025 – Obserwacja komórek roślinnych

Komórki roślinne były pierwszymi komórkami, jakie kiedykolwiek ktoś zobaczył. W 1665 roku Robert Hooke umieścił wyimek korka pod mikroskopem, zauważył, że jest podzielony na malutkie przegródki, i pożyczył słowo komórka z małych pomieszczeń klasztoru. To, co sprawiało, że korku nie dało się odczytać tam, gdzie tkanka zwierzęca była czytelna, to dokładnie to samo, co czyni dziś materiał roślinny lepszym okazem dydaktycznym: sztywna ściana celulozowa wokół każdej komórki wyznacza widoczną granicę, niezależnie od tego, czy komórka jest zafarbowana, czy nie.

Moczarka, wodny chwast, jest standardowym wyborem. Jego liść ma grubości zaledwie dwóch warstw komórek, więc cały liść można zamontować na płasko bez robienia przekrojów, a światło przechodzi przez niego bezpośrednio. Wewnątrz każdej komórki znajduje się kilkadziesiąt chloroplastów, gęsto wypełnionych chlorofilem, a zatem wystarczająco zielonych, by można je było zobaczyć bez żadnego barwienia, podczas gdy pojedyncza duża wakuola centralna zajmuje większą część objętości i dociska cytoplazmę oraz chloroplasty w postaci cienkiej warstwy do ściany. Prawie każda charakterystyczna cecha komórki roślinnej – ściana, chloroplaty, wakuola, uporządkowana geometria tkankowa – jest widoczna w jednym preparacie.

Jądro komórkowe stanowi wyjątek. Występuje w każdej komórce, ale jest prawie przezroczyste i łatwo gubi się wśród chloroplastów, dlatego w laboratorium używa się dwóch preparatów zamiast jednego. Pierwszy to zwykły preparat w kropli wody, pokazujący komórki w ich naturalnym stanie. Drugi otrzymuje kroplę płynu Lugola – jodu w jodku potasu – który wiąże się z białkami i kwasami nukleinowymi, barwiąc jądro komórkowe na wyraźny żółtobrązowy kolor. Włączysz oświetlacze światła przechodzącego, przejdziesz przez powiększenia 40×, 100× i 400×, używając śruby makrometrycznej tylko przy najniższym powiększeniu, zapiszesz obraz na każdym etapie i bezpośrednio porównasz oba preparaty. Czytane łącznie z instrukcją ćwiczenia laboratoryjnego 024 dotyczącego komórek zwierzęcych, te dwa preparaty sprawiają, że różnica strukturalna między dwoma królestwami staje się widoczna, a nie tylko zadeklarowana.

Cele edukacyjne

Zapoznanie się ze środowiskiem laboratoryjnym

• Przed rozpoczęciem zlokalizuj mikroskop i jego włącznik, trzy użyteczne obiektywy, pokrętła zgrubnego i dokładnego ostrości, stolik, zlewkę, pęsetę, szkiełka podstawowe, szkiełka nakrywkowe oraz bibułę wchłaniającą.

Działanie złożonego mikroskopu świetlnego

• Skonfiguruj oświetlenie przechodnie (jasnego pola) od dołu i wyjaśnij, dlaczego liść o grubości dwóch komórek jest dla niego niemal idealnym obiektem.
• Zmień obiektywy w porządku rosnącym — najpierw 4×, potem 10×, a następnie 40× — i oblicz całkowite powiększenie, jakie daje każdy z nich z okularem 10×.
• Używaj śruby zgrubnego ustawiania ostrości tylko przy najmniejszym powiększeniu, a śruby dokładnego przy większych, oraz wyjaśnij, dlaczego obiektyw immersyjny 100× został wyłączony z tego laboratorium.

Przygotowanie preparatu mokrego

• Przenieś mały liść pęsetą bez jego rozrywania lub zginania, zalej go płynem, opuść szkiełko nakrywkowe bez uwięzienia powietrza i odsącz nadmiar, aby szkiełko leżało płasko.
• Wyjaśnij, dlaczego liść musi cały czas pozostawać wilgotny oraz co dzieje się z komórkami, jeśli preparat wyschnie.

