025 – Pozorování rostlinných buněk

Rostlinné buňky byly první buňky, které kdy kdokoli viděl. V roce 1665 umístil Robert Hooke tenký plátek korku pod mikroskop, zjistil, že je rozdělen na drobné přihrádky, a vypůjčil si slovo bunka z malých komůrek kláštera. To, čím byl kork čitelný, zatímco zvířecí tkáň nebyla, je přesně to, co z rostlinného materiálu činí lepší výukový vzorek i dnes: pevná celulózová stěna kolem každé buňky vytváří viditelnou hranici, ať je buňka obarvená, či nikoliv.

Elodea, vodní rostlina, je standardní volbou. Její list je tlustý pouhé dvě vrstvy buněk, takže celý list lze umístit na podložní sklíčko naplocho bez řezání a světlo jím prochází přímo skrz. Uvnitř každé buňky se nacházejí desítky chloroplastů, hustě naplněných chlorofylem, a jsou tedy dostatečně zelené, aby byly viditelné zcela bez barvení, zatímco jediná velká centrální vakuola zabírá většinu objemu a tlačí cytoplazmu a chlorofyl do tenké vrstvy proti stěně. Téměř každý charakteristický rys rostlinné buňky – stěna, chloroplasty, vakuola, uspořádaná geometrie pletiva – je viditelný v jediné preparaci.

Jádro je výjimkou. Je přítomno v každé buňce, ale je téměř průhledné a snadno se ztratí mezi chloroplasty, což je důvod, proč laboratoř používá dvě sklíčka namísto jednoho. První je čistý vodní preparát, který ukazuje buňky tak, jak jsou. Druhý obdrží kapku Lugolova roztoku – jodu v jodidu draselném – který se váže na bílkoviny a nukleové kyseliny a zbarvuje jádro do zřetelné žlutohnědé barvy. Zapnete prosvětlovací iluminátor, postupně projdete zvětšením 40×, 100× a 400×, přičemž hrubé zaostření použijete pouze při nejnižším zvětšení, v každém kroku uložíte snímek a obě sklíčka přímo porovnáte. V kombinaci s laboratorní prací 024 o zvířecích buňkách tato dvojice činí strukturální rozdíl mezi oběma říšemi viditelným, namísto toho, aby byl pouze konstatován.

Vzdělávací cíle

Seznámení s laboratorním prostředím

• Před začátkem najděte mikroskop a jeho vypínač, tři použitelné objektivy, knoflíky hrubého a jemného zaostření, stolek, kádinku, pinzetu, podložní sklíčka, krycí sklíčka a absorpční papír.

Provoz složeného světelného mikroskopu

• Nastavte prosvětlovací (světelpole) osvětlení zdola a vysvětlete, proč je list tlustý dvě buňky pro tento účel téměř ideálním vzorkem.
• Změňte objektivy v sestupném pořadí — 4×, poté 10× a 40× — a vypočítejte celkové zvětšení, které každý z nich poskytuje s 10× okulárem.
• Hrubé zaostření používejte pouze při nejmenším zvětšení a jemné zaostření při vyšších, a vysvětlete, proč je 100× imerzní objektiv z této laboratoře vyloučen.

Příprava vlhkého preparátu

• Pomocí pinzety přeneste malý lístek, aniž byste ho roztrhli nebo přeložili, zalijte ho tekutinou, opatrně položte krycí sklíčko, abyste nezachytili vzduch, a odsajte přebytečnou tekutinu tak, aby krycí sklíčko leželo naplocho.
• Vysvětlete, proč list musí zůstat neustále vlhký a co se stane s buňkami, pokud přípravek uschne.

Identifikace struktur rostlinných buněk

• Identifikujte buněčnou stěnu, chloroplasty, centrální vakuolu a – na obarveném sklíčku – jádro a u každého uveďte jeho funkci.
• Popište uspořádání buněk v ptkáni a dejte tuto cihlovou geometrii do souvislosti s přítomností pevné stěny.

Použití biologického barviva

• Porovnejte přímo vodní barvivo a Lugolovo barvivo a přesně uveďte, kterou strukturu barvivo odhaluje a které struktury byly viditelné již bez něj.

Pozorování a záznam

• Uložte snímek z mikroskopu při každém zvětšení pro oba preparáty, opatřete poznámkami obarvený pohled při zvětšení 400× a odhadněte rozměry buněk na základě známého zorného pole namísto odhadování.

Protokol

Příprava

1. Zapněte mikroskop stisknutím spínače na přední straně přístroje. Tím zapnete osvětlení, takže procházející světlo bude procházet vzorkem zespodu, což je ideální pro průhledné vzorky.
2. Naplň malou kádinku studenou vodou z kohoutku.
3. Položte dva čisté podložní sklíčka na pracovní plochu.

Příprava první snímku

1. Pomocí pinzety jemně položte malý list elodey na první podložní sklíčko.
2. Položte kapku vody na první sklíčko.
3. Přikryjte preparát krycím sklíčkem.
4. Opatrně odsajte přebytečnou vodu absorpčním papírem.

