013 – Nutrientes

Todo alimento es una mezcla de moléculas biológicas, y cuatro familias dominan: azúcares simples, almidones, lípidos y proteínas. Saber cuál de ellas contiene un alimento es la base del etiquetado nutricional, del consejo dietético y del control de calidad en la industria alimentaria; y mucho antes de que existieran los instrumentos, los químicos establecieron la respuesta con un puñado de reacciones de color que todavía se enseñan, y todavía se utilizan como pruebas de detección rápida, hoy en día.

Cada prueba funciona porque un reactivo reacciona con una característica química específica y produce un cambio visible. La solución de Fehling se reduce por el grupo aldehído libre de un azúcar reductor, y el cobre(II) que contiene se convierte en óxido de cobre(I) de color rojo ladrillo. El yodo de Lugol se desliza en la espiral helicoidal de una molécula de almidón y forma un complejo de yodo-almidón intensamente coloreado. El Sudán IV es un tinte liposoluble que abandona el agua y se disuelve en cualquier gota de lípido presente, tiñéndola de rojo. El reactivo de Biuret, cobre(II) en solución alcalina, forma un complejo violeta con los enlaces peptídicos que unen los aminoácidos en una proteína. Ninguna de estas pruebas es sensible a ninguna otra cosa, lo cual es lo que hace que el conjunto sea informativo.

En este laboratorio analizará cuatro alimentos cotidianos —zumo de manzana, clara de huevo, una solución de cereales y leche— para las cuatro familias de nutrientes. Cada alimento se divide entre un tubo de ensayo, para la prueba de Fehling calentada, y tres pocillos de una microplaca, uno para cada una de las pruebas en frío. Calentará los tubos de Fehling en un baño de agua a más de 70 °C, añadirá cada reactivo a su pocillo etiquetado y registrará las dieciséis observaciones resultantes en una tabla de resultados. A partir de esos colores, elaborará un perfil de nutrientes para cada alimento y lo contrastará con lo que ya sabe sobre el origen de los azúcares, el almidón, las grasas y las proteínas.

Objetivos Educativos

Familiarización con el entorno del laboratorio

• Localice y utilice el equipo de una mesa de bioquímica: la gradilla para tubos de ensayo, las microplacas, la placa calefactora y el baño María, los soportes y las pinzas, los cuentagotas y la micropipeta, las varillas de agitación de vidrio y el recipiente de recuperación.

Uso de equipos de protección y manipulación segura de reactivos

• Use guantes y protección ocular, y tenga presente que la solución de Fehling y el reactivo de Biuret son fuertemente alcalinos y corrosivos.
• Vacía todos los recipientes en el contenedor de recuperación en lugar del fregadero, y calienta los tubos de ensayo en un baño de agua en lugar de directamente sobre la placa.

Preparación y división de muestras

• Mida 10 mL de cada alimento con la pipeta y transfiéralo sin pérdida a su tubo de ensayo numerado.
• Cargue los tres pocillos de microplaca correspondientes a cada alimento y comprenda por qué la misma muestra debe dividirse en pocillos separados en lugar de analizarse secuencialmente en uno solo.

Evitar la contaminación cruzada

• Limpie la varilla de vidrio después de cada agitación.
• Explique cómo un solo gotero o varilla sin enjuagar puede hacer que un pocillo negativo se vuelva positivo e invalidar toda la placa.

Realización de las cuatro pruebas de nutrientes

• Realice la prueba de Fehling con el baño de agua llevado por encima de 70 °C, y explique por qué solo esta prueba requiere calor.
• Realice las pruebas de Lugol, Sudan IV y Biuret a temperatura ambiente, añadiendo el reactivo de Biuret en el orden correcto: primero el álcali y luego el sulfato de cobre.

Lectura y registro de resultados

• Registra cada observación como un color y clasifícala como positiva o negativa según los criterios establecidos.
• Combine las dieciséis observaciones en un perfil de nutrientes para cada uno de los cuatro alimentos.

Interpretación química de las reacciones de color

• Relaciona cada cambio de color con el grupo químico que se está detectando: aldehído, hélice de almidón, fase lipídica, enlace peptídico.
• Se necesita una observación de control para establecer una línea de base, verificar la validez del experimento y asegurar que los resultados se deban a la variable que se está probando y no a factores externos. Un color en un alimento que debería ser negativo significaría que hay un resultado falso positivo, lo que indica contaminación, reactividad cruzada o la presencia imprevista de la sustancia que se está analizando.

