013 – Składniki odżywcze

Każdy produkt spożywczy jest mieszaniną cząsteczek biologicznych, w której dominują cztery grupy: cukry proste, skrobie, lipidy i białka. Wiedza o tym, które z nich zawiera dana żywność, jest podstawą etykietowania wartości odżywczych, porad dietetycznych oraz kontroli jakości w przemyśle spożywczym – a na długo przed pojawieniem się aparatury chemiczcy ustalili odpowiedź za pomocą kilku reakcji barwnych, które są uczone do dziś i nadal stosowane jako szybkie testy przesiewowe.

Każdy test działa, ponieważ odczynnik reaguje z jedną określoną cechą chemiczną i wywołuje widoczną zmianę. Odczynnik Fehlinga ulega redukcji pod wpływem wolnej grupy aldehydowej cukru redukującego, a zawarta w nim miedź(II) przekształca się w ceglastoczerwony tlenek miedzi(I). Płyn Lugola wsuwa się w helikalną zwitwę cząsteczki skrobi i tworzy intensywnie zabarwiony kompleks jodowo-skrobiowy. Sudan IV to barwnik rozpuszczalny w tłuszczach, który opuszcza wodę i rozpuszcza się w każdej obecnej kropli lipidowej, barwiąc ją na czerwono. Odczynnik biuretowy, czyli miedź(II) w roztworze alkalicznym, tworzy fioletowy kompleks z wiązaniami peptydowymi, które łączą aminokwasy w białku. Żaden z tych testów nie jest czuły na cokolwiek innego, co sprawia, że cały zestaw jest pouczający.

W tym laboratorium przeanalizujesz cztery codzienne produkty spożywcze – sok jabłkowy, białko jaja, roztwór płatków śniadaniowych i mleko – pod kątem wszystkich czterech grup składników odżywczych. Każdy produkt jest rozdzielony do probówki na potrzeby podgrzewanej próby Fehlinga oraz do trzech wgłębień płytki mikrotitracyjnej, po jednym dla każdej z prób przeprowadzanych na zimno. Podgrzejesz probówki z odczynnikiem Fehlinga w łaźni wodnej o temperaturze powyżej 70 °C, dodasz każdy odczynnik do odpowiednio oznaczonego wgłębienia i wpiszesz wynikowe szesnaście obserwacji do tabeli wyników. Na podstawie tych kolorów stworzysz profil składników odżywczych dla każdego produktu spożywczego i porównasz go z tym, co już wiesz o pochodzeniu cukrów, skrobi, tłuszczu i białka.

Cele edukacyjne

Zapoznanie się ze środowiskiem laboratoryjnym

• Zlokalizuj i użyj sprzętu stanowiska biochemicznego: statywu na probówki, mikropłytek, płyty grzejnej i łaźni wodnej, stojaków i zacisków, zakraplaczy i mikropipety, szklanych prętów mieszających oraz pojemnika na odpady.

Stosowanie sprzętu ochronnego i bezpieczne obchodzenie się z odczynnikami

• Noś rękawice i okulary ochronne oraz pamiętaj, że odczynnik Fehlinga i odczynnik biuretowy są silnie zasadowe i żrące.
• Opróżnij każdy pojemnik do kosza na odpady odzyskane zamiast do zlewki, a probówki podgrzewaj w łaźni wodnej zamiast bezpośrednio na płycie.

Przygotowanie i podział próbek

• Odmierz pipetą 10 mL każdego produktu i przenieś bez strat do odpowiednio ponumerowanej probówki.
• Napełnij trzy studzienki mikropłytki należące do każdego produktu spożywczego i zrozum, dlaczego tę samą próbkę należy rozdzielić na osobne studzienki, zamiast badać ją po kolei w jednej.

