025 – Osservazione delle cellule vegetali

Le cellule vegetali sono state le prime cellule che chiunque abbia mai visto. Nel 1665 Robert Hooke mise una sottile fetta di sughero sotto un microscopio, scoprì che era divisa in minuscoli scomparti e prese in prestito la parola cella dalle piccole stanze di un monastero. Ciò che ha reso il sughero leggibile laddove il tessuto animale non lo era è esattamente ciò che rende il materiale vegetale un campione didattico migliore oggi: una rigida parete di cellulosa attorno a ogni cellula traccia un confine visibile, che la cellula sia colorata o meno.

Elodea, l'erba palustre acquatica, è la scelta standard. La sua foglia è spessa solo due strati di cellule, quindi un'intera foglia può essere montata piatta senza bisogno di sezionarla e la luce la attraversa direttamente. All'interno di ciascuna cellula si trovano dozzine di cloroplasti, densi di clorofilla e quindi abbastanza verdi da essere visti senza alcuna colorazione, mentre un singolo grande vacuolo centrale occupa la maggior parte del volume e spinge il citoplasma e i cloroplasti in un sottile strato contro la parete. Quasi ogni caratteristica distintiva di una cellula vegetale — parete, cloroplasti, vacuolo, un'ordinata geometria dei tessuti — è visibile in un unico preparato.

Il nucleo costituisce l'eccezione. È presente in ogni cellula ma è quasi trasparente e facilmente confusa tra i cloroplasti, motivo per cui il laboratorio utilizza due vetrini anziché uno. Il primo è un preparato fresco in sola acqua, che mostra le cellule così come sono. Il secondo riceve una goccia di soluzione di Lugol – iodio in ioduro di potassio – che si lega alle proteine e agli acidi nucleici e colora il nucleo di un distinto giallo-marrone. Accenderete l'illuminatore a luce trasmessa, salirete attraverso 40×, 100× e 400× usando la messa a fuoco macrometrica solo alla minima potenza, salverete un'immagine a ogni passaggio e confronterete direttamente i due vetrini. Letti insieme all'esperienza di laboratorio 024 sulle cellule animali, i due vetrini rendono visibile, anziché semplicemente affermata, la differenza strutturale tra i due regni.

Obiettivi Educativi

Familiarizzazione con l'ambiente di laboratorio

• Individuare il microscopio e il suo interruttore, i tre obiettivi utilizzabili, le manopole di messa a fuoco macrometrica e micrometrica, il tavolino portaoggetti, il becher, le pinzette, i vetrini, i coprivetrini e la carta assorbente prima di iniziare.

Funzionamento di un microscopio ottico composto

• Impostare l'illuminazione trasmessa (in campo chiaro) dal basso e spiegare perché una foglia spessa due cellule è un campione quasi ideale per essa.
• Cambia gli obiettivi in ordine crescente — 4×, poi 10×, poi 40× — e calcola l'ingrandimento totale fornito da ciascuno con un oculare da 10×.
• Usa la messa a fuoco macrometrica solo al minor ingrandimento e quella micrometrica a quelli superiori, e spiega perché l'obiettivo a immersione in olio 100× è escluso da questo laboratorio.

Preparazione di un preparato a fresco

• Trasferisci una piccola foglia con le pinzette senza strapparla o piegarla, inondala di liquido, abbassa un coprioggetto senza intrappolare aria e tampona l'eccesso in modo che il coprioggetto poggi piatto.
• Spiega perché la foglia deve rimanere bagnata per tutto il tempo e cosa succede alle cellule se il preparato si asciuga.

Identificazione delle strutture cellulari vegetali

• Identifica la parete cellulare, i cloroplasti, il vacuolo centrale e — sul vetrino colorato — il nucleo, e indica la funzione di ciascuno.
• Descrivi la disposizione delle cellule nel tessuto e metti in relazione quella geometria simile a mattoni con la presenza di una parete rigida.

Uso di una colorazione biologica

• Confronta direttamente il preparato ad acqua e il preparato con Lugol, specificando esattamente quale struttura viene rivelata dalla colorazione e quali strutture erano già visibili senza di essa.

Osservazione e registrazione

• Salvare un'immagine al microscopio a ciascun ingrandimento per entrambi i vetrini, annotare la vista colorata a 400× e stimare le dimensioni cellulari dal campo visivo noto anziché indovinare.

Protocollo

Preparazione

1. Accendi il microscopio premendo l'interruttore sulla parte anteriore dell'apparecchio. Accenderai l'illuminatore, in modo che la luce trasmessa passi attraverso il campione dal basso, il che è ideale per campioni trasparenti.
2. Riempi il becher piccolo completamente con acqua fredda di rubinetto.
3. Posiziona due vetrini puliti sulla tua area di lavoro.

Preparazione della prima slide

1. Usando una pinzetta, posiziona delicatamente una piccola foglia di Elodea sul primo vetrino.
2. Metti una goccia d'acqua sul primo vetrino.
3. Coprire il vetrino con un coprioggetto.
4. Tamponare delicatamente l'acqua in eccesso con carta assorbente.