Protocolo

Preparación de muestras de alimentos

1. Con la pipeta, mida 10 mL de la muestra de jugo de manzana.
2. Vierta los 10 mL de jugo de manzana en el tubo de ensayo 1.
3. Usando un cuentagotas, coloque de 5 a 10 gotas de jugo de manzana en cada uno de los tres pocillos de la placa de pocillos identificada «J».
4. Vacía el exceso del gotero en el contenedor de recuperación.
5. Repita los pasos del 1 al 4 para:

• Las claras de huevo, que irán al tubo de ensayo 2 y a los 3 pocillos de la placa de pocillos identificada «B»
• La solución de cereales, que irá al tubo de ensayo 3 y a los 3 pocillos de la placa de pocillos identificada «C»
• La leche, que irá al tubo de ensayo 4 y a los 3 pocillos de la placa de pocillos identificada «L».

Identificación de carbohidratos simples en alimentos

1. Llene 400 mL de agua del grifo en un vaso de precipitados de 500 mL.
2. Inserte la barra de agitación magnética en el vaso de precipitados.
3. Coloque el vaso de precipitados en la placa calefactora y ajuste a 75 °C. Espere hasta que se alcance la temperatura.
4. Enciende la placa de agitación magnética (botón izquierdo).
5. Con la pipeta, añada 10 mL de Fehling A a cada uno de los tubos de ensayo 1 a 4 que contienen el alimento.
6. Con la pipeta, añada 10 mL de Fehling B a cada uno de los tubos de ensayo 1 a 4 que contienen los alimentos.
7. Mezcle el contenido del tubo de ensayo 1 agitándolo en un movimiento circular.
8. Repita el paso anterior con los otros tres tubos de ensayo.
9. Fije una pinza universal al soporte izquierdo, por encima del vaso de precipitados de 500 mL preparado en el paso 1.
10. Fije el tubo de ensayo 1 a la pinza universal por encima del centro del vaso de precipitados.
11. Verificar que se alcanza una temperatura superior a 70°C en el tubo de ensayo.
12. Tome el tubo de ensayo 1 y vuelva a colocarlo en su posición original en la gradilla para tubos de ensayo.
13. Mezcle el contenido del tubo de ensayo removiendo unos segundos con la varilla de vidrio.
14. Repita los pasos 10 a 13 con los tubos de ensayo 2, 3 y 4.
15. Baje la temperatura de la placa calefactora a 15 °C.
16. Apaga el agitador magnético.

Las observaciones de la reacción de control se encuentran en la tabla de resultados.

Identificación de carbohidratos complejos en alimentos

1. Con el gotero, añada de 5 a 10 gotas de solución de Lugol en cada uno de los 4 pocillos identificados «Lugol».
2. Vacía el exceso del gotero en el contenedor de recuperación.
3. Mezcle el contenido con la varilla de vidrio. Precaución: ¡asegúrese de limpiar bien la varilla de vidrio después de cada agitación para evitar mezclar sustancias!

Identificación de lípidos en alimentos

1. Con el gotero, añada de 5 a 10 gotas de Sudan IV en cada uno de los 4 pocillos identificados «Sudan IV».
2. Vacía el exceso del gotero en el contenedor de recuperación.
3. Mezcle los contenidos con la varilla de vidrio.

Identificación de proteínas en alimentos

1. Con el gotero, coloque 1 gota de hidróxido de sodio (NaOH) en cada uno de los 4 pocillos identificados «Biuret».
2. Vacía el exceso del gotero en el contenedor de recuperación.
3. Utilice la pipeta para extraer 1 pipeta completa (10 mL) de sulfato de cobre (CuSO4).
4. Con la pipeta, dispense 1 mL de sulfato de cobre (CuSO4) en esos mismos pocillos etiquetados «Biuret».

• El pocillo «J» (Biuret)
• El pocillo «B» (Biuret)
• El pocillo «C» (Biuret)
• El pocillo «L» (Biuret)

5. Vacíe el exceso de la pipeta en el contenedor de recuperación.
6. Mezcle los contenidos con la varilla de vidrio.

Las observaciones se encuentran en la tabla de resultados.