Unikanie zanieczyszczeń krzyżowych

• Wyczyść szklaną bagietkę po każdym mieszaniu.
• Wyjaśnij, jak pojedynczy niespłukany zakraplacz lub pręt może zmienić wynik studzienki ujemnej na dodatni i unieważnić całą płytkę.

Przeprowadzanie czterech testów na obecność składników odżywczych

• Wykonaj próbę Fehlinga z łaźnią wodną podgrzaną powyżej 70 °C i wyjaśnij, dlaczego tylko ta próba wymaga ciepła.
• Wykonaj próby Lugola, Sudanu IV i biuretową w temperaturze pokojowej, dodając odczynnik biuretowy we właściwej kolejności — najpierw zasadę, potem siarczan miedzi.

Odczytywanie i rejestrowanie wyników

• Każdą obserwację należy zapisać jako kolor i sklasyfikować jako pozytywną lub negatywną w odniesieniu do określonych kryteriów.
• Połącz szesnaście obserwacji w profil składników odżywczych dla każdego z czterech produktów spożywczych.

Chemiczna interpretacja reakcji barwnych

• Powiązaj każdą zmianę koloru z wykrywaną grupą chemiczną: aldehyd, helisa skrobiowa, faza lipidowa, wiązanie peptydowe.
• Wyjaśnij, dlaczego konieczna jest kontrola, oraz co oznaczałby obecność barwnika w produkcie spożywczym, w którym nie powinien się on znajdować.

Protokół

Przygotowanie próbek żywności

1. Za pomocą pipety odmierz 10 mL próbki soku jabłkowego.
2. Wlej 10 ml soku jabłkowego do probówki 1.
3. Używając zakraplacza, umieść 5 do 10 kropli soku jabłkowego w każdym z trzech dołków płytki oznaczonej «J».
4. Wylej nadmiar z zakraplacza do pojemnika na odpady.
5. Powtórz kroki od 1 do 4 dla:

• Białka jaj, które trafią do probówki 2 i do 3 dołków płytki oznaczonej «B»
• Roztwór płatków, który trafi do probówki 3 i do 3 dołków płytki oznaczonej «C»
• Mleko, które trafi do probówki 4 i do 3 dołków płytki oznaczonej «L».

Identyfikacja prostych węglowodanów w żywności

1. Napełnij 400 ml wody z kranu do zlewki o pojemności 500 ml.
2. Włóż mieszadło magnetyczne do zlewki.
3. Ustaw zlewkę na płycie grzewczej i ustaw temperaturę na 75°C. Poczekaj, aż temperatura zostanie osiągnięta.
4. Włącz mieszadło magnetyczne (przycisk po lewej).
5. Za pomocą pipety dodaj 10 mL odczynnika Fehlinga A do każdej z probówek 1–4 zawierających żywność.
6. Za pomocą pipety dodaj 10 mL odczynnika Fehlinga B do każdej z probówek 1–4 zawierających żywność.
7. Wymieszaj zawartość probówki 1, obracając ją ruchem okrężnym.
8. Powtórz poprzedni krok z pozostałymi trzema probówkami.
9. Przymocuj zacisk uniwersalny do lewego statywu, nad zlewką o pojemności 500 mL przygotowaną w kroku 1.
10. Zamocuj probówkę 1 w zacisku uniwersalnym nad środkiem zlewki.
11. Sprawdź, czy w probówce osiągnięto temperaturę powyżej 70°C.
12. Weź probówkę 1 i odłóż ją na jej pierwotne miejsce na stojaku na probówki.
13. Wymieszaj zawartość probówki, mieszając przez kilka sekund szklanym pręcikiem.
14. Powtórz kroki 10 do 13 z probówkami 2, 3 i 4.
15. Obniż temperaturę płyty grzewczej do 15 °C.
16. Wyłącz mieszadło magnetyczne.

Obserwacje reakcji kontrolnej znajdują się w tabeli wyników.