Preparazione del secondo cursore

1. Usando una pinzetta, posiziona delicatamente una piccola foglia di Elodea sul secondo vetrino.
2. Posiziona una goccia di Lugol sul secondo vetrino.
3. Coprire il vetrino con il copri-vetrino.
4. Tamponare delicatamente l'acqua in eccesso con carta assorbente.

Osservazione della prima diapositiva

1. Posiziona il vetrino sul tavolino del microscopio.
2. Fare clic sul pulsante «Microscopio» sul tablet per visualizzare l'immagine del microscopio.
3. È possibile salvare un'immagine della vista microscopica osservata facendo clic sul pulsante «Salva immagine« situato nell'area in basso a sinistra della sezione «Microscopio«.

Regolazione del microscopio

1. Regolare l'ingrandimento toccando le lenti dell'obiettivo del microscopio. Iniziare l'osservazione a un ingrandimento di 40x (obiettivo rosso – etichettato Plan 4/0.10).
2. Affina la messa a fuoco con le manopole di regolazione macrometriche situate a sinistra e a destra del microscopio. Usa le manopole macrometriche solo a questo ingrandimento.
3. Aumentare gradualmente l'ingrandimento da 40x a 100x (obiettivo giallo - etichettato Plan 10/0.25), poi a 400x (obiettivo blu - etichettato Plan 40/0.65), riseducando la messa a fuoco ogni volta utilizzando esclusivamente la manopola micrometrica. A questi ingrandimenti la manopola macrometrica può spingere l'obiettivo contro il vetrino.

Nota: un ingrandimento di 1000x (obiettivo per immersione in olio – etichettato Plan 100/1.25) richiede l'uso di olio tra l'obiettivo e il vetrino coprioggetto. Pertanto, non utilizziamo questo obiettivo in questo laboratorio.

Osservazione della seconda diapositiva

1. Sostituisci la prima diapositiva con la seconda diapositiva contenente la foglia di Elodea e il Lugol.
2. Osservare a ingrandimento 400x (obiettivo blu – etichettato Plan 40/0,65) per identificare un nucleo cellulare, che dovrebbe apparire colorato di giallo dalla Lugol.
3. Registrazione delle osservazioni: Documentare o registrare le osservazioni importanti.

Spegnimento del microscopio

1. Spegni il microscopio premendo l'interruttore sulla parte anteriore del dispositivo.

Risultati Previsti

Un set di immagini di riferimento delle viste previste al microscopio è disponibile in questo documento (PDF).

Che aspetto hanno le cellule e perché

Il singolo fatto che spiega quasi ogni osservazione è la parete cellulare. Uno strato di cellulosa dello spessore di 0,1-1 µm circonda ciascuna cellula, è abbastanza rigido da resistere alla deformazione ed è cementato a quelle vicine. Le cellule quindi non possono arrotondarsi, scorrere l'una sull'altra o sovrapporsi: mantengono una forma rettangolare fissa e tappezzano la foglia in file ordinate. Elodea Le cellule fogliari sono lunghe circa 50–100 µm e larghe 20–30 µm, quindi a 400× solo una manciata riempie il campo: abbastanza grandi che la disposizione, e non solo la singola cellula, diventa oggetto di studio.

La parete spiega anche il funzionamento del vacuolo. Poiché la parete è in grado di resistere alla pressione, la cellula è libera di assorbire acqua per via osmotica fino a quando il suo contenuto non esercita una pressione verso l’esterno contro la parete, raggiungendo una pressione turgorale di diverse centinaia di kilopascal. L’acqua è contenuta in un unico grande vacuolo centrale, che in una cellula matura occupa l’80–90% del volume e comprime il citoplasma, i cloroplasti e il nucleo in un sottile strato periferico. Ecco perché i cloroplasti appaiono come un bordo piuttosto che come un disco pieno, ed ecco perché il centro di ogni cellula sembra vuoto. Una cellula animale immersa nella stessa acqua si gonfierebbe e scoppierebbe, non avendo una parete che respinga la pressione — il collegamento diretto con il laboratorio 004 sull’osmosi.

I cloroplasti sono visibili senza alcuna colorazione perché ne contengono già una. La clorofilla assorbe fortemente nel rosso e nel blu e trasmette nel verde, quindi ciascun cloroplasto – un organello a forma di lente del diametro di circa 5 µm – sottrae abbastanza luce dal fascio da apparire come un corpo verde distinto. Un tipico Elodea la cellula ne contiene diverse decine. Sono anche mobili, fluttuano lentamente con il citoplasma, che è uno dei pochi processi vitali osservabili al microscopio ottico.

Ingrandimento, risoluzione e campo visivo

L'ingrandimento totale è il prodotto dell'obiettivo e dell'oculare: con l'oculare standard 10×, M = M_ogg × M_occhio dà 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× e 40 × 10 = 400×. Ciò che può essere separato del tutto è stabilito invece dall'apertura numerica stampata dopo la potenza di ciascun obiettivo. Secondo il criterio di Abbe d = λ / (2 × NA); per la luce verde a λ = 550 nm l'obiettivo rosso dà d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, quello giallo 1,1 µm e quello blu 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Un cloroplasto di 5 µm è quindi risolvibile da tutti e tre, il che corrisponde all'osservazione che i granuli verdi sono visibili da 100×; l'obiettivo a immersione 100× escluso (NA 1,25) arriverebbe a 0,22 µm, ma solo con olio a immersione per trasportare i raggi ad alto angolo attraverso lo spazio.