Rozpoznawanie struktur komórek roślinnych

• Zidentyfikuj ścianę komórkową, chloroplast, wakuolę centralną oraz – na wybarwionym preparacie – jądro komórkowe, i podaj funkcję każdego z nich.
• Opisz rozmieszczenie komórek w tkance i powiązaj tę geometrię przypominającą cegły z obecnością sztywnej ścianki.

Użycie barwnika biologicznego

• Porównaj bezpośrednio preparat w wodzie i preparat w płynie Lugola i wskaż precyzyjnie, jaką strukturę ujawnia barwnik, a które struktury były widoczne bez niego.

Obserwacja i rejestracja

• Zapisz obraz z mikroskopu przy każdym powiększeniu dla obu preparatów, opisz widok barwiony w powiększeniu 400× i oszacuj wymiary komórek na podstawie znanego pola widzenia zamiast zgadywać.

Protokół

Przygotowanie

1. Włącz mikroskop, naciskając przełącznik z przodu urządzenia. Włączysz w ten sposób iluminator, przez co światło przechodzące od dołu przez preparat, co jest idealne dla przezroczystych okazów.
2. Napełnij małą zlewkę całkowicie zimną wodą z kranu.
3. Połóż dwa czyste szkiełka na swoim stanowisku pracy.

Przygotowanie pierwszego slajdu

1. Za pomocą pęsety delikatnie umieść niewielki liść moczarki na pierwszym szkiełku.
2. Umieść kroplę wody na pierwszym szkiełku mikroskopowym.
3. Przykryj szkiełko nakrywkowe.
4. Delikatnie osusz nadmiar wody papierem chłonnym.

Przygotowanie drugiej zjeżdżalni

1. Używając pęsety, delikatnie umieść mały listek moczarki na drugim szkiełku.
2. Umieść kroplę płynu Lugola na drugim szkiełku.
3. Przykryj preparat szkiełkiem nakrywkowym.
4. Delikatnie osusz nadmiar wody papierem chłonnym.

Obserwacja pierwszego slajdu

1. Umieść preparat na stoliku mikroskopu.
2. Kliknij przycisk «Mikroskop» na tablecie, aby wyświetlić obraz z mikroskopu.
3. Obraz obserwowanego widoku mikroskopowego można zapisać, klikając przycisk « Zapisz obraz «, znajdujący się w lewym dolnym rogu sekcji « Mikroskop «.

Regulacja mikroskopu

1. Dostosuj powiększenie, dotykając obiektywów mikroskopu. Rozpocznij obserwację z powiększeniem 40x (czerwony obiektyw – oznaczony Plan 4/0.10).
2. Dostokuj ostrość za pomocą pokręteł zgrubnego ogniskowania znajdujących się po lewej i prawej stronie mikroskopu. Przy tym powiększeniu używaj wyłącznie pokręteł zgrubnych.
3. Stopniowo zwiększaj powiększenie z 40x do 100x (żółty obiektyw – oznaczony jako Plan 10/0.25), a następnie do 400x (niebieski obiektyw – oznaczony jako Plan 40/0.65), za każdym razem ostawiając obraz wyłącznie za pomocą pokrętła mikro. Przy tych powiększeniach pokrętło makro może spowodować uderzenie obiektywu w preparat.

Uwaga: Powiększenie 1000x (obiektyw biały – oznaczony jako Plan 100/1,25) wymaga zastosowania oleju między obiektywem a szkiełkiem nakrywkowym. Z tego powodu nie używamy tego obiektywu w naszym laboratorium.

Obserwacja drugiej zjeżdżalni

1. Zastąp pierwszy slajd drugim slajdem zawierającym liść moczarki i Lugola.
2. Obserwować w powiększeniu 400x (soczewka niebieska – oznaczona Plan 40/0,65), aby zidentyfikować jądro komórkowe, które powinno być zabarwione na żółto przez odczynnik Lugola.
3. Rejestrowanie obserwacji: Dokumentuj lub zapisuj ważne obserwacje.

Wyłączanie mikroskopu

1. Wyłącz mikroskop, naciskając przełącznik z przodu urządzenia.

Przewidywane wyniki

Zestaw obrazów referencyjnych oczekiwanych widoków mikroskopowych jest dostępny w ten dokument (PDF).