Identyfikacja złożonych węglowodanów w żywności

1. Za pomocą zakraplacza dodaj 5 do 10 kropli płynu Lugola do każdego z 4 dołków oznaczonych «Lugol».
2. Wylej nadmiar z zakraplacza do pojemnika na odpady.
3. Wymieszaj zawartość szklanym pręcikiem. Uwaga: pamiętaj, aby dokładnie czyścić szklany pręcik po każdym mieszaniu, aby uniknąć zmieszania substancji!

Identyfikacja lipidów w żywności

1. Za pomocą zakraplacza dodaj 5 do 10 kropli Sudanu IV do każdego z 4 dołków oznaczonych «Sudan IV».
2. Wylej nadmiar z zakraplacza do pojemnika na odpady.
3. Wymieszaj zawartość za pomocą bagietki szklanej.

Identyfikacja białek w żywności

1. Za pomocą zakraplacza umieść 1 kroplę wodorotlenku sodu (NaOH) w każdym z 4 dołków oznaczonych «Biuret».
2. Wylej nadmiar z zakraplacza do pojemnika na odpady.
3. Za pomocą pipety pobierz 1 pełną pipetę (10 mL) siarczanu miedzi (CuSO4).
4. Za pomocą pipety odmierz 1 mL siarczanu miedzi (CuSO4) do tych samych dołków oznaczonych «Biuret».

• Dołek «J» (Biuret)
• Dołek «B» (Biuret)
• Dołek «C» (Biuret)
• Dołek «L» (Biuret)

5. Opróżnij nadmiar z pipety do pojemnika z odpadami.
6. Wymieszaj zawartość za pomocą bagietki szklanej.

Obserwacje znajdują się w tabeli wyników.

• Pozytywny wynik na obecność węglowodanów prostych spowoduje powstanie ceglastoczerwonego osadu (Cu₂O) w probówce (reakcja Fehlinga).
• Wynik pozytywny na obecność węglowodanów złożonych spowoduje purpurowe zabarwienie (jod – kompleks skrobi) w studzience (próba Lugola).
• Pozytywny wynik obecności lipidów spowoduje czerwone zabarwienie (Sudan IV – kompleks lipidów) w studzience (test na obecność Sudan IV).
• Pozytywny wynik obecności białek spowoduje purpurowe zabarwienie (kompleks biuretowy) w studzience (próba biuretowa).

Przewidywane wyniki

Pełny zestaw wyników. Cztery próbki żywności są badane pod kątem czterech składników odżywczych, co daje szesnaście wyników. Wynik testu Fehlinga odczytuje się w podgrzanej probówce; pozostałe trzy wyniki odczytuje się w oznaczonych studzienkach mikropłytki.

Cukry proste — próba Fehlinga. Odczynnik Fehlinga to miedź(II) utrzymywana w roztworze przez winian w silnie zasadowym środowisku. Cukier redukujący — glukoza, fruktoza, maltoza, laktoza, każdy cukier z wolnym aldehydem lub pierścieniem mogącym się otworzyć, by go utworzyć — jest utleniany przez tę miedź(II), która sama redukuje się do miedzi(I) i wytrąca się jako ceglastoczerwony tlenek miedzi(I):

R–CHO + 2 Cu²⁺ + 5 OH⁻ → R–COO⁻ + Cu₂O(s) + 3 H₂O

Reakcja przebiega powoli w temperaturze pokojowej i dlatego tylko ta próba wymaga łaźni wodnej powyżej 70 °C; protokół każe potwierdzić tę temperaturę wewnątrz probówki przed odczytem. Sok jabłkowy jest pozytywny, ponieważ sok owocowy to w dużej mierze wolna fruktoza i glukoza. Roztwór płatków również jest pozytywny, ponieważ częściowy rozkład skrobi pozostawia w zawiesinie cukry redukujące. Sacharoza dałaby natomiast wynik negatywny, mimo że jest cukrem, ponieważ jej dwa pierścienie są ze sobą zablokowane i nie pozostaje żaden wolny aldehyd — pożyteczne przypomnienie, że «cukier redukujący» to węższa kategoria niż «cukier».

