cu₂O) în eprubetă (reacția Fehling).
• Un rezultat pozitiv pentru prezența carbohidraților complecși va rezulta într-o colorație violetă (complex iod-amidon) în godeu (test Lugol).
• Un rezultat pozitiv pentru prezența lipidelor va duce la o colorație roșie (Sudan IV – complex lipidic) în godeu (test Sudan IV).
• Un rezultat pozitiv pentru prezența proteinelor va rezulta într-o colorație violet (complex biuret) în godeu (testul biuret).

Rezultate anticipate

Setul complet de rezultate. Patru produse alimentare sunt testate pentru patru nutrienți, rezultând un total de șaisprezece măsurători. Rezultatul testului Fehling se citește în eprubetă încălzită; celelalte trei se citesc în godeurile microplăcii etichetate.

Zaharuri simple — testul Fehling. Soluția Fehling este cupru(II) menținut în soluție de tartrat în mediu puternic alcalin. Un zahăr reducător — glucoză, fructoză, maltoză, lactoză, orice zahăr cu o aldehidă liberă sau cu un inel care se poate deschide pentru a forma una — este oxidat de acel cupru(II), care la rândul lui se reduce la cupru(I) și precipită ca oxid de cupru(I) roșu-cărămiziu:

R–CHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → R–COO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O

Reacția este lentă la temperatura camerei, motiv pentru care doar acest test are nevoie de baia de apă peste 70 °C; protocolul vă cere să confirmați acea temperatură în interiorul eprubetei înainte de citire. Sucul de mere este pozitiv pentru că sucul de fructe este în mare parte fructoză și glucoză libere. Soluția de cereale este și ea pozitivă, pentru că descompunerea parțială a amidonului lasă zaharuri reducătoare în suspensie. Zaharoza, în schimb, ar da un rezultat negativ deși este un zahăr, pentru că cele două inele ale ei sunt blocate împreună și nu rămâne nicio aldehidă liberă — o reamintire utilă că «zahăr reducător» este o categorie mai îngustă decât «zahăr».

Amidon — testul Lugol. Reactivul Lugol este iod dizolvat în iodură de potasiu, prezent în principal ca ionul triiodură I₃⁻. Amiloza, componenta liniară a amidonului, se răsucește într-o spirală al cărei interior este exact atât de larg cât să accepte un lanț de astfel de ioni. Complexul de incluziune rezultat absoarbe puternic în mijlocul spectrului vizibil și apare de la albastru-negru la violet închis. Doar soluția de cereale își schimbă culoarea; celelalte trei alimente nu conțin amidon. Deoarece culoarea depinde de spirala intactă, încălzirea unui godeu pozitiv ar face albastrul să pălească — spirala se desface — iar culoarea ar reveni la răcire.

Lipide — testul Sudan IV. Sudan IV este un lisocrom: un colorant fără afinitate pentru apă și cu o afinitate puternică pentru grăsimi. Adăugat într-un godeu, trece aproape în întregime în orice fază lipidică prezentă și o colorează în roșu, lăsând faza apoasă palidă. Laptele este pozitiv, pentru că grăsimea din lapte este dispersată în el ca o emulsie de picături fine. Nimic nu se consumă chimic aici — este un test de solubilitate, nu o reacție, motiv pentru care funcționează la rece și imediat.

Proteine — testul Biuret. Protocolul vă cere să adăugați mai întâi hidroxid de sodiu și al doilea sulfat de cupru, iar ordinea contează: alcaliul este cel care permite ionului de cupru(II) să se coordoneze la atomii de azot ai catenei peptidice. Patru astfel de atomi de azot din legături peptidice adiacente chelatează un Cu²⁺, iar complexul rezultat absoarbe în jur de 540 nm, dând movul caracteristic. Albușul de ou și laptele sunt ambele pozitive, așa cum numele lor din orice tabel nutrițional ar prezice. Testul necesită cel puțin două legături peptidice consecutive, astfel încât o soluție de aminoacizi liberi nu ar da nicio culoare — testul detectează proteina, nu azotul.