Příprava druhého snímku

1. Pomocí pinzety opatrně položte malý list vodní na druhé sklíčko.
2. Položte kapku Lugolova roztoku na druhé sklíčko.
3. Přikryjte preparát krycím sklíčkem.
4. Opatrně odsajte přebytečnou vodu absorpčním papírem.

Pozorování prvního snímku

1. Položte preparát na mikroskopickou stolek.
2. Klepněte na tlačítko «Mikroskop» na tabletu pro zobrazení snímku z mikroskopu.
3. Obrázek pozorovaného pohledu z mikroskopu můžete uložit kliknutím na tlačítko « Uložit obrázek «, které se nachází v levé dolní části sekce « Mikroskop «.

Nastavení mikroskopu

1. Zvětšení nastavte dotykem objektivů mikroskopu. Začněte pozorování při zvětšení 40x (červený objektiv – označený Plan 4/0.10).
2. Zaostřete pomocí hrubých zaostřovacích šroubů umístěných vlevo a vpravo na mikroskopu. Při tomto zvětšení používejte pouze hrubé šrouby.
3. Postupně zvyšujte zvětšení ze 40x na 100x (žlutý objektivem – označeným Plan 10/0.25) a poté na 400x (modrý objektivem – označeným Plan 40/0.65), přičemž pokaždé zaostřujte pouze pomocí knoflíku jemného zaostřování. Při těchto zvětšeních může hrubý posuv narazit objektiv do sklíčka.

Poznámka: Zvětšení 1000× (objektiv na bílém podstavci – označený Plan 100/1,25) vyžaduje použití oleje mezi objektivem a krycím sklíčkem. Proto tento objektiv v této laboratoři nepoužíváme.

Pozorování druhého snímku

1. Nahraďte první snímek druhým snímkem obsahujícím list elodey a Lugolův roztok.
2. Pozorujte při zvětšení 400x (modrý objektiv – označený Plan 40/0,65), abyste identifikovali buněčné jádro, které by mělo být obarveno Lugolovým roztokem do žluta.
3. Záznam pozorování: Zdokumentujte nebo zaznamenejte důležitá pozorování.

Vypínání mikroskopu

1. Vypněte mikroskop stisknutím vypínače na přední straně přístroje.

Předvídané výsledky

Sada referenčních snímků očekávaných pohledů mikroskopu je k dispozici v tento dokument (PDF).

Jak buňky vypadají a proč

Jediným faktem, který vysvětluje téměř každé pozorování, je buněčná stěna. Vrstva celulózy o tloušťce 0,1–1 µm obklopuje každou buňku, je dostatečně tuhá, aby odolala deformaci, a je cementována ke svým sousedům. Buňky se proto nemohou kulatit, klouzat jedna přes druhou ani se překrývat: drží si pevný obdélníkový tvar a pokrývají list v uspořádaných řadách. Elodea Buňky listů jsou dlouhé přibližně 50–100 µm a široké 20–30 µm, takže při zvětšení 400× zaplní zorné pole jen hrstka z nich – jsou natolik velké, že předmětem studia se stává jejich uspořádání, nikoli pouze jednotlivá buňka.

Stěna také vysvětluje funkci vakuoly. Jelikož stěna odolává tlaku, může buňka volně přijímat vodu osmoticky, dokud její obsah nevyvine tlak směrem ven na stěnu v podobě turgorového tlaku o hodnotě několika set kilopascalů. Voda je zadržována v jedné velké centrální vakuole, která v zralé buňce zabírá 80–90 % objemu a vytlačuje cytoplazmu, chloroplasty a jádro do tenké okrajové vrstvy. Proto se chloroplasty jeví spíše jako okraj než jako vyplněný disk a proto vypadá střed každé buňky prázdný. Živočišná buňka umístěná do stejné vody by nabobtnala a praskla, protože nemá stěnu, která by ji zadržela — přímá souvislost s laboratoří 004 o osmóze.

Chloroplasty jsou viditelné bez jakéhokoli barvení, protože již nějaké obsahují. Chlorofyl silně absorbuje v červené a modré oblasti a propouští zelenou, takže každý chloroplast – čočkovitá organela velká asi 5 µm – odebere ze svazku dostatek světla na to, aby se jevil jako zřetelné zelené tělísko. Typický Elodea bunka jich obsahuje několik desítek. Jsou také pohyblivé, pomalu se vznášejí v cytoplazmě, což je jeden z mála živých procesů pozorovatelných světelným mikroskopem.

Zvětšení, rozlišení a zorné pole

Celkové zvětšení je součinem objektivu a okuláru: se standardním 10× okulárem, M = M_předmět × M_oko dává 4 × 10 = 40×, 10 × 10 = 100× a 40 × 10 = 400×. To, co lze vůbec rozlišit, je naopak dáno numerickou aperturou vytištěnou za zvětšením každého objektivu. Podle Abbeova kritéria d = λ / (2 × NA); pro zelené světlo o λ = 550 nm dává červený objektiv d = 550 nm ÷ (2 × 0,10) = 2,8 µm, žlutý 1,1 µm a modrý 550 nm ÷ (2 × 0,65) = 0,42 µm. Chloroplast o velikosti 5 µm je tedy rozlišitelný všemi třemi, což odpovídá pozorování, že zelená zrnitost je viditelná od 100×; vynechaný 100× olejový objektiv (NA 1,25) by dosáhl 0,22 µm, ale pouze s imerzním olejem, který přenáší paprsky o velkém úhlu přes mezeru.