Skrobia — próba Lugola. Odczynnik Lugola to jod rozpuszczony w jodku potasu, obecny głównie jako jon trójjodkowy I₃⁻. Amyloza, liniowy składnik skrobi, zwija się w helisę, której wnętrze jest akurat na tyle szerokie, by przyjąć łańcuch tych jonów. Powstały kompleks inkluzyjny silnie pochłania środek widma widzialnego i wygląda od granatowoczarnego do ciemnofioletowego. Barwi się tylko roztwór płatków; pozostałe trzy produkty nie zawierają skrobi. Ponieważ barwa zależy od nienaruszonej helisy, podgrzanie pozytywnego dołka sprawiłoby, że błękit zblednie — helisa się rozwija — a po ostygnięciu barwa by powróciła.

Lipidy — próba Sudanu IV. Sudan IV to lizochrom: barwnik bez powinowactwa do wody i o silnym powinowactwie do tłuszczów. Dodany do dołka, przechodzi niemal całkowicie do każdej obecnej fazy lipidowej i barwi ją na czerwono, pozostawiając fazę wodną bladą. Mleko jest pozytywne, ponieważ tłuszcz mleczny jest w nim rozproszony jako emulsja drobnych kropelek. Nic nie jest tu zużywane chemicznie — to próba rozpuszczalności, a nie reakcja, dlatego działa na zimno i natychmiast.

Białka — próba biuretowa. Protokół nakazuje dodać najpierw wodorotlenek sodu, a w drugim kroku siarczan miedzi, przy czym kolejność ma znaczenie: to właśnie zasada pozwala jonowi miedzi(II) koordynować do atomów azotu szkieletu peptydowego. Cztery takie atomy azotu z przylegających wiązań peptydowych chelatują jeden Cu²⁺, a powstały kompleks pochłania światło około 540 nm, dając charakterystyczny fioletoworóżowy kolor. Białko jaja i mleko są oba pozytywne, jak przewidywałyby ich nazwy w każdej tabeli wartości odżywczych. Próba wymaga co najmniej dwóch kolejnych wiązań peptydowych, więc roztwór wolnych aminokwasów nie dałby żadnej barwy — próba wykrywa białko, a nie azot.

Dlaczego dodatnia próba biuretowa wykazuje zarówno zabarwienie, jak i osad. Dwa sygnały to dwa różne związki tego samego miedzi. Fioletowy odcień cieczy to sam kompleks biuretowy: Cu²⁺ utrzymywany przez atomy azotu sąsiednich wiązań peptydowych jest rozpuszczalny, więc zabarwia całą studzienkę równomiernie. Osadem jest wodorotlenek miedzi(II), powstający wszędzie tam, gdzie jon Cu²⁺ napotka jony wodorotlenkowe, zanim napotka wiązanie peptydowe: Cu²⁺ + 2 OH⁻ → Cu(OH)₂(s), jasnoniebieska substancja stała. Wodorotlenek miedzi(II) należy do najmniej rozpuszczalnych powszechnych wodorotlenków, więc gdy obecne wiązania peptydowe pobiorą swoją część miedzi, nadmiar opuszcza roztwór w postaci tej substancji stałej. Obie obserwacje opowiadają zatem tę samą historię na dwa sposoby: białko wiąże część miedzi jako rozpuszczalny, fioletowy kompleks, a wodorotlenek wiąże resztę w postaci substancji stałej.