De ce un godeu Biuret pozitiv prezintă atât o culoare, cât și un precipitat. Cele două semnale reprezintă doi compuși diferiți ai aceluiași cupru. Nuanța mov a lichidului este complexul biuretic însuși: Cu²⁺ ținut de atomii de azot ai legăturilor peptidice adiacente este solubil, deci colorează întregul godeu în mod uniform. Precipitatul este hidroxid de cupru(II), format oriunde un ion Cu²⁺ întâlnește ioni de hidroxid înainte de a întâlni o legătură peptidică: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un solid de culoare albastru-pal. Hidroxidul de cupru(II) se numără printre hidroxizii obișnuiți cu cea mai mică solubilitate, așa că, odată ce legăturile peptidice prezente și-au luat partea lor de cupru, excesul părăsește soluția sub formă de solid. Cele două observații spun așadar aceeași poveste de două ori: proteina revendică o parte din cupru ca un complex mov solubil, iar hidroxidul revendică restul sub formă de solid.

De ce tubul de eprubetă 4 se colorează slab în violet. Laptele din eprubeta Fehling capătă o nuanță violet pală, dar niciun precipitat roșu-cărămiziu. Acesta nu este un pozitiv Fehling. Soluția Fehling furnizează cupru(II) în mediu puternic alcalin — exact condițiile testului Biuret — astfel încât proteina din lapte formează complexul violet Biuret în eprubeta Fehling. Citit strict, rezultatul este: niciun zahăr reducător detectat. Este o bună ilustrare a motivului pentru care un pozitiv este definit printr-o culoare numită și o formă numită, precipitat sau colorație, și nu prin «s-a întâmplat ceva». Laptele chiar conține lactoză, un zahăr reducător, așa că o incubare mai lungă sau mai fierbinte ar trebui să dea și un veritabil precipitat roșu-cărămiziu.

Rezumatul temei pe intervale de note

Clasele a IX-a și a X-a

• Concentrare: cele patru familii de nutrienți și culoarea care o dezvăluie pe fiecare, precum și o tehnică atentă, fără contaminare.
• Activități: pregătiți cele patru probe și încărcați eprubetele și godeurile; efectuați toate cele patru teste; înregistrați cele șaisprezece observații în tabelul de rezultate sub formă de culori; menționați ce nutrienți conține fiecare aliment și verificați dacă rezultatele corespund cu ceea ce ar indica o etichetă nutrițională.

Clasa a XI-a

• Concentrare: chimia din spatele fiecărei schimbări de culoare și raționamentul care transformă o observație într-o concluzie.
• Activități: să numiți grupa chimică detectată de fiecare reactiv; să explicați de ce doar testul Fehling necesită încălzire peste 70 °C; să explicați de ce hidroxidul de sodiu precedă sulfatul de cupru în testul Biuret; să explicați de ce soluția de cereale este pozitivă atât la Fehling, cât și la Lugol; să explicați nuanța violet pală din eprubeta 4 fără a o numi un pozitiv Fehling.

Clasa a XII-a / Nivel universitar

• Concentrare: specificitatea, controalele și limitele analizei calitative.
• Activități: să scrie semireacțiile redox pentru testul Fehling și să identifice ce se oxidează și ce se reduce; să prezică rezultatul testării unei soluții de zaharoză pură și să justifice predicția; să conceapă controalele pozitive și negative de care acest protocol ar avea nevoie pentru a fi defensabil și să precizeze ce ar exclude fiecare; să discute pragul de detecție al fiecărui test și de ce un rezultat negativ este o dovadă mai slabă decât unul pozitiv; să descrie cum este adaptat testul Biuret pentru a măsura cantitativ concentrația de proteine.

Esențiale de laborator

Instrumente

• Eprubete 50 mL ×4
• Suport pentru eprubete
• Microplăci (plăci cu godeuri) ×2
• Pipetă (10 mL)
• Pipete (1 mL)
• Pahar Berzelius (500 mL)
• Plită
• Agitator magnetic și bară de agitare
• Termometru
• Stand și cleme
• Tije de sticlă
• Sticlă de spălare
• Recipient de recuperare
• Prosop de hârtie
• Mănuși și protecție pentru ochi

Produse

• Suc de mere
• Albuș de ou în soluție
• Cereale în suspensie
• Lapte 3% grăsime
• Apă de la robinet (bain-marie, 400 mL)
• Reactiv Fehling, soluțiile A și B
• Soluție de iod Lugol 2%
• Soluție Sudan IV
• Reactiv Biuret — hidroxid de sodiu, NaOH 2,5 M
• Reactiv Biuret — sulfat de cupru, CuSO₄ 0,0094 M