• Un resultado positivo para la presencia de carbohidratos simples dará como resultado un precipitado rojo ladrillo (Cu₂O) en el tubo de ensayo (reacción de Fehling).
• Un resultado positivo para la presencia de carbohidratos complejos dará como resultado una coloración púrpura (complejo yodo-almidón) en el pocillo (prueba de Lugol).
• Un resultado positivo para la presencia de lípidos resultará en una coloración roja (Sudán IV – complejo lipídico) en el pocillo (prueba de Sudán IV).
• Un resultado positivo para la presencia de proteínas dará como resultado una coloración púrpura (complejo de Biuret) en el pocillo (prueba de Biuret).

Resultados esperados

El conjunto completo de resultados. Cuatro alimentos son probados para cuatro nutrientes, dando dieciséis observaciones. La prueba de Fehling se lee en el tubo de ensayo caliente; las otras tres se leen en los pocillos rotulados de la microplaca.

Azúcares simples — prueba de Fehling. La solución de Fehling es cobre(II) mantenido en disolución por el tartrato en un medio fuertemente alcalino. Un azúcar reductor — glucosa, fructosa, maltosa, lactosa, cualquier azúcar con un aldehído libre o un anillo que pueda abrirse para formarlo — es oxidado por ese cobre(II), que a su vez se reduce a cobre(I) y precipita como óxido de cobre(I) rojo ladrillo:

R–CHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → R–COO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O

La reacción es lenta a temperatura ambiente, y por eso solo esta prueba necesita el baño de agua por encima de 70 °C; el protocolo le pide confirmar esa temperatura dentro del tubo antes de leer el resultado. El zumo de manzana es positivo porque el zumo de fruta es en gran parte fructosa y glucosa libres. La solución de cereales también es positiva, porque la degradación parcial del almidón deja azúcares reductores en la suspensión. La sacarosa, en cambio, daría un resultado negativo aunque sea un azúcar, porque sus dos anillos están bloqueados entre sí y no queda ningún aldehído libre — un recordatorio útil de que «azúcar reductor» es una categoría más estrecha que «azúcar».

Almidón — prueba de Lugol. El reactivo de Lugol es yodo disuelto en yoduro de potasio, presente principalmente como el ion triyoduro I₃⁻. La amilosa, el componente lineal del almidón, se enrolla en una hélice cuyo interior es justo lo bastante ancho para aceptar una cadena de estos iones. El complejo de inclusión resultante absorbe intensamente en el centro del espectro visible y aparece de azul negruzco a violeta intenso. Solo la solución de cereales cambia de color; los otros tres alimentos no contienen almidón. Como el color depende de que la hélice esté intacta, calentar un pocillo positivo haría palidecer el azul — la hélice se desenrolla — y el color volvería al enfriarse.

Lípidos — prueba de Sudan IV. El Sudan IV es un lisocromo: un colorante sin afinidad por el agua y con gran afinidad por las grasas. Añadido a un pocillo, pasa casi por completo a cualquier fase lipídica presente y la tiñe de rojo, dejando pálida la fase acuosa. La leche es positiva, porque la grasa láctea está dispersa en ella como una emulsión de gotitas finas. Aquí no se consume nada químicamente — es una prueba de solubilidad, no una reacción, y por eso funciona en frío y de inmediato.

Proteínas — prueba de Biuret. El protocolo indica que primero se debe agregar hidróxido de sodio y en segundo lugar sulfato de cobre, y el orden importa: el álcali es lo que permite que el ion cobre(II) se coordine con los átomos de nitrógeno del esqueleto peptídico. Cuatro nitrógenos de este tipo provenientes de enlaces peptídicos adyacentes quelatan un Cu²⁺, y el complejo resultante absorbe alrededor de 540 nm, dando el malva característico. La clara de huevo y la leche son ambas positivas, como sus nombres en cualquier tabla nutricional harían prever. La prueba requiere al menos dos enlaces peptídicos consecutivos, de modo que una solución de aminoácidos libres no daría ningún color — la prueba detecta proteína, no nitrógeno.