Dlaczego probówka nr 4 zabarwia się na słabo fioletowy kolor. Mleko w probówce Fehlinga nabiera bladofioletowego odcienia, ale nie daje ceglastoczerwonego osadu. To nie jest pozytywny wynik próby Fehlinga. Odczynnik Fehlinga dostarcza miedź(II) w silnie zasadowym środowisku — dokładnie w warunkach próby biuretowej — więc białko mleka tworzy fioletowy kompleks biuretowy w probówce Fehlinga. Odczytany ściśle, wynik brzmi: nie wykryto cukru redukującego. To dobra ilustracja tego, dlaczego wynik pozytywny definiuje się nazwaną barwą i nazwaną formą, osadem lub zabarwieniem, a nie tym, że «coś się wydarzyło». Mleko rzeczywiście zawiera laktozę, cukier redukujący, więc dłuższa lub gorętsza inkubacja powinna dać także prawdziwy ceglastoczerwony osad.

Podsumowanie zadania według zakresu ocen

Klasy 9–10

• Skupienie: cztery rodziny składników odżywczych oraz barwa, która ujawnia każdą z nich, oraz staranna technika wolna od zanieczyszczeń.
• Aktywności: przygotuj cztery próbki i umieść je w probówkach oraz dołkach; przeprowadź wszystkie cztery testy; zapisz szesnaście wyników w tabeli wyników, podając je jako kolory; określ, jakie składniki odżywcze zawiera każdy produkt spożywczy, i sprawdź, czy wyniki są zgodne z informacjami podanymi na etykiecie z wartościami odżywczymi.

Klasa 11

• Skupienie: chemia stojąca za każdą zmianą koloru oraz rozumowanie, które przekształca obserwację w wniosek.
• Aktywności: nazwać grupę chemiczną wykrywaną przez każdy odczynnik; wyjaśnić, dlaczego tylko próba Fehlinga wymaga ogrzewania powyżej 70 °C; wyjaśnić, dlaczego wodorotlenek sodu poprzedza siarczan miedzi w próbie biuretowej; uzasadnić, dlaczego roztwór płatków jest pozytywny zarówno w próbie Fehlinga, jak i Lugola; wyjaśnić bladofioletowy odcień w probówce 4, nie nazywając go pozytywnym wynikiem próby Fehlinga.

Klasa 12 / Poziom akademicki

• Skupienie: specyficzność, kontrola oraz ograniczenia analizy jakościowej.
• Aktywności: zapisz półreakcje redoks zachodzące podczas testu Fehlinga oraz określ, która substancja ulega utlenieniu, a która – redukcji; przewidzieć wynik badania czystego roztworu sacharozy i uzasadnić tę prognozę; zaprojektować kontrole pozytywne i negatywne, które byłyby niezbędne do uzasadnienia niniejszego protokołu, oraz wskazać, co każda z nich wykluczałaby; omówić próg wykrywalności każdego testu oraz wyjaśnić, dlaczego wynik negatywny stanowi słabszy dowód niż wynik pozytywny; opisać, w jaki sposób test Biureta jest dostosowany do ilościowego pomiaru stężenia białka.

Podstawowe wyposażenie laboratorium

Instrumenty

• Probówki 50 mL ×4
• Stojak na probówki
• Mikropłytki (płytki z dołkami) ×2
• Pipeta (10 mL)
• Kroplomierze (1 ml)
• Zlewek (500 ml)
• Płyta grzewcza
• Mieszadło magnetyczne i mieszadełko
• Termometr
• Stojak i zaciski
• Szklane pręty
• Tryskawka
• Pojemnik do odzyskiwania
• Ręcznik papierowy
• Rękawice i okulary ochronne

Produkty

• Sok jabłkowy
• Białko jajeczne w roztworze
• Zboża w zawiesinie
• Mleko 3% tłuste
• Woda z kranu (łaźnia wodna, 400 ml)
• Odczynnik Fehlinga, roztwory A i B
• Roztwór jodu Lugola 2%
• Roztwór Sudanu IV
• Odczynnik biuretowy — wodorotlenek sodu, NaOH 2,5 M
• Odczynnik biuretowy — siarczan miedzi(II), CuSO₄ 0,0094 M