Jak wyglądają komórki i dlaczego

Jedyny fakt wyjaśniający niemal każdą obserwację to ściana komórkowa. Warstwa celulozy o grubości 0,1–1 µm otacza każdą komórkę, jest dostatecznie sztywna, aby oprzeć się odkształceniom, i jest zcementowana z sąsiadami. Komórki nie mogą zatem przybierać obłego kształtu, przesuwać się jedna obok drugiej ani nachodzić na siebie: zachowują stały prostokątny kształt i pokrywają liść w uporządkowanych szeregach. Moczarka komórki liścia mają długość z grubsza 50–100 µm i szerokość 20–30 µm, więc przy powiększeniu 400× tylko kilka z nich wypełnia pole widzenia – są na tyle duże, że przedmiotem badania staje się układ, a nie tylko pojedyncza komórka.

Ściana wyjaśnia również zjawisko wakuoli. Ponieważ ściana jest w stanie wytrzymać ciśnienie, komórka może swobodnie pobierać wodę w procesie osmotycznym, aż jej zawartość zacznie wywierać nacisk na ścianę, osiągając ciśnienie turgorowe rzędu kilkuset kilopaskali. Woda jest zatrzymywana w jednej dużej centralnej wakuoli, która w dojrzałej komórce zajmuje 80–90 % jej objętości i ściska cytoplazmę, chloroplasty oraz jądro komórkowe, tworząc cienką warstwę na obrzeżach. To właśnie dlatego chloroplasty wyglądają raczej jak obwódka niż wypełniony dysk, a środek każdej komórki wydaje się pusty. Komórka zwierzęca umieszczona w tej samej wodzie pęczniałaby i pękła, nie mając ściany, która mogłaby ją powstrzymać — jest to bezpośrednie nawiązanie do laboratorium 004 poświęconego osmozie.

Chloroplasty są widoczne bez żadnego barwnika, ponieważ już go zawierają. Chlorofil silnie absorbuje w zakresie czerwonym i niebieskim, a przepuszcza w zielonym, więc każdy chloroplast – soczewkowate organellum o szerokości około 5 µm – usuwa z wiązki światła tyle światła, że zaznacza się jako wyraźne zielone ciałko. Typowy Moczarka W komórce znajduje się kilkadziesiąt takich elementów. Są one również ruchliwe – powoli dryfują wraz z cytoplazmą, co stanowi jeden z nielicznych procesów życiowych, jakie można zaobserwować pod mikroskopem świetlnym.

Powiększenie, rozdzielczość i pole widzenia

Całkowite powiększenie to iloczyn powiększenia obiektywu i okularu: ze standardowym okularem 10×, M = M_obj. × M_oko daje 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× oraz 40 × 10 = 400×. To, co w ogóle można rozdzielić, określa natomiast apertura numeryczna podana obok mocy każdego obiektywu. Zgodnie z kryterium Abbego d = λ / (2 × NA); dla światła zielonego o długości fali λ = 550 nm obiektyw czerwony daje d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, żółty 1,1 µm, a niebieski 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Chloroplast o wielkości 5 µm jest zatem rozróżnialny przez wszystkie trzy obiektywy, co zgadza się z obserwacją, że zielone ziarnka są widoczne już przy powiększeniu 100×; wykluczony obiektyw olejowy 100× (NA 1,25) osiągnąłby rozdzielczość 0,22 µm, ale tylko przy użyciu oleju immersyjnego, który przenosi promienie pod dużym kątem przez szczelinę.

Pole widzenia zwęża się proporcjonalnie do mocy obiektywu. Dla okularu o liczbie pola 18 mm widoczna średnica wynosi 18 ÷ 4 = 4,5 mm przy czerwonym obiektywie, 1,8 mm przy żółtym oraz 18 ÷ 40 = 0,45 mm, czyli 450 µm, przy niebieskim. Daje to sposób na oszacowanie rozmiaru komórek bez użycia siatki pomiarowej: pole o powiększeniu 400× i szerokości 450 µm, przez które przechodzi wzdłuż około sześciu komórek, daje długość każdej komórki bliską 75 µm, co mieści się w oczekiwanym zakresie. Głębia ostrości spada jeszcze szybciej, od dziesiątek mikrometrów przy 40× do poniżej jednego mikrometra przy 400×, dlatego śruba zgrubna jest ograniczona do małych powiększeń – przy 400× obiektyw znajduje się ułamek milimetra nad szkiełkiem nakrywkowym, a ruch zgrubny powoduje uderzenie szkła o szkło.

Podsumowanie zadania według zakresu ocen

Klasy 9–10

• Skupienie — bezpieczna obsługa mikroskopu i identyfikacja części komórki roślinnej wraz z powiązanym słownictwem: obiektyw, okulary, stolik, śruba makrometryczna i mikrometryczna, preparat mokry, nakrywka, barwnik, ściana komórkowa, chloroplast, wakuola, jądro komórkowe.
• Aktywności — przygotuj oba preparaty, obejrzyj każdy w powiększeniu 40×, 100× i 400× oraz zapisz sześć obrazów. Narysuj obraz barwionego preparatu w powiększeniu 400× i podpisz ścianę komórkową, chloroplast, wakuolę centralną oraz jądro komórkowe. Odpowiedz na pytania pomocnicze: jakiego koloru są chloroplasty i dlaczego można je zobaczyć bez żadnego barwnika? Którą pojedynczą strukturę ujawnił płyn Lugola? Dlaczego komórki są ułożone w równe rzędy, a nie ułożone losowo w stosy?

Klasa 11

• Skupienie — ilościowe określenie obserwacji oraz powiązanie każdej struktury z jej funkcją.
• Aktywności — oblicz całkowite powiększenie każdego obiektywu z okularem 10×; użyj pola widzenia (18 mm ÷ moc obiektywu), aby oszacować długość i szerokość komórki oraz średnicę chloroplastu, i porównaj je z akceptowanymi wartościami 50–100 µm, 20–30 µm oraz 5 µm; wyjaśnij, w jaki sposób ściana komórkowa odpowiada zarówno za prostokątny kształt, jak i kafelkowy układ; wyjaśnij, dlaczego chloroplastom towarzyszy obwódka wokół pozornie pustego środka, podając nazwę struktury odpowiedzialnej za to; oraz zbuduj tabelę porównawczą obok siebie z komórkami nabłonka jamy ustnej z ćwiczenia laboratoryjnego 024, wypisując każdą strukturę obecną w jednej, a nieobecną w drugiej.

Klasa 12 / Poziom akademicki

• Skupienie — elementy optyczne, z których składa się przyrząd, fizykochemiczne właściwości turgoru oraz selektywność barwnika.
• Aktywności — oblicz granicę Abbe’go d = λ / (2 × NA) dla wszystkich czterech obiektywów, włączając w to wykluczony obiektyw 100×/1,25, i wyjaśnij, co olejek immersyjny robi z aplitudą numeryczną oraz dlaczego obiektyw jest bez niego bezużyteczny; rozróżnij rozdzielczość od kontrastu i użyj tego rozróżnienia, aby wyjaśnić, dlaczego chloroplastom nie jest potrzebne barwienie, podczas gdy jądru komórkowemu tak; powiąż wakuolę centralną z potencjałem wody i ciśnieniem turgorowym, przewidując, co byłoby widać po umieszczeniu liścia w stężonym roztworze soli zamiast w wodzie, i nazwij ten wynik; wyjaśnij chemię płynu Lugola (powstawanie trójjodku, powinnatwo do białek i kwasów nukleinowych oraz osobną reakcję niebiesko-czarną ze skrobią) i przewidź, jak widok barwienia różniłby się między liściem trzymanym w jasnym świetle a liściem trzymanym w ciemności przez 48 godzin; oraz zaprojektuj kontrolę, która pozwoliłaby odróżnić prawdziwą ścianę komórkową od obwódki uwięzionego pęcherzyka powietrza.

Podstawowe wyposażenie laboratorium

Instrumenty

• Złożony mikroskop świetlny z oświetlaczem światła przechodzącego i obiektywami Plan 4/0,10, Plan 10/0,25 oraz Plan 40/0,65 z okularem 10× – powiększenie całkowite 40×, 100× i 400× (obiektyw immersyjny Plan 100/1,25 nie jest używany)
• 2 szkiełka mikroskopowe
• 2 nakrywki
• Pęseta (do obsługi liści i szkiełek nakrywkowych)
• Kroplomierze
• Zlewka (50 mL), wypełniona wodą
• Papier chłonny

Produkty

• Moczarka (Moczarkaliście w zawieszeniu — po jednym małym liściu na szkiełku
• Woda (1 kropla, pierwszy slajd)
• Roztwór Lugola 2% (1 kropla, drugi preparat)