Zorné pole se zužuje úměrně k výkonu objektivu. U okuláru s číslem zorného pole 18 mm je viditelný průměr 18 ÷ 4 = 4,5 mm u červeného objektivu, 1,8 mm u žlutého a 18 ÷ 40 = 0,45 mm, neboli 450 µm, u modrého. To umožňuje odhadnout velikost čtverečků i bez mřížky: v zorném poli o velikosti 450 µm při zvětšení 400×, které pokrývá přibližně šest čtverečků za sebou, má každý čtvereček délku přibližně 75 µm, což spadá do očekávaného rozsahu. Hloubka ostrosti klesá ještě rychleji, z desítek mikrometrů při 40× na méně než jeden mikrometr při 400×, což je důvod, proč je hrubé nastavení omezeno na nízké zvětšení — při 400× se objektiv nachází o zlomek milimetru nad krycím sklíčkem a hrubý posun by způsobil náraz skla do skla.

Shrnutí úkolů podle věkové kategorie

9. až 10. ročník

• Fokus — bezpečné ovládání mikroskopu a identifikace částí rostlinné buňky spolu s příslušnou slovní zásobou: objektiv, okulár, stolek, makrošroub a mikrošroub, mokrý preparát, krycí sklíčko, barvivo, buněčná stěna, chloroplast, vakuola, jádro.
• Aktivity — připravte oba preparáty, každý pozorujte při zvětšení 40×, 100× a 400× a uložte šest snímků. Nakreslete pohled při zvětšení 400× po barvení a popište buněčnou stěnu, chloroplast, centrální vakuolu a jádro. Odpovězte na navádějící otázky: jakou barvu mají chloroplasty a proč je lze vidět bez jakéhokoli barviva? Kterou jedinou strukturu odhalil Lugolův roztok? Proč jsou buňky uspořádány v úhledných řadách namísto náhodného naskládání?

11. ročník

• Fokus — kvantifikace pozorování a propojení každé struktury s její funkcí.
• Aktivity — vypočítat celkové zvětšení každého objektivu při použití okuláru 10×; využijte zorné pole (18 mm ÷ zvětšení objektivu) k odhadu délky a šířky buňky a průměru chloroplastu a porovnejte tyto hodnoty s obecně uznávanými hodnotami 50–100 µm, 20–30 µm a 5 µm; vysvětlete, jak buněčná stěna určuje jak obdélníkový tvar, tak dlaždicové uspořádání; vysvětlete, proč chloroplasty tvoří okraj kolem zdánlivě prázdného středu, a pojmenujte strukturu, která za to odpovídá; a sestavte srovnávací tabulku s bukálními buňkami z laboratoře 024, ve které uvedete všechny struktury přítomné v jedné a chybějící v druhé.

12. ročník / Úroveň college

• Fokus — optika, která ohraničovala přístroj, fyzikální chemie turgoru a selektivita barviva.
• Aktivity — vypočítat Abbeho limit d = λ / (2 × NA) pro všechny čtyři objektivy, včetně vynechaného 100×/1,25, a vysvětlit, jak imerzní olej ovlivňuje numerickou aperturu a proč je tento objektiv bez něj nepoužitelný; rozlišit rozlišení od kontrastu a na základě tohoto rozlišení vysvětlit, proč chloroplasty nepotřebují barvivo, zatímco jádro ano; spojit centrální vakuolu s vodním potenciálem a turgorovým tlakem, předpovědět, co by bylo vidět po vložení listu do koncentrovaného solného roztoku namísto vody, a pojmenovat výsledek; vysvětlit chemické vlastnosti Lugolova roztoku (tvorba trijodidu, afinita k bílkovinám a nukleovým kyselinám a samostatná modročerná reakce se škrobem) a předpovědět, jak by se lišil zabarvený obraz listu uchovávaného na jasném světle od listu uchovávaného 48 hodin ve tmě; a navrhnout kontrolní experiment, který by umožnil odlišit skutečnou buněčnou stěnu od okraje uvězněné vzduchové bubliny.

Laboratorní potřeby

Nástroje

• Složený světelný mikroskop s průchozím osvětlením a objektivy Plan 4/0,10, Plan 10/0,25 a Plan 40/0,65 s okulárem 10× — celkové zvětšení 40×, 100× a 400× (objektiv Plan 100/1,25 pro práci v oleji se nepoužívá)
• 2 podložní sklíčka
• 2 krycí sklíčka
• Pinzeta (pro manipulaci s listy a krycími sklíčky)
• Kapátka
• Kápička (50 ml) naplněná vodou
• Absorpční papír

Produkty

• Vodní rostlinaElodea) listy v suspenzi — jeden malý list na podložním sklíčku
• Voda (1 kapka, první snímek)
• Lugolův roztok 2% (1 kapka, druhý sklíčko)