Il campo visivo si restringe in proporzione alla potenza dell'obiettivo. Per un oculare con numero di campo di 18 mm il diametro visibile è 18 ÷ 4 = 4,5 mm all'obiettivo rosso, 1,8 mm a quello giallo e 18 ÷ 40 = 0,45 mm, ovvero 450 µm, a quello blu. Ciò fornisce un modo per misurare le cellule senza un reticolo: un campo a 400× largo 450 µm attraversato da circa sei cellule disposte testa-coda pone ciascuna cellula a una lunghezza vicina a 75 µm, all'interno dell'intervallo previsto. La profondità di campo diminuisce ancor più rapidamente, da decine di micrometri a 40× a meno di un micrometro a 400×, motivo per cui la vite macrometrica è limitata alla bassa potenza: a 400× l'obiettivo si trova a una frazione di millimetro sopra il vetrino coprioggetto e un movimento macrometrico spinge il vetro contro il vetro.

Riepilogo del compito per intervallo di voti

Classe 9-10

• Concentrati — utilizzare il microscopio in sicurezza e identificare le parti di una cellula vegetale, con il relativo vocabolario: obiettivo, oculare, tavolino, messa a fuoco macrometrica e micrometrica, preparazione a umido, coprioggetto, colorante, parete cellulare, cloroplasto, vacuolo, nucleo.
• Attività — prepara entrambi i vetrini, osserva ciascuno a 40×, 100× e 400× e salva le sei immagini. Disegna la vista a 400× colorata ed etichetta la parete cellulare, un cloroplasto, il vacuolo centrale e il nucleo. Rispondi alle domande guida: di che colore sono i cloroplasti e perché si possono vedere senza alcuna colorazione? Quale singola struttura ha rivelato la soluzione di Lugol? Perché le cellule sono disposte in file ordinate anziché ammassate a caso?

Undicesimo anno

• Concentrati — quantificare l'osservazione e collegare ciascuna struttura alla propria funzione.
• Attività — calcola l'ingrandimento totale di ciascun obiettivo con un oculare da 10×; usa il campo visivo (18 mm ÷ potenza dell'obiettivo) per stimare la lunghezza e la larghezza di una cellula e il diametro di un cloroplasto, e confronta con i valori accettati di 50–100 µm, 20–30 µm e 5 µm; spiega come la parete cellulare giustifichi sia la forma rettangolare sia la disposizione a mosaico; spiega perché i cloroplasti formano un bordo attorno a un centro apparentemente vuoto, nominando la struttura responsabile; e costruisci una tabella di confronto affiancato con le cellule buccali del laboratorio 024, elencando ogni struttura presente nell'una e assente nell'altra.

12ª classe / Livello universitario

• Concentrati — l'ottica che delimitava lo strumento, la chimica fisica del turgore e la selettività della colorazione.
• Attività — calcola il limite di Abbe d = λ / (2 × NA) per tutti e quattro gli obiettivi, compreso il 100×/1.25 escluso, e spiega cosa fa l'olio d'immersione all'apertura numerica e perché l'obiettivo è inutilizzabile senza di esso; distingui la risoluzione dal contrasto e usa la distinzione per spiegare perché i cloroplasti non richiedono alcuna colorazione mentre il nucleo sì; metti in relazione il vacuolo centrale con il potenziale idrico e la pressione di turgore, prevedendo cosa si vedrebbe dopo aver montato la foglia in una soluzione salina concentrata invece che in acqua e nominandone il risultato; rendi conto della chimica della soluzione di Lugol (formazione di triioduro, affinità per proteine e acido nucleico, e la separata reazione blu-nera con l'amido) e prevedi come la vista colorata differirebbe tra una foglia tenuta in piena luce e una tenuta al buio per 48 ore; e progetta un controllo che distingua una vera parete cellulare dal bordo di una bolla d'aria intrappolata.

Materiale essenziale di laboratorio

Strumenti

• Microscopio ottico composto con illuminatore a luce trasmessa e obiettivi Plan 4/0,10, Plan 10/0,25 e Plan 40/0,65 con oculare 10× — ingrandimento totale 40×, 100× e 400× (l'obiettivo a immersione in olio Plan 100/1,25 non viene utilizzato)
• 2 vetrini da microscopio
• 2 coprivetrini
• Pinzette (per la manipolazione delle foglie e dei coprioggetti)
• Contagocce
• Becher (50 mL), pieno d'acqua
• Carta assorbente

Prodotti

• EgeriaElodea) foglie in sospensione — una piccola foglia per vetrino
• Acqua (1 goccia, prima diapositiva)
• Soluzione di Lugol 2% (1 goccia, secondo vetrino)