Por qué un pocillo de Biuret positivo muestra tanto un color como un precipitado. Las dos señales son dos compuestos diferentes del mismo cobre. El tinte malva del líquido es el complejo de biuret en sí: el Cu²⁺ retenido por los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos adyacentes es soluble, por lo que tiñe todo el pocillo de manera uniforme. El precipitado es hidróxido de cobre(II), formado dondequiera que un ion Cu²⁺ encuentra iones hidróxido antes de encontrar un enlace peptídico: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), un sólido azul pálido. El hidróxido de cobre(II) se encuentra entre los hidróxidos comunes menos solubles, por lo que una vez que los enlaces peptídicos presentes han tomado su parte del cobre, el exceso abandona la disolución como este sólido. Por lo tanto, las dos observaciones cuentan una misma historia dos veces: la proteína reclama parte del cobre como un complejo malva soluble, y el hidróxido reclama el resto como un sólido.

Por qué el tubo de ensayo 4 se vuelve ligeramente púrpura. La leche en el tubo de Fehling desarrolla un tenue tinte violeta pero ningún precipitado rojo ladrillo. Esto no es un positivo de Fehling. La solución de Fehling aporta cobre(II) en un medio fuertemente alcalino — exactamente las condiciones de la prueba de Biuret — de modo que la proteína de la leche forma el complejo violeta de Biuret en el tubo de Fehling. Leído estrictamente, el resultado es: no se detecta azúcar reductor. Es una buena ilustración de por qué un positivo se define por un color con nombre y una forma con nombre, precipitado o coloración, y no por «algo ha pasado». La leche sí contiene lactosa, un azúcar reductor, así que cabría esperar que una incubación más larga o más caliente diera también un auténtico precipitado rojo ladrillo.

Resumen de la asignación por rango de calificación

Grados 9–10

• Enfoque: las cuatro familias de nutrientes y el color que revela cada una, y una técnica cuidadosa y libre de contaminación.
• Actividades prepare las cuatro muestras y cargue los tubos y los pocillos; ejecute las cuatro pruebas; registre las dieciséis observaciones en la tabla de resultados como colores; indique qué nutrientes contiene cada alimento y compruebe si los resultados coinciden con lo que diría una etiqueta nutricional.

Undécimo grado

• Enfoque: la química detrás de cada cambio de color y el razonamiento que convierte una observación en una conclusión.
• Actividades nombrar el grupo químico detectado por cada reactivo; explicar por qué solo la prueba de Fehling necesita calentamiento por encima de 70 °C; explicar por qué el hidróxido de sodio precede al sulfato de cobre en la prueba de Biuret; explicar que la solución de cereales sea positiva tanto en Fehling como en Lugol; explicar el tenue violeta del tubo de ensayo 4 sin llamarlo positivo de Fehling.

12.º curso / Nivel universitario

• Enfoque: especificidad, controles y los límites del análisis cualitativo.
• Actividades escribir las semirreacciones redox del test de Fehling e identificar qué se oxida y qué se reduce; predecir el resultado de analizar una disolución de sacarosa pura y justificar la predicción; diseñar los controles positivos y negativos que este protocolo necesitaría para ser defendible, e indicar qué descartaría cada uno; discutir el umbral de detección de cada prueba y por qué un resultado negativo es una evidencia más débil que uno positivo; describir cómo se adapta el test de Biuret para medir la concentración de proteínas de forma cuantitativa.

Esenciales de laboratorio

Instrumentos

• Tubos de ensayo 50 mL ×4
• Gradilla para tubos de ensayo
• Microplacas (placas de pocillos) ×2
• Pipeta (10 mL)
• Goteros (1 mL)
• Vaso de precipitados (500 mL)
• Plancha eléctrica
• Agitador magnético y varilla magnética
• Termómetro
• Soporte y abrazaderas
• Varillas de vidrio
• Frasco lavador
• Contenedor de recuperación
• Toalla de papel
• Guantes y protección ocular

Productos

• Jugo de manzana
• Clara de huevo en solución
• Cereales en suspensión
• Leche 3% grasa
• Agua del grifo (baño María, 400 mL)
• Reactivo de Fehling, soluciones A y B
• Solución de yodo de Lugol al 2 %
• Solución de Sudán IV
• Reactivo de Biuret: hidróxido de sodio, NaOH 2,5 M
• Reactivo de Biuret — sulfato de cobre, CuSO₄ 0